Określanie liczby chromosomów w komórkach

Określanie liczby chromosomów w komórkach

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Biologia komórki
Określanie liczby chromosomów
w komórkach eukariotycznych
Opracowali 21 kwietnia 2016: mgr inż. Majus Misiak, dr hab. Ewa Augustin
i prof. dr hab. inż. Andrzej Składanowski
WSTĘP
Uporządkowanie materiału genetycznego w komórkach eukariotycznych odbywa się
na wielu poziomach: od nici DNA nawiniętej wokół kompleksu białek histonowych do
chromosomów umiejscowionych w dyskretnych domenach w jądrze komórkowym. Ze
względu na strukturę chromatyny, obserwacje chromosomów mogą być prowadzone w
systematyczny sposób jedynie podczas mitozy. Stopniowa kondensacja chromatyny w
trakcie mitozy (a także mejozy) prowadzi do wyodrębnienia chromosomów jako
oddzielnych tworów morfologicznych.
W chromosomie mitotycznym można wyróżnić poszczególne regiony (ryc. 1): ramię
p (krótkie), q (długie), centromer oraz telomery. Ze względu na położenie centromeru,
chromosomy można podzielić na: metacentryczne (centromer w środku chromosomu),
submetacentryczne (w pobliżu środka), akrocentryczne (w pobliżu jednego z końców),
telocentryczne (na końcu chromosomu) oraz holocentryczne (takie w których wiele
centromerów rozciąga się na całej długości chromosomu). U człowieka występują
wyłącznie pierwsze trzy typy chromosomów. Chromosomy telocentryczne posiada m.in.
mysz domowa, a najrzadziej występujące chromosomy holocentryczne są obserwowane w
ważnym organizmie modelowym w badaniach biologicznych - nicieniu C. elegans.
Klasyczne techniki cytogenetyczne pozwalają nie tylko na rozróżnienie
chromosomów na podstawie rozmiaru i położenia centromeru, ale też na wybarwienie na
chromosomach ściśle zdefiniowanych rejonów, tzw. prążków. Każdy prążek na
chromosomie stanowi odzwierciedlenie funkcjonalnych i strukturalnych cech, które są
zachowane na odcinku na tyle długim, by mogły być zaobserwowane przy pomocy
mikroskopu. Najczęściej stosowane metody uwidaczniania prążków opierają się na
zależnych od sekwencji DNA różnicach w wiązaniu barwników w poszczególnych rejonach
chromosomów:
G – najważniejsza metoda prążkowania chromosomów, oparta na częściowym
nadtrawieniu enzymami proteolitycznymi (np. trypsyną), a następnie wyznakowaniu
barwnikiem Giemsy (mieszanina błękitu metylenowego, eozyny i azuru B), wiążącym
się zarówno z DNA, jak i białkami. Rejony bogate w pary AT silnie wiążą barwnik,
tworząc ciemne pasma, w przeciwieństwie do par bogatych w pary GC oraz
niektórych par mieszanych.
R – odwrócone barwienie Giemsy (ang. reverse), polegające na denaturacji DNA
poprzez ogrzewanie w kwaśnym roztworze, a następnie barwienie odczynnikiem
Giemsy. W tych warunkach preferowana jest denaturacja sekwencji AT, pozwalająca
na dobarwienie sekwencji GC. Prążki R stanowią zatem odwrotność prążków G.
Zastosowanie ostrzejszych warunków denaturacji może być zastosowane do
wybarwienia rejonów najbogatszych w pary GC (prążków T), z których około połowy
znajduje się w rejonach telomerowych.
1
1. Schemat przedstawiający wyidealizowany obraz kariotypu człowieka (ideogram) z
zaznaczonymi prążkami G-ciemnymi i G-jasnymi (rozdzielczość 850 prążków). Przykładowe chromosomy
meta-, submeta- i akrocentryczne zostały opisane, wraz z wyszczególnionymi elementami strukturalnymi.
Źródło: Alberts B. Molecular Biology of the Cell. Garland Science, 2014, zmodyfikowane.
Rycina
Q – barwienie z wykorzystaniem fluorescencyjnej pochodnej akrydyny - chinakryny
(ang. quinacrine). Związek ten interkaluje do DNA, przy czym fluorescencja po
związaniu w rejonach bogatych w pary AT jest silniejsza, niż w przypadku rejonów
bogatych w pary GC. Z tego względu prążki Q są uważane za równoważne prążkom
G. Inne barwniki fluorescencyjne preferujące pary AT (np. DAPI) zachowują się
analogicznie, jednak są mniej czułe na różnice sekwencji od chinakryny.
Fluorochromy wiążące się preferencyjnie do rejonów GC DNA (7-AAD, 7aminoaktynomycyna D) dają wzór zbliżony do prążków R.
Wybarwienie prążków G, R i Q może być przeprowadzone dla większości ssaków
oraz ptaków, jednak w przypadku innych eukariontów nie zawsze jest możliwe. U
człowieka pasma G-ciemne (często po prostu: pasma G) są ściślej upakowane, zawierają
geny późno replikowane oraz długie sekwencje rozproszone (LINE ang. long interspersed
nuclear elements). Pasma G-jasne (albo pasma R) zawierają geny wcześnie replikowane
(typu housekeeping), sekwencje Alu bogate w pary GC oraz wyspy CpG – rejony
chromosomów znajdujące się w pobliżu rejonów promotorowych ok. 40% wszystkich
genów. Obecność wysp CpG w pasmach G-jasnych jest zatem ściśle powiązane z
występowaniem genów w tych rejonach. Przykładowo, chromosom 22 bogaty w pasma R
charakteryzuje się większą gęstością genów od chromosomów 13, 18 i 21 bogatych w
pasma G.
Obserwacje chromosomów prowadzone są w celu określenia ich liczby w komórce
(tzw. ploidalności) oraz ich morfologii. Identyfikacja, za pomocą technik cytogenetycznych,
abnormalnej liczby chromosomów, delecji, inwersji, amplifikacji czy też translokacji
fragmentów DNA z jednego chromosomu do drugiego stanowi podstawę w diagnostyce
chorób genetycznych. Występowanie trzech kopii jednego chromosomu (trisomia), zwykle
na skutek nondysjunkcji chromosomów w trakcie mejozy, jest przyczyną licznych
schorzeń, z których do najczęściej występujących należą zespół Downa oraz zespół
Edwardsa (tab. 1). Kariotyp pacjenta stanowi ważne kryterium diagnostyczne w chorobach
nowotworowych, w szczególności w ostrej białaczce szpikowej (AML, ang. acute myeloid
leukemia) i ostrej białaczce limfoblastycznej (ALL ang. acute lymphoblastic leukemia).
Występowanie powtarzających się translokacji bądź
2
Tabela 1. Przykłady anomalii chromosomalnych u człowieka
Anomalia
Charakterystyka
genetyczna
Objawy kliniczne
Zespół Turnera
45,X
Niski wzrost, szczątkowe jajniki i słabo
rozwinięte sutki, dziecięcy narząd rodny
Zespół Klinefeltera
47,XXY
Ginekomastia, małe jądra
Trisomia X
47,XXX
Dwa ciałka Barra, prawie normalny
fenotyp żeński ze słabo wykształconymi
drugorzędowymi cechami płciowymi
Zespół Downa
47,XX,+21
47,XY,+21
Fałd mongolski (epicantus), wysunięty
język, hipotonia (stan zmniejszonego
napięcia mięśniowego), upośledzenie
umysłowe
47,XX,+18
Liczne wady wrodzone, upośledzenie
umysłowe
Zespół Edwardsa
47,XY,+18
Zespół Pradera-Williego
Częściowa delecja ramienia
q chr. 15
Niedorozwój umysłowy, hipotonia,
hipogonadyzm, otyłość
Zespół Patau (trisomia D)
47,XX,+13
Niedorozwój umysłowy, wady
ośrodkowego układu nerwowego i
narządu wzroku
47,XY,+13
Translokacyjny zespół Downa
Translokacje między chr. 15,
22 a chr. 21
Objawy kliniczne podobne do trisomii
chr. 21
Zespół Filadelfia
t(9;22)(q34:q11)
Większość przypadków przewlekłej
białaczki szpikowej (CML ang. chronic
myeloid leukemia), występuje w ostrych
białaczkach limfoblastycznych
(Translokacja fragmentu
ramienia q chr. 9 do chr. 22)
Zespół Cri du Chat
("koci krzyk")
Częściowa delecja ramienia
p chr. 5
Niedorozwój umysłowy,
nieprawidłowości budowy twarzy
utraty części chromosomu pozwalają na prognozę przebiegu choroby oraz wybór terapii.
przeciwnowotworowej.
W diagnozie anemii Fanconiego wykorzystywana jest niestabilność genetyczna
pochodzących od pacjenta komórek i ich nadwrażliwość na związki uszkadzające materiał
genetyczny. Skutkuje to powstawaniem skomplikowanych aberracji w chromosomach
metafazowych (ryc. 2c). Z kolei zespół Blooma cechuje zwiększona wymiana fragmentów
DNA między siostrzanymi chromatydami.
Badanie powstających aberracji chromosomalnych jest przydatne w określaniu
mechanizmów działania leków przeciwnowotworowych. Wiele takich leków powoduje
zatrzymanie progresji cyklu komórkowego w późnych fazach, głównie między końcem fazy
S i wejściem do mitozy, ze względu na uszkodzenia DNA. Za pomocą inhibitorów kinaz
białkowych (staurosporyna, kofeina) lub inhibitor fosfataz (kwas okadaikowy) komórki
zablokowane w np. fazie G2 można zmusić do wejścia w fazę podziału przez wywołanie
tzw. przedwczesnej kondensacji chromatyny. Badania efektu przedwczesnej kondensacji
chromatyny służą celom poznawczym (poznanie regulacji przejścia między fazami G2 i M).
3
Rycina 2. Po lewej: chromosom wyizolowany w stadium metafazy, zdjęcie wykonane przy pomocy
skaningowej mikroskopii elektronowej. W środku: chromosomy metafazowe pochodzące z komórek ostrej
białaczki szpikowej HL-60, wybarwionych Giemsą i sfotografowanych w świetle widzialnym (góra),
wybarwionych fluorescencyjnie DAPI i sfotografowanych przy wzbudzeniu UV (dół). Zarówno liczba, jak i
morfologia chromosomów w ludzkich komórkach nowotworowych często znacznie odbiega od prawidłowej.
Preparaty zostały wykonane przez studentów. Po prawej: Aberracje chromosomalne obserwowane w
komórkach pochodzących od pacjentów z anemią Fanconiego, które były traktowane związkiem
sieciującym DNA (np. mitomycyną C). (A) przerwy; (B) pęknięcia; (C) utrata fragmentu chromosomu; (D i
E) chromosomy radialne; (F) złożone figury; (G) chromosom dicentryczny. Źródła: Alberts B. Molecular
Biology of the Cell. Garland Science, 2014; http://atlasgeneticsoncology.org/Kprones/FAID10001.html
Wreszcie, porównanie wzorów prążków między różnymi gatunkami jest użyteczne w
wykrywaniu pokrewieństwa ewolucyjnego, oraz zmian które spowodowały rozdzielenie się
gatunków. Przykładowo, wzór ten u człowieka i szympansa jest niemal identyczny, za
wyjątkiem chromosomu 2 u człowieka, który powstał w wyniku fuzji dwóch chromosomów
małpich (tab. 2).
W celu przeprowadzenia badań cytogenetycznych niezbędne jest wyizolowanie
komórek w trakcie mitozy, kiedy chromosomy są możliwe do wyodrębnienia. Ze względów
praktycznych zazwyczaj wykorzystywane są limfocyty wyizolowane z krwi obwodowej, a
następnie stymulowane do proliferacji. Częstość występowania mitoz w populacji komórek
rosnących niesynchronicznie jest stosunkowo niewielka, ze względu na krótki czas trwania
mitozy w porównaniu do pozostałych faz cyklu komórkowego. Liczba mitoz zależy od
rodzaju komórek oraz warunków eksperymentalnych, jednak nawet dla szybko dzielących
się nowotworów w hodowli komórkowej rzadko wykracza ponad 3%. Z tego względu przy
wykonywaniu preparatów chromosomowych stosuje się wzbogacenie populacji w komórki
mitotyczne jedną z dwóch metod:
1. Synchronizacja komórek w fazie G1 cyklu komórkowego, a następnie stymulacja do
wejścia w fazę S i G2 cyklu. Preparaty są wykonywane po kilku godzinach od
rozpoczęcia cyklu, kiedy większość komórek znajdzie się w profazie / prometafazie.
2. Zatrzymanie komórek w metafazie za pomocą związków chemicznych hamujących
polimeryzację tubuliny (tzw. antymitotyków) i poprzez to blokujących tworzenie
wrzeciona mitotycznego. Najczęściej stosowane są: nokodazol, kolcemid lub
alkaloidy Vinca (w tym stosowany klinicznie lek przeciwnowotworowy winkrystyna).
4
Tabela 2. Liczba chromosomów u wybranych gatunków organizmów.
Gatunek
Liczba chromosomów (2N)
Mundżak indyjski (Muntiacus muntjak)
6 (samica), 7 (samiec)
Muszka owocówka (Drosophila melanogaster)
8
Rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana)
10
Nicień (Caenorhabditis elegans)
11 (samiec), 12 (hermafrodyta)
Ogórek (Cucumis sativus)
14
Drożdże piekarnicze (Saccharomyces cerevisiae)
16
Chomik chiński (Cricetulus griseus)
22
Kot domowy (Felis catus)
38
Mysz (Mus musculus)
40
Szczur (Rattus norvegicus)
42
Mundżak chiński (Muntiacus reevesi)
46
Tytoń (Nicotiana tabacum)
48
Koń (Equus ferus caballus)
64
Pies domowy (Canis familiaris)
78
Rak szlachetny (Astacus astacus)
176; różne doniesienia
Rezus (Macacca mulatta)
42
Człowiek (Homo sapiens)
46
Szympans (Pan troglodytes)
48
Orangutan (Pongo pygmaeus)
48
Metoda oparta o zatrzymanie cyklu komórkowego w metafazie jest, ze względu na
prostotę wykonania, powszechnie stosowana w określaniu liczby i typu chromosomów
oraz aberracji powstających pod wpływem związków uszkadzających DNA. Szybko
postępująca kondensacja chromosomów w trakcie mitozy (patrz ryc. 3) sprawia, że
metoda ta daje jednak mniejszą rozdzielczość. Zbyt długa ekspozycja na czynnik
antymitotyczny prowadzi do nadmiernego skrócania chromosomów i łączenia się
sąsiadujących prążków; w przypadku niektórych typów komórek może też doprowadzić do
ukończenia mitozy. Wysokorozdzielcze metody cytogenetyczne oparte na analizie
chromosomów wyizolowanych w trakcie profazy pozwalają na rozróżnienie 850 (i więcej)
prążków G w haploidalnym kariotypie i tym samym na wykrycie mikrodelecji, pęknięć i
niewielkich przearanżowań w strukturze chromosomu. W praktyce technika ta umożliwia
wykrycie delecji rzędu 5-10 Mpz (milionów par zasad). Diagnostyka mniejszych zmian
wymaga zastosowania innych technik, np. fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (ang. FISH,
fluorescence in situ hybridization).
5
Rycina 3. Stopniowe skracanie i kondensacja chromosomów w kolejnych etapach mitozy na przykładzie
chromosomu 7. Prążki zostały uwidocznione przy zastosowaniu barwnika Giemsy.Źródło: Bangs C.D.,
Donlon Timothy A. Metaphase Chromosome Preparation from Cultured Peripheral Blood Cells. Current
Protocols in Human Genetics (2005), 4.1.1-4.1.19.
Na typową procedurę przygotowania tzw. wymazów chromosomalnych (ang. chromosome
spreads) składają się:
1. Spęcznienie komórek w roztworze hipotonicznym (zwykle 75 mM KCl).
2. Utrwalenie i dehydratacja chromatyny oraz rozerwanie błon lipidowych przy pomocy
np. roztworu Carnoy'a.
3. Przygotowanie rozmazu na szkiełku mikroskopowym.
4. Wizualizacja chromosomów po ich wybarwieniu barwnikami fluorescencyjnymi
(chinakryna, DAPI, 7-AAD) lub za pomocą barwnika Giemsa
LITERATURA
Bangs, C.D., i wsp. Metaphase Chromosome Preparation from Cultured Peripheral Blood
Cells. Current Protocols in Human Genetics (2005), 4.1.1-4.1.19.
Bickmore, W.A. Karyotype Analysis and Chromosome Banding. Encyclopedia of Life
Sciences (2001).
Melters, D.P. i wsp. Holocentric chromosomes: convergent evolution, meiotic adaptations,
and genomic analysis. Chromosome Research (2012), 20(5):579-93.
6
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
Roztwory:




75 mM KCl w wodzie destylowanej
Utrwalacz Carnoy'a: świeżo sporządzona mieszanina 1:3 obj. (v/v) lodowatego
kwasu octowego i metanolu
Barwnik Giemsa, rozcieńczony 1:20 w wodzie destylowanej
Roztwór soli fizjologicznej PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4,1.5
mM KH2PO4, pH 7.4)
Sprzęt:




Probówki wirówkowe
Pipety automatyczne 200 l, 1000 l i 5 ml
Szkiełka mikroskopowe
Mikroskop świetlny
Wykonanie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Przygotować zawiesinę komórek (ok. 1 mln. komórek na próbkę).
Do osadu komórek dodać 5 ml PBS
Delikatnie rozpipetować do uzyskania jednolitej zawiesiny
Odwirować przez 5 min (1000 obr./min.)
Delikatnie wylać nadsącz znad komórek
Rozpipetować osad komórek w pozostałości nadsączu
Dodać 4 ml 75 mMKCl i pozostawić na 10 min. w temperaturze pokojowej
Odwirować przez 5 min (1000 obr./min.)
9. Zawiesić komórki w pozostałości nadsączu
10. Dodawać po kropli 4 ml utrwalacza Carnoy'a powoli mieszając zawiesinę na
wytrząsarce, odstawić na 15 min. w temperaturze pokojowej.
11. Odwirować przez 5 min (1000 obr./min.)
12. Powtórzyć kroki 8-10 dwukrotnie
13. Po ostatnim wirowaniu zawiesić komórki w pozostałości utrwalacza (ok. 100-200
l).
14. Nakropić zawiesinę komórek (1-2 krople na szkiełko) na szkiełko mikroskopowe z
wysokości ok. 30-50 cm za pomocą pipety automatycznej.
15. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu (~10 minut)
16. Zalać preparat roztworem barwnika Giemsa (1:20) na 5-7 min.
17. Przepłukać wodą destylowaną, na kilka sekund w 90% etanolu.
18. Wysuszyć na powietrzu i obserwować pod powiększeniem 400-1000x.
Przygotować dodatkowo jeden preparat chromosomalny na każdą grupę i nie barwić.
Opisać preparat (z numerem grupy i datą ćwiczenia) i oddać prowadzącemu ćwiczenie.
Określić liczbę chromosomów w badanych komórkach. Zaobserwować różnicę w kształcie
i wielkości chromosomów.
7
SPRAWOZDANIE
Podać wyznaczoną średnią ilość chromosomów w otrzymanych do badania komórkach
(zliczonych z minimum trzech różnych metafaz). Na podstawie załączonych zdjęć
preparatów wykonanych przy pomocy prowadzącego, opisać wygląd wyizolowanych
chromosomów. Określić, na podstawie liczby chromosomów oraz ich morfologii, z jakich
komórek (mysich czy ludzkich) pochodzą te chromosomy. Odnaleźć w literaturze komórki,
z których został wykonany preparat, posługując się odpowiednimi wyszukiwarkami
(ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/, google.scholar.com), lub katalogiem linii komórkowych
(atcc.org). Porównać otrzymane wyniki z literaturowymi i omówić ewentualne rozbieżności.
8