Przetwarzanie RNA - Postępy Biochemii

Przetwarzanie RNA — niezwykły mechanizm powstawania
nowych klas niekodujących RNA z funkcjonalnych RNA
STRESZCZENIE
N
iekodujące cząsteczki RNA uczestniczą w procesach regulacji praktycznie na wszystkich etapach transmisji informacji genetycznej: od DNA do białka. Szczególnie spektakularne jest zaangażowanie pewnych niekodujących cząsteczek RNA w mechanizmy prowadzące do włączania lub wyłączania ekspresji poszczególnych genów. Oprócz znanych i
dobrze rozumianych funkcji pełnionych przez RNA, odkrywamy ostatnio nowe aspekty i
możliwości regulacji procesów komórkowych. Takim przykładem jest przetwarzanie RNA,
czyli powstawanie krótkich RNA z komórkowych niekodujących RNA. Tak jak źródła powstawania tych krótkich RNA mogą być różne, tak i funkcje przez nie pełnione bywają odmienne. W niniejszym artykule przeglądowym przedstawiamy możliwości regulacji ekspresji genów poprzez cząsteczki „przetworzonego RNA”.
WPROWADZENIE
Rozwój technik z zastosowaniem głębokiego sekwencjonowania i wysokowydajnych analiz doprowadził do odkrycia szerokiej gamy niekodujących cząs-teczek RNA (ncRNA). Cząsteczki te pełnią kluczowe role w procesach regulacji
ekspresji genów na wielu etapach, np.: modulują strukturę chromatyny, regulują bezpośrednio transkrypcję bądź translację, uczestniczą w składaniu (ang. splicing) i redagowaniu (ang. editing) RNA. W ostatnich latach pojawiły się doniesienia, że komórkowe niekodujące RNA mogą w określonych warunkach stać
się prekursorami krótszych RNA [1]. Tego typu obróbkę RNA, obejmującą cięcie
stabilnych niekodujących („rodzicielskich”) RNA proponujemy w przedstawionej pracy nazywać „przetwarzaniem RNA”.
Pierwsze dowody na istnienie funkcjonalnych fragmentów pochodzących z
komórkowych RNA pojawiły się już w 2008 roku, kiedy Ender wraz ze współpracownikami potwierdził obecność fragmentu pochodzącego ze snoRNA, który działa jak miRNA [2]. Od czasu tego odkrycia opublikowano wyniki wielu
badań, które potwierdzały istnienie fragmentów RNA pełniących specyficzne
funkcje, niezależne od funkcji pełnionych przez rodzicielskie RNA. Podczas gdy
spora część krótkich RNA jest znajdywana w niewielkich ilościach i stanowi produkt degradacji RNA, tak fragmenty RNA pełniące własne funkcje znajdowane
są w ilościach często przekraczających ilości miRNA [3-5]. Co więcej, tego typu
potranskrypcyjne “przetwarzanie” RNA może być przyrównane do alternatywnego składania pre-mRNA. Powstające fragmenty mają zawsze identyczne sekwencje z rodzicielskimi RNA oraz powstają zawsze w podobnych warunkach,
np. w określonym stadium rozwoju lub różnicowania komórki, względnie wykazują specyficzność tkankową albo podlegają modulacji przez biotyczne lub
abiotyczne czynniki środowiskowe. Te i inne odkrycia utwierdzają nas w przekonaniu, że fragmentacja RNA czy też dalsze dojrzewanie funkcjonalnych RNA
są jednym z naturalnych mechanizmów życia komórkowego.
Marta Kasprzyk
Anna M. Mleczko
Piotr Celichowski
Kamilla Bąkowska-Żywicka
Zakład Biologii RNA, Instytut Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk, Poznań
Zakład Biologii RNA, Instytut Chemii
Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk, ul.
Noskowskiego 12/14, 61-704 Poznań; tel. (061)
8528503, e-mail: [email protected]

Artykuł otrzymano 30 maja 2014 r.
Artykuł zaakceptowano 15 lipca 2014 r.
Słowa kluczowe: niekodujące RNA, przetwarzanie RNA, sdRNA, tRF
Wykaz stosowanych skrótów: Ago — białko
Argonaute; HIV — ludzki wirus niedoboru odporności; HERV — ludzki retrowirus endogenny; ncRNA — niekodujący RNA; miRNA —
mikroRNA; piRNA — małe RNA oddziałujące
z białkami Piwi; PBS — miejsce wiążące starter;
RISC — kompleks wyciszający, indukowany
przez RNA; RNAi — interferencja RNA; rRNA
— rybosomalny RNA; sdRNA — krótki RNA
pochodzący ze snoRNA; siRNA — mały interferujący RNA; snRNA — mały jądrowy RNA;
snoRNA — mały jąderkowy RNA; svRNA —
mały RNA powstający z vRNA; tRF — krótki
RNA pochodzący z tRNA; tRNA — transportujący RNA; U2OS — linie komórkowe mięsaka kościopochodnego ssaków; usRNA — niezwykle małe RNA; vRNA — ang. vault RNA
Podziękowania: Praca powstała podczas
realizacji projektu badawczego nr POMOST/2011-4/1 przyznanego przez Fundację
na rzecz Nauki Polskiej.
W niniejszym artykule przeglądowym chcieliśmy przybliżyć obecny stan
wiedzy na temat nowych klas krótkich RNA, powstałych z innych komórkowych RNA. Ten stosunkowo nowy temat jest obecnie obiektem intensywnych
badań, których wyniki w krótkim czasie wykazały istnienie wielu nieznanych
dotąd mechanizmów regulacyjnych istotne funkcje komórek, jak odpowiedź na
stres, regulacja metabolizmu czy cyklu komórkowego.
KRÓTKIE RNA POWSTAJĄCE Z tRNA
Cząsteczki tRNA, czyli transportującego RNA odgrywają w komórce bardzo
ważną rolę — stanowią łączniki między sekwencją mRNA a powstającym w
czasie translacji białkiem, przenosząc odpowiednie aminokwasy z cytosolu do
rybosomu. Występowanie krótkich RNA pochodzących z cząsteczek tRNA wykazano u wielu organizmów, zarówno prokariontów, jak i eukariontów, w tym
Postępy Biochemii 60 (3) 2014
295
także u ludzi [6]. Warto wspomnieć, że cząsteczki tRNA są
bardzo zachowawcze ewolucyjnie, co może sugerować, że
powstałe z nich fragmenty mogą reprezentować najbardziej
prymitywne ścieżki funkcjonowania krótkich RNA.
PODZIAŁ NIEKODUJĄCYCH RNA
POWSTAJĄCYCH Z tRNA
Wiele grup badawczych podjęło się identyfikacji
ncRNA pochodzących z tRNA, ale w źródłach literaturowych niejednokrotnie brak ujednoliconego nazewnictwa.
Przykładowo u Gardia lamblia te małe RNA ukazują się pod
nazwą sitRNA (ang. stress-induced tRNA-derived RNA) czyli indukowane stresem RNA pochodzące z tRNA [7]. Ich
powstawanie jest tam związane z procesem tworzenia cyst.
Inna pojawiająca się nazwa to tiRNA (ang. tRNA-derived
stress-induced RNA). Odnosi się ona do fragmentów tRNA
powstałych w wyniku działania angiogeniny w komórkach
ssaków [8]. Określenia: połówki tRNA (ang. tRNA halves)
[9] czy tsRNA (ang. tRNA-derived small RNA) [10] używane
są zamiennie, a ich geneza związana jest z enzymatycznym
cięciem tRNA w pętli antykodonowej. Z kolei tRF (ang.
tRNA-derived RNA fragments) czyli w dosłownym tłumaczeniu fragmenty RNA pochodzące z tRNA oznaczają sekwencje stosunkowo krótkie [4]. Pojawia się także określenie
ubcRNA (ang. urinary bladder carcinoma RNAs) oznaczające
fragmenty tRNA znalezione u pacjentów z nowotworami
pęcherza moczowego [11].
Obecnie ncRNA pochodzące z tRNA dzieli się powszechnie na dwie grupy, w zależności od długości sekwencji
[12] (warto dodać, że długość tRNA wynosi 73-93 nt). Do
pierwszej grupy należą tak zwane połówki tRNA (tsRNA) o
długości 36-46 nt (Ryc. 1A). Powstają one poprzez enzymatyczne cięcie dojrzałego tRNA w pętli antykodonowej, co
skutkuje powstaniem dwóch fragmentów [9]. Zostały one
opisane u takich organizmów jak bakterie [13], gdzie są generowane przez endonukleazę antykodonową; u drożdży
w wyniku działania Rny1p [14] oraz u ludzi poprzez angiogeninę [15]. Indukcja powstawania połówek tRNA ma miejsce głównie pod wpływem warunków stresowych: żywieniowych, biologicznych czy fizykochemicznych, ale okazuje
się, że pojawiają się one również w warunkach bezstresowych [13,14]. Druga grupa ncRNA pochodzących z tRNA
zawiera sekwencje ok. 13-30 nt, określane jako tRF (Ryc.
1B). tRF mogą być klasyfikowane według regionu tRNA, z
którego pochodzą. Można wyróżnić dwie takie grupy [12].
Pierwsza zawiera tRF pochodzące z dojrzałych cząsteczek
tRNA, z końca 5’ lub 3’, które określane są odpowiednio:
5’ tRF lub 3’ tRF (Ryc. 1B). Tego typu 3’ tRF zawierają sekwencję CCA i dla uściślenia nazywane są niekiedy 3’ CCA
tRF. W drugiej grupie znajdują się fragmenty pochodzące z
końca 5’ lub 3’ niedojrzałego tRNA (Ryc. 1C). W tym przypadku 5’ tRF zawierają sekwencję liderową, a 3’ tRF posiadają charakterystyczny trakt urydynowy powstający w
konsekwencji wyłączenia transkrypcji polimerazy III i nazywane są niekiedy 3’ U tRF [18].
Rycina 1. Podział ncRNA pochodzących z tRNA i możliwe funkcje. Górna część ryciny: (A) tsRNA powstałe w wyniku cięcia dojrzałego tRNA w pętli antykodonowej:
5’ tsRNA (niebieski), 3’ tsRNA (zielony). (B) tRF pochodzące z dojrzałego tRNA: 5’ tRF (niebieski), 3’CCA tRF (zielony). (C) tRF pochodzące z niedojrzałego tRNA: 5’ tRF
(niebieski), 3’ U tRF (zielony). Potencjalne cele, na które skierowane są tRF przedstawione są w dolnej części ryciny.
296
www.postepybiochemii.pl
Tabela 1. Wykaz organizmów, u których stwierdzono występowanie małych ncRNA pochodzących z tRNA wraz z podziałem na tsRNA i tRF.
Organizm
Escherichia coli
Tetrahymena
thermophila
Streptomyces coelicolor
Aspergillus fumigatus
Saccharomyces
cerevisiae
Gardia lamblia
Arabidopsis thaliana
Cucurbita maxima
Homo sapiens
Drosophila
melanogaster
Trypansoma cruzi
Haloferax volcanii
Długość
Klasa
34-76 nt
1-33 nt
30-35 nt
18-22 nt
30-35 nt
36-39 nt
tsRNA
tRF
tsRNA
tRF
tsRNA
tsRNA
35-50 nt
tsRNA
tRF
44-49 nt
19 nt
30-40 nt
48-55 nt
31-68 nt
19 nt
17-26 nt
19-25 nt
30-39 nt
30-45 nt
31-38 nt
tRF
tRF
tsRNA
tsRNA
tsRNA
tRF
tRF
tRF
tsRNA
tsRNA
tsRNA
16-29 nt
20-35 nt
33 nt
26 nt
Warunki powstawania
Piśmiennictwo
infekcja fagiem T4
[13,19-20]
głód aminokwasowy, hipotermia
[9,21-22]
proces dyferencjacji komórek
konidiogeneza
faza stacjonarna, stres oksydacyjny, hiper- i hipotermia, warunki
anaerobowe, niskie lub wysokie pH, brak azotu, metioniny
lub źródła węgla, szok hipo- lub hiperosmotyczny
tworzenie cyst
[23]
[24]
głód fosforanowy, stres oksydacyjny
[25,26]
sok floemowy
[27,28]
stres oksydacyjny, UV, hiperosmotyczny, szok cieplny,
hipotermia, hipoksja, komórki rakowe
[4,8,10,25,29-34]
tRF
niektóre warunki stresowe, procesy rozwojowe
[35,36]
tsRNA
stres żywieniowy
[12]
tRF
pH zasadowe
[37]
W Tabeli 1 [19-37] przedstawiono listę organizmów, u
których wykazano występowanie fragmentów tRNA wraz
z podziałem na tsRNA oraz tRF. Jedne z pierwszych wzmianek dotyczących małych RNA powstałych z tRNA pojawiły
się już w 1971 roku, gdzie zaobserwowano endonukleolityczne cięcie tRNA u Escherichia coli w odpowiedzi na infekcję fagiem T4 [19]. Wtedy jednak fragmenty te nie zostały
uznane za znaczące w procesie regulacji ekspresji genów,
jedynie za produkty degradacji tRNA.
MECHANIZM POWSTAWANIA FRAGMENTÓW tRNA
Z uwagi na istotną funkcję biologiczną tRNA, jego właściwe fałdowanie jak i stabilność jest ściśle kontrolowana
m.in. przez liczne modyfikacje post-transkrypcyjne. Istnieje także wiele ścieżek rozpoznawania i degradowania niewłaściwie sfałdowanych tRNA [38]. Wadliwe cząsteczki
tRNA ulegają poliadenylacji, co kieruje je na ścieżkę degradacji [39]. tRF (jak i tsRNA) powstają w odmienny sposób,
co oznacza, że nie są produktami losowej degradacji. Jak
wcześniej wspomniano fragmenty tRNA powstają poprzez
enzymatyczne cięcie w specyficznych regionach dojrzałego
lub niedojrzałego tRNA. Z niedojrzałego tRNA (pre-tRNA)
mogą powstać: 3’U tRF lub 5’ tRF (Ryc. 1C). 3’U tRF powstają poprzez cięcie RNazą Z, ale nie wyklucza się istnienia innych, niepoznanych dotąd RNaz. 5’tRF składające się
z części liderowej oraz fragmentu eksonu tRNA powstają na
drodze cięcia przez endonukleazy oraz składania. Warto w
tym miejscu zauważyć, że wyniki wielu badań wskazują, że
3’U tRF są zlokalizowane głównie w cytoplazmie. Zważywszy na fakt, że powstają one z niedojrzałego tRNA, który
obecny jest w jądrze komórkowym, proponowane są 2 wyPostępy Biochemii 60 (2) 2014
[3,14,25]
[7]
jaśnienia: albo 3’U tRF są transportowane z jądra poprzez
nieznany mechanizm albo pre-tRNA w jakiś sposób unika
kontroli jakości w jądrze komórkowym i jest przetwarzany
przez cytoplazmatyczne 3’ RNazy. Na potwierdzenie tej
drugiej tezy, w ludzkich rakowych liniach komórkowych
wykazano, że niektóre pre-tRNA mogą być transportowane z jądra do cytoplazmy i cięte przez endonukleazę tRNA
ELAC2, homolog RNazy Z [4].
Z kolei z dojrzałych cząsteczek tRNA mogą powstać
cztery rodzaje fragmentów tRNA. Wskutek cięcia w pętli D
przez endonukleazę Dicer lub niepoznane dotąd RNazy powstają fragmenty 5’ tRF. Istnieje również prawdopodobieństwo, że 5’ tRF mogą także wywodzić się z połówki 5’ tRNA
poprzez działanie 3’ egzonukleazy. Fragmenty 3’CCA tRF
powstają w wyniku przecięcia pętli T dojrzałego tRNA, a
enzymy biorące udział w tym procesie to m.in. Dicer, angionenina lub nieznane RNazy. W tym przypadku także
nie można wykluczyć prawdopodobieństwa powstawania
3’CCA tRF z połówki 3’ tRNA przy udziale egzonukleaz.
POTENCJALNE FUNKCJE FRAGMENTÓW tRNA
U wyższych eukariontów niemal cała informacja genetyczna jest transkrybowana na RNA, ale tylko pewna część
finalnie ulega translacji [40]. Nasuwa to pewną refleksję dotyczącą funkcji ncRNA, a konkretnie ich zaangażowanie w
regulację ekspresji genów. Krótkie RNA powstałe z tRNA
reprezentują niezwykle szybko poznawaną klasę nowych
regulatorowych ncRNA, warto zatem przyjrzeć się funkcji
biologicznej poszczególnych tRF. Przede wszystkim wykazano podobieństwo między krótkimi fragmentami tRNA
a RNA biorącymi udział w procesie interferencji RNA
297
(RNAi). Małe, 20–30-nukleotydowe miRNA czy siRNA biorące udział w wyciszaniu genów wiążą się z rodziną białek Argonaute (Ago), które są głównymi komponentami
kompleksu RISC (ang. RNA-induced silencing complex). Oddziaływanie takie zostało zaobserwowane w przypadku 5’
tRF m.in. w ludzkich komórkach monocytów (Ago1) [33],
a także u Arabidopsis thaliana (Ago1, 2, 4, 7) [26]. Zasugerowano także, że tRF poprzez imitowanie mi/siRNA mogą
konkurować o komponenty maszynerii RNAi. Sądzi się, że
interferencja ta może powodować zachwianie homeostazy
mi/siRNA. 3’CCA tRF również wiążą się z białkami Ago1-4
oraz wykazują zdolności wyciszające, podobne do siRNA
[10]. Należy jednak dodać, że w odróżnieniu od miRNA nie
wiążą się one z Mov10 — helikazą RNA, niezbędną zarówno do represji translacji z udziałem miRNA oraz do cięcia
mRNA, w którym pośredniczy miRNA. Wyniki takie zostały uzyskane w przypadku ludzkich embrionalnych komórek
nerki oraz ludzkich komórek B [41]. Z drugiej strony, teza
że tRF biorą udział w wyciszaniu genów w sposób podobny
do miRNA, została potwierdzona poprzez odkrycie w
ludzkim genomie ciekawego zjawiska mimikry miRNA-tRF
[42]. Analiza sekwencji m.in. miR-1274b oraz miR-1274a wykazała stuprocentowe podobieństwo do 18-nukleotydowych
fragmentów 3’CCA tRF tRNALys3 i tRNALys5. Dalsze badania
ujawniły również zgodność miR-1280 z 3’CCA tRF tRNALeu,
miR-720 z 3’CCA tRF tRNAThr, a nawet miR-1308 z fragmentem 5’tRF tRNAGly oraz miR-886-5p z 5’tRF tRNAAla. Co więcej ekspresja 3’CCA tRF w liniach komórkowych chłoniaka
powodowała tłumienie proliferacji oraz modulowała molekularną odpowiedź na uszkodzenia DNA [41].
W komórkach drożdży zaobserwowano koprecypitację
stabilnych 5’ tRF jak i 3’ tRF z rybosomami, co sugerowałoby możliwość regulacji działania rybosomu poprzez bezpośrednią z nim asocjację [3]. Co ciekawe, efekt ten obserwowano w Saccharomyces cerevisiae, organizmie pozbawionym
maszynerii RNAi, tak więc mechanizm funkcjonowania tRF
musi być odmienny od działania miRNA. Idąc dalej, stwierdzono, że u archeona Haloferax volcanii 5’ tRF pochodzące z
tRNAVal wiążą się specyficznie i bezpośrednio do rybosomu, zarówno in vitro jak i in vivo [36]. Celem fragmentów
tRNA jest mała podjednostka rybosomalna 30S, a także polisomy, w szczególności w środowisku alkalicznym, czyli
warunkach stresowych dla tego organizmu. Udowodniono
także, że asocjacja tRF do rybosomu skutkuje hamowaniem
translacji. W komórkach ludzkich również obserwowano wiązanie tRF do polisomów, ale także do kompleksów
białkowo-nukleinowych mniejszych od podjednostki 40S,
co także skutkowało hamowaniem syntezy białek [34]. Dowodów na zahamowanie syntezy białek dostarczyła także
m.in. transfekcja ssaczych linii komórkowych mięsaka kościopochodnego U2OS (ang. human osteosarcoma cell line)
endogennymi 5’tRF co skutkowało całkowitym zahamowaniem translacji [29].
Warta uwagi jest także niezwykła rola tRF w mechanizmie ochronnym podczas infekcji wirusowej [1]. Wiadomo,
że tRNA — głównie tRNALys, tRNAPro, tRNATrp, służą jako
startery dla odwrotnej transkrypcji i syntezy wirusowego DNA. Niedawno jednak udowodniono, że 3’CCA tRF
tRNALys może in vitro przyłączać się do miejsca wiążącego
starter (PBS, ang. primer binding site) ludzkiego wirusa nie-
298
doboru odporności (HIV), tworząc duplex [43]. Następnie
dochodzi do związania z Ago2, co wywołuje cięcie komplementarnego RNA. Podobne zjawisko zaobserwowano także
u ludzkiego retrowirusa endogennego HERV (ang. human
endogenous retrowirus) [1]. Sugeruje to, że tRF działają jak
podobne do RNAi inhibitory replikacji endogennych retrowirusów.
Interesujące wyniki uzyskano także dla pierwotniaka
Tetrahymena thermophila [21]. Otóż okazuje się, że 3’CCA tRF
są ładowane na jedno z białek Piwi — Twi12. Białka te są
obecne przede wszystkim w liniach zarodkowych i są związane z piRNA [14]. Twi12 jest wymagane do wzrostu wegetatywnego. Wykazano, że w czasie gdy 3’CCA tRF jest
ładowany na Twi12, powstaje kompleks z 5’->3’ egzorybonukleazą Xrn2 i mało scharakteryzowanym białkiem Tan1
(ang. Tiwi-associated novel 1), zwany TXT [21]. Jego powstanie stymuluje aktywność nukleazową Xrn2.
W komórkach ludzkich wykazano istnienie zależności
między fragmentami 3’ tRNA pochodzącymi z dojrzałego
tRNA jak i pre-tRNA, czyli odpowiednio 3’ CCA tRF oraz
3’ U tRF. Wykazano, że oba rodzaje 3’ tRF wiążą się z Ago3
i Ago4, jednak tylko 3’CCA tRF (ale nie 3’U tRF!) powodował wyciszenie ekspresji genu reporterowego [10]. Co czyni
sprawę jeszcze bardziej skomplikowaną, po kotransfekcji
krótkich RNA komplementarnych do 3’U tRF wykazano, że
ten rodzaj tRF preferencyjnie wiązał się z Ago2, co z kolei
powodowało wyciszenie genu reporterowego. Zjawisko to
nazwano SITS (ang. sense-induced transgene silencing). Wysunięto więc wnioski, że to 3’U tRF kieruje SITS poprzez
zróżnicowane oddziaływanie z białkami Ago, konkurując
tym samym z si/miRNA. Wykazano także, że 3’U tRF reguluje proliferację komórek [5]. Wyciszenie 3’U tRF za pomocą
siRNA powodowało spadek proliferacji komórek, w czasie
gdy ponowne dodanie tRF powodowało jej wzrost. Co ważne w eksperymencie tym poziom dojrzałego i niedojrzałego tRNA nie ulegał zmianie, co sugeruje, że powstawanie i
poziom tRF jest całkowicie niezależne od regulacji poziomu
rodzicielskich tRNA. 3’U tRF wykryto także u archea, które
nie posiadają klasycznej ścieżki RNAi [44].
POWSTAWANIE FRAGMENTÓW
tRNA A WARUNKI STRESOWE
Powstawanie fragmentów tRNA często jest indukowane
warunkami stresowymi. Jak wiadomo, nieoptymalne warunki powodują szybkie i dynamiczne zmiany w komórkach. Dochodzi do globalnego obniżenia transkrypcji, a w
następstwie również syntezy białek, a także do wzrostu
ekspresji i translacji indukowanych stresem genów. Jakiekolwiek zmiany w dostępności cząsteczek tRNA również
mogą wywierać wpływ na poziom syntezy białek. Warto jednak wspomnieć, że odsetek ciętych w czasie stresu
tRNA jest bardzo niski i nie ma wpływu na obniżenie generalnej puli komórkowego tRNA [25]. Stwierdzono, że 5’
tRF pochodzący z niedojrzałego tRNA powoduje wyczulenie komórek na indukowaną stresem oksydacyjnym aktywację białka supresorowego p53 i związaną z nim śmierć
komórki [45]. Mechanizm tej reakcji nie jest jednak jeszcze
całkowicie poznany. Ciekawym przypadkiem jest Gardia
lamblia, u której tRF posiadają długość aż ok. 44-49 nt i powww.postepybiochemii.pl
Rycina 2. Klasy snoRNA: (A) C/D oraz (B) H/ACA.
wstają w wyniku cięcia w ramieniu 5’ pętli antykodonowej
dojrzałego tRNA [7]. Zlokalizowano także fragmenty 3’ tRF.
Generowane są one wskutek cięcia w prawym ramieniu
pętli antykodonowej. Powstawanie tRF u Gardia lamblia
indukowane jest różnymi czynnikami stresowymi jak np.
formowanie cyst, pozbawienie surowicy, niska temperatura czy szok cieplny. Fragmenty tRNA prawdopodobnie
odpowiadają tam za globalne obniżenie ekspresji genów,
by utrzymać komórki na stosunkowo niskim poziomie metabolicznym. Z kolei w ludzkich komórkach poddanych
stresowi oksydacyjnemu wykazano zahamowanie inicjacji
translacji poprzez 5’tRF [30].
jako środków terapeutycznych, dzięki podobieństwu do
miRNA. Także lepsze zrozumienie roli krótkich fragmentów tRNA w sygnalizacji stresu może przyczynić się do rozwoju metod naprawy niewłaściwych ścieżek sygnałowych.
KRÓTKIE RNA POWSTAJĄCE ZE snoRNA
Warto wspomnieć, że u Schizosaccharomyces pombe istnieje
kompleks zwany TRAMP (ang. Trf4/Air2/Mtr4p polyadenylation complex), który zapobiega przed wejściem rRNA, a także tRF, na ścieżkę siRNA [46]. Uszkodzenie działania tego
kompleksu prowadzi do śmierci komórki.
Cząsteczki snoRNA (ang. small nucleolar RNA) czyli małe
jąderkowe RNA charakteryzują się długością 60–300 nukleotydów i są zlokalizowane w jąderku komórkowym oraz
ciałkach Cajala. snoRNA występują zarówno u eukariontów jak i u archea — najprawdopodobniej wyewoluowały
więc ponad 2–3 miliardy lat temu [50]. U ludzi małe jąderkowe RNA są zazwyczaj kodowane w intronach. Po reakcji
składania mRNA introny są degradowane, a snoRNA, aby
uniknąć tego procesu tworzą kompleksy z białkami tworząc
snoRNP. Niektóre jąderkowe RNA są transkrybowane jako
oddzielne jednostki przez polimerazę II [51].
Nadal nie wiadomo, co determinuje powstawanie tRF
z tRNA. W dojrzałych tRNA zidentyfikowano ponad 100
różnych zmodyfikowanych nukleotydów, a funkcja wielu
z nich nadal pozostaje zagadką. Warto wspomnieć, że niektóre z tych modyfikacji stanowią sygnał dla rybonukleaz,
co skutkuje cięciem w specyficznych miejscach. Wykazano
także, że zmiany w końcowych nukleotydach małych RNA
mogą odpowiadać za to, z którymi białkami Argonaute
będą one oddziaływać [47,48]. Chociaż funkcjonowanie
ncRNA powstałych z tRNA nadal wymaga dalszych badań,
już pojawiają się propozycje wykorzystania tRF. Obiecujące
wydaje się zastosowanie ich jako biomarkerów w rozpoznawaniu nowotworów. Tematyka obecności i możliwości
wykorzystania fragmentów tRNA w przypadku nowotworów została przez nas ostatnio szerzej opisana w artykule
przeglądowym [49]. Nie bez znaczenia jest też potencjał tRF
Wyróżniamy dwie rodziny snoRNA różniące się strukturą oraz funkcją: C/D oraz H/ACA, przedstawione schematycznie na Ryc. 2. Obie rodziny biorą udział w chemicznej
modyfikacji nukleotydów w RNA, zazwyczaj rybosomalnych (rRNA) i to w kluczowych dla funkcji rybosomu regionach, takich jak centrum peptydylotransferazowe czy
centrum dekodujące mRNA. snoRNA mogą modyfikować
także inne RNA, jak np. snRNA u eukariontów czy tRNA
u archebakterii. snoRNA z rodziny C/D kierują metylacją
2’-O–rybozy, dzięki obecności metylotransferazy fibrillariny, natomiast snoRNA z rodziny H/ACA zaangażowane są
w pseudourydylację za pomocą syntetazy pseudourudyny
- dyskeriny. W procesie modyfikacji zachodzi hybrydyzacja
docelowego RNA z odpowiednim fragmentem snoRNA i
dzięki temu enzymy kompleksu snoRNP mogą zostać usytuowane w odpowiednim miejscu i zmodyfikować kon-
Postępy Biochemii 60 (3) 2014
299
Odkryto także wiele snoRNA, dla których nie można
zidentyfikować docelowego RNA. Nazwano je sierocymi
snoRNA (ang. orphan snoRNAs). Odgrywają one odmienne,
lecz istotne role w życiu komórki, np. SNORD114-1 sprzyja
regulacji cyklu komórkowego podczas przejścia z fazy G0/
G1 do fazy S i jest deregulowane w komórkach rakowych
[52]. Inne sieroce snoRNA takie jak U32A, U33 oraz U35A
gromadzą się w cytozolu podczas stresu komórkowego,
co wystawia je na działanie wielu cytosolowych RNaz,
mogących ciąć je na krótsze, stabilne fragmenty RNA [53].
snoRNA z rodzin H/ACA oraz C/D także ulegają procesowi przetworzenia, a fragmenty RNA powstające ze
snoRNA nazwano sdRNA (ang. snoRNA-derived RNAs).
sdRNA zostały zidentyfikowane u wielu organizmów eukariotycznych, a także u jednego wirusa (Tab. 2) [54-60].
MECHANIZM POWSTAWANIA sdRNA
Rycina 3. Biogeneza i możliwe funkcje sdRNA (na podstawie [51], zmienione). U
ssaków większość snoRNA znajduje się w intronach. Po reakcji składania introny
(kolor niebieski) są wycinane (A), a eksony (kolor czerwony) tworzą komórkowe
mRNA (B). Dojrzałe snoRNA akumulują się w jąderku (C), jednak pod wpływem
warunków stresowych mogą przemieszczać się do cytoplazmy (D). Powstające krótkie RNA zwane sdRNA pochodzą z prekursorowego (E) lub dojrzałego
snoRNA (F). sdRNA mogą wpływać na: ekspresję genów (G), alternatywne składanie mRNA (H) lub translację (I) poprzez mechanizm interferencji RNA/bezpośrednie oddziaływanie z rybosomami.
kretny nukleotyd. W rodzinie C/D asocjacja enzymu jest
wspomagana przez fragmenty snoRNA zwane kasetą C
(RUGAUGA, gdzie R = puryna), oraz blokiem D (CUGA)
znajdującymi się w pobliżu końca 3’ i 5’ (Ryc. 3). Krótkie
regiony pięcionukleotydowe zlokalizowane powyżej kasety C oraz poniżej kasety D są zazwyczaj komplementarne
i tworzą trzon spinki, przybliżając motywy C i D do siebie.
snoRNA z rodziny H/ACA mają dwie odrębne struktury
wspomagające asocjację enzymu, jedna z nich tworzy kieszeń
pseudourydylacyjną, druga zaś dwa jednoniciowe regiony
zawierające elementy o zachowanej w ewolucji sekwencji H
(ANANNA) i ACA.
Najlepiej poznane jest powstawanie fragmentów
snoRNA, które mają właściwości zbliżone do miRNA. Podobnie jak w przypadku kanonicznych miRNA, powstawanie
sdRNA z niektórych snoRNA z rodziny H/ACA jest zależne od enzymów Drosha i Dicer, jednak endonukleazy wycinające sdRNA ze snoRNA z rodziny C/D oraz wielu H/
ACA nadal pozostają nieznane [56]. Wiadomo, że snoRNA
z rodziny H/ACA są cięte do fragmentów o długości 17–19
nukleotydów natomiast te z rodziny C/D do fragmentów
dłuższych niż 27 nukleotydów [51].
MOŻLIWE FUNKCJE sdRNA
Najlepiej poznaną funkcją sdRNA jest regulacja translacji, poprzez działanie jako miRNA, tak jak w przypadku
pierwszego odkrytego sdRNA u prymitywnego eukarionta Giardia lambia [54]. Wiele innych miRNA także okazało się być fragmentami snoRNA. Co ciekawe, niektóre
miRNA znajdują się w jąderku, a nie w cytosolu jak pozostałe
miRNA powstałe z snoRNA. Wiele takich miRNA powstaje
z sierocych snoRNA, takich jak SNORD83A, GlsR17, GlsR16
[57], dlatego też sądzi się, iż dojrzałe sieroce snoRNA mogą
służyć jako magazyn do produkcji miRNA, nie posiadając
przy tym funkcji modyfikacji nukleotydów RNA. Odkryto
Tabela 2. Wykaz organizmów, u których odkryto istnienie sdRNA.
Organizm
Długość
Giardia lambia
21–26 nt
wirus Epsteina-Barra
24 nt
C/D
Saccharomyces cerevisiae
20–60 nt
C/D
H/ACA
Homo sapiens,
Rattus norvegicus
Mus musculus
Canis familiaris
20–22 nt
H/ACA
RNAi,
wyciszane mRNA CDC2L6
[2]
Homo sapiens,
Mus musculus
Drosophila melanogaster
Gallus domesticus
Schizosaccharomyces pombe
Arabidopsis thaliana
20–24 nt,
17–19 nt, >27 nt
H/ACA
C/D
RNAi
[32-33,56-60]
300
Klasa matczynego snoRNA
C/D
sieroce snoRNA
Funkcja
Piśmiennictwo
RNAi
[54]
RNAi
wyciszanie mRNA BALF5
możliwa w regulacji translacji,
niezależna od RNAi
[55]
[3]
www.postepybiochemii.pl
również przykłady snoRNA modyfikujących nukleotydy
w rybosomie, które również mogą być cięte do miRNA,
co wskazuje na ich wielofunkcyjność w regulowaniu ekspresji genów na poziomie translacji. Jednym z przykładów
może być snoRNA ACA45, który prócz kanonicznej funkcji
modyfikacji nukleotydów może być cięty do miRNA [2].
Dojrzały ACA45 funkcjonuje w jąderku ludzkich komórek,
jednak mała ilość tego RNA jest transportowana do cytosolu poprzez niepoznany jeszcze transporter. W cytoplazmie
DICER natychmiast tnie ACA45 do miRNA, którego celem
jest mRNA CDC2L6.
Fragmenty snoRNA mogą również brać udział w regulacji alternatywnego składania [58]. SNORD115 łączy się
na zasadzie komplementarności z alternatywnym eksonem
mRNA receptora serotoniny 2C. Udowodniono, że zarówno pełna jak i skrócona forma tego snoRNA mogą formować stabilne kompleksy z białkami zaangażowanymi w regulację alternatywnego składania.
Interesujący przypadek wykryto u drożdży Saccharomyces cerevisiae, gdzie sdRNA zidentyfikowano podczas
genomowego poszukiwania krótkich niekodujących RNA
oddziałujących z rybosomami podczas stresu komórkowego [3]. Podczas ewolucji S. cerevisiae utraciły całkowicie
mechanizm interferencji RNA, dlatego asocjacja z rybosomem może sugerować, że sdRNA mogą odgrywać nową,
nieznaną rolę w komórkach drożdży, niezależną od ścieżki
RNAi. Na rycinie 3 przedstawiono powstawanie i możliwe
funkcje sdRNA.
POWSTAWANIE sdRNA A WARUNKI STRESOWE
Cząsteczki snoRNA i ich fragmenty pełnią wiele funkcji,
np. mogą być zaangażowane w powstawanie chorób u człowieka, które mogą być rozpatrywane jako warunki stresowe dla komórek. Jednym z pierwszych dowodów na to, że
snoRNA i ich fragmenty odgrywają ważną rolę w kancerogenezie pochodzi z badań na ludzkich komórkach chłoniaka limfoblastycznego z linii B [59]. Okazało się, że miejsce
przerwania chromosomu podczas translokacji wywołującej
chłoniaka limfoblastycznego (t(3;6)(q27;q15)) jest miejscem
kodującym snoRNA SNORD50 (U50). W 30 liniach komórkowych raka prostaty obecna jest delecja dwóch par zasad
w tym samym rejonie kodującym U50. Wprowadzenie genu
SNORD50 i jego ekspresja znacząco zredukowało tworzenie
kolonii komórek rakowych. Późniejsza analiza 1371 przypadków wykazała, że homozygotyczność tej delecji istotnie
była związana z pojawieniem się nowotworu u pacjentów.
W związku z tym, U50 został zaproponowany jako gen supresorowy nowotworu prostaty [60].
Innym przykładem potwierdzającym rolę snoRNA w
powstawaniu nowotworów jest SNORA42. SNORA42
jest zlokalizowane w miejscu 1q22, które ulega amplifikacji u pacjentów z nowotworem płuc [61]. Co ciekawe, to
snoRNA ulega również nadekspresji w komórkach raka
płuc [25]. Idąc dalej, SNORD115 oraz SNORD116 to dwa
sieroce snoRNA, które znajdują się na chromosomie 15, w
rejonie, którego utrata odpowiedzialna jest za występowanie zespołu Pradera-Williego [62-63]. Delecja fragmentu,
lub całego długiego ramienia chromosomu 15 powoduje
Postępy Biochemii 60 (3) 2014
takie objawy chorobowe jak niski wzrost, niedorozwój
umysłowy oraz otyłość. Ostatnie badania ujawniły, że troje
pacjentów z zespołem Pradera-Williego posiadało delecje
tylko i wyłącznie we fragmentach kodujących wyżej wymienione snoRNA, co wskazuje na decydującą rolę tych
snoRNA w powstawaniu choroby.
FRAGMENTY RNA POCHODZĄCE Z mRNA
Krótkie fragmenty RNA pochodzące z mRNA zostały
wyłonione w wyniku wielu badań organizmów eukariotycznych [64]. Stwierdzono, że niektóre cząsteczki mRNA
posiadające w swej strukturze drugorzędowej spinki do
włosów lub długie dupleksy mogą być substratami dla
endonukleazy Dicer i w związku z tym być źródłem endogennych siRNA (ang. small interfering RNA). Jako przykład może posłużyć przypadek z Drosophila, gdzie 3’ UTR
mRNA CG4068 jest źródłem siRNA wyciszającego gen
mus308 [65]. Ponadto, u tego organizmu zaobserwowano
powstawanie siRNA z niemal 25% transkryptów. Częstym
źródłem powstawania dwuniciowych RNA są dwukierunkowe promotory lub komplementarne transkrypty powstające z odległych loci (jak np. pary gen-pseudogen) [66]. W
intronach mRNA często zlokalizowane są również ustrukturyzowane RNA będące z kolei źródłem miRNA. Takie
introny (zwane mirtronami) zawierają albo całe sekwencje
pri-miRNA, które są substratem dla Dicer i Drosha, albo
też są krótsze, a pre-miRNA powstają w wyniku składania
[64]. Warto również w tym miejscu wspomnieć o dalszym
przetwarzaniu już przetworzonego mRNA. W 2009 roku
opisano po raz pierwszy grupę niewielkich (~15-18 nt) niekodujących RNA powstających z miRNA i nazwano ją usRNA (ang. unusually small RNA) [5]. Stwierdzono wówczas,
że w genomie herpeswirusa związanego z mięsakiem
Kaposiego występuje K12-1 miRNA (23 nt), z którego powstaje 17-nukleotydowy usRNA (us-K12-1). Wspomniany
usRNA łączy się z białkiem Ago2 spełniając swoją unikatową funkcję, jaką jest regulacja poziomu mRNA RAD21,
kodującego białko odpowiedzialne za naprawę przerw w
dwuniciowych kwasach nukleinowych (ang. double-strand-break repair protein). Dalsze odkrycia wykazały, że usRNA
powstają głównie z końca 5’ miRNA i wiążą się głównie do
białka Ago2 — wówczas charakteryzują się specyficznym,
bogatym w cytozynę, motywem dokującym na końcu 3’.
Wykazano, że nawet 30% miRNA, które oddziałują z Ago
jest przetwarzanych do usRNA, a ich sekwencje są stabilne
ewolucyjnie [1,67]. Cząsteczki usRNA powiązano z mechanizmami odpowiedzi na infekcje wirusowe [1,67], z funkcjami hipokampu w komórkach mysich, a także z procesami
uczenia się [68].
Interesujących wyników na temat powstawania krótkich
RNA z mRNA, niezależnych od Dicer i Ago, dostarczyły
ostatnie badania prowadzone na drożdżach S. cerevisiae, które całkowicie pozbawione są maszynerii RNAi. W 2014 roku
Pircher wraz ze współpracownikami udowodnił, że 18-mer
pochodzący z mRNA genu TRM10 (kodującego metylotransferazę tRNA) oddziałuje z rybosomami, głównie z nieaktywnymi translacyjnie monosomami 80S [69]. Jednak w warunkach stresu osmotycznego, ten 18-mer migruje do aktywnych
translacyjnie polisomów, obniżając przy tym wydajność
translacji. Ta obserwacja udowodniła, że redukcja aktywno-
301
ści translacyjnej drożdży przez TRM-10 18-mer ma kluczowe znaczenie podczas odpowiedzi na stres zasolenia w tym
jednokomórkowym organizmie. Pozbawienie komórek tego
fragmentu RNA powodowało również znaczne opóźnienie
w obniżeniu poziomu metabolizmu w warunkach nieoptymalnych. Opóźnienie to jest istotne, ponieważ transkryptom
S. cerevisae zmienia się już w 10-45 min po ekspozycji na stres
[70]. Wyniki te sugerują, że ten krótki 18-nt RNA pochodzący
z mRNA może stanowić element systemu natychmiastowej
odpowiedzi na stres osmotyczny, nie wymagający syntezy
nowych cząstek regulatorowych.
PRZETWARZANIE INNYCH FUNKCJONALNYCH RNA
Oprócz wymienionych wcześniej, istnieje również bardzo wiele RNA, które powstają z funkcyjnych RNA w procesie trawienia nukleazami mi.in. z rybosomalnych RNA
(rRNA), małych jądrowych RNA (snRNA, ang. small nuclear
RNA), Y RNA czy vRNA (ang. vault) [64].
W przypadku rRNA stwierdzono preferencyjne powstawanie krótkich (~20 nt) RNA z końca 3’ [1]. Ma to swoje
uzasadnienie, gdyż z zastosowaniem chemicznego badania struktury drugorzędowej in vivo SHAPE (ang. selective
2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension) stwierdzono, że końce 3’ i 5’ rRNA rzadko tworzą helisy, w związku z
czym są podatne na cięcie [71]. Podobnie jest w przypadku
przetwarzania snRNA — krótkie RNA są również w dużej mierze generowane z końca 3’, zarówno w komórkach
ludzkich jak i mysich [1]. Krótkie RNA powstające z końców transkryptów rRNA i snRNA rzadko generowane są z
udziałem maszynerii RNAi.
Y RNA są klasą niekodujących RNA o długości ~100 nt,
zidentyfikowaną po raz pierwszy w serum pacjentów z chorobą autoimmunologiczną SLE (ang. systemic lupus erythematosus) [72]. W literaturze opisano dotąd dwie funkcje Y
RNA: jako represora kompleksu Ro60, którego funkcją jest
wiązanie nieprawidłowo sfałdowanych RNA i przekazywanie ich na drogę degradacji oraz jako czynnika inicjującego
replikację DNA [72]. W 2012 roku opisano powstawanie
krótkich RNA z Y RNA podczas apoptozy [73]. W tej samej
pracy wykazano również, że krótkie RNA mogą pojawiać
się zarówno w komórkach nie poddawanych stresowi, jak i
w wielu liniach nowotworowych. Ze względu na istniejące
w literaturze spekulacje na temat możliwości generowania
fragmentów Y RNA przez Dicer lub Drosha (Y RNA ma
strukturę podobną do pre-miRNA), dostarczono również
jednoznacznych dowodów na to, że fragmenty Y RNA nie
uczestniczą w ścieżce miRNA: ich powstawanie jest niezależne od rybonukleazy Dicer, nie tworzą kompleksów z
białkami Ago2, a formowane przez nie kompleksy z białkami są odmienne od tych, które tworzą miRNA.
Cząsteczki vRNA są komponentami organelli komórkowych zwanych po angielsku vault, dużych kompleksów
białkowo-nukleinowych o masie cząsteczkowej 13 MDa.
Kompleksy vault uwikłane są w oporność wielolekową oraz
transport międzykomórkowy. Kompleks takich rozmiarów jest największym poznanym do tej pory komórkowym
RNP, a jego wielkość teoretycznie pozwala na transport
cząsteczek wielkości rybosomu. Każda organella vault po-
302
siada w swym składzie (oprócz 3 białek) od 8 do 16 vRNA
o długości 86-141 nt. Odkryto, że liczba kopii vRNA ulega
znacznemu podwyższeniu przy infekcji wirusem EBV (ang.
Epstein-Barr virus) [74], jednak dokładna funkcja vRNA w
kompleksie vault jest nadal niepoznana. Niedawno przeprowadzono badania, które pokazały, że ludzkie vRNA są
przetwarzane do krótkich RNA (svRNA, ang. small vault
RNA) niezależnie od rybonukleazy Dicer [75]. Jednakże te
same svRNA asocjują z białkami Ago, kierując je na ścieżkę
zależnej od sekwencji degradacji mRNA. Wśród sekwencji docelowych svRNA zidentyfikowano (i potwierdzono doświadczalnie) mRNA kodujące cytochrom P450 3A4
(CYP3A4), białko związane z metabolizmem ksenobiotyków.
Wynik ten jest potwierdzeniem przypuszczeń dotyczących
udziału kompleksów vault w oporności wielolekowej.
PODSUMOWANIE
W ostatnich latach wzrasta liczba prowadzonych badań
na skalę genomową. Jest to związane z coraz większą popularnością i dostępnością metod wysokowydajnego sekwencjonowania oraz szeroko zakrojonych analiz bioinformatycznych. W wyniku tego identyfikuje się coraz więcej
fragmentów pochodzących ze scharakteryzowanych genów. Takie krótkie RNA zyskują szerokie zainteresowanie
ze względu na podobieństwo do znanych miRNA, wiązanie
do białek Ago lub ciekawe zależności z procesem biosyntezy białka, ale przede wszystkim dlatego, że ich funkcja jest
odmienna od rodzicielskich RNA. Co więcej, możliwość regulacji ekspresji genów bezpośrednio przez RNA, bez potrzeby biosyntezy białek receptorowych i regulacyjnych jest
wyjątkowo ekonomiczny, więc korzystny dla komórki.
Analizując biogenezę różnych klas krótkich RNA z łatwością można zauważyć, że cząsteczki rodzicielskie posiadają
bardzo zróżnicowane funkcje. Zauważmy też, że dotychczasowy repertuar funkcji — mRNA jako transkryptu genu, tRNA
jako transportera aminokwasów czy rRNA jako budulca rybosomu, nie obejmuje dzisiaj całości funkcji sprawowanych
przez RNA. Jeśli dodać do tego zupełnie odmienne funkcje
powstających z nich krótkich RNA, mamy do dyspozycji niezwykły repertuar regulatorowy pełniony przez RNA.
PIŚMIENNICTWO
1. Li Z, Ender C, Meister G, Moore PS, Chang Y, John B (2012) Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs,
snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res 40: 6787-6799
2. Ender C, Krek A, Friedländer MR, Beitzinger M, Weinmann L, Chen
W, Pfeffer S, Rajewsky N, Meister G (2008) A Human snoRNA with
microRNA-like functions. Mol Cell 32: 519-528
3. Zywicki M, Bakowska-Zywicka K, Polacek N (2012) Revealing stable
processing products from ribosome-associated small RNAs by deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res 40: 4013-4024
4. Lee YS, Shibata Y, Malhotra A, Dutta A (2009) A novel class of small
RNAs: tRNA-derived RNA fragments (tRFs). Genes Dev 23: 2639-2649
5. Li Z, Kim SW, Lin Y, Moore PS, Chang Y, John B (2009) Characterization of viral and human RNAs smaller than canonical microRNAs. J
Virol 83: 12751-12758
6. Gebetsberger J, Polacek N (2013) Slicing tRNAs to boost functional
ncRNA diversity. RNA Biol 10: 1798-17806
7. Li Y, Luo J, Zhou H, Liao JY, Ma LM, Chen YQ, Qu LH (2008) Stress-induced tRNA-derived rRNA: A novel class of small rRNA in the
primitive eukaryote Giardia lamblia. Nucleic Acids Res 36: 6048-6055
www.postepybiochemii.pl
8. Emara MM, Ivanov P, Hickman T, Dawra N, Tisdale S, Kedersha N,
Hu GF, Anderson P (2010) Angiogenin-induced tRNA-derived stress-induced RNAs promote stress-induced stress granule assembly. J Biol
Chem 285: 10959-10968
9. Lee SR, Collins K (2005) Starvation-induced cleavage of the tRNA anticodon loop in Tetrahymena thermophila. J Biol Chem 280: 42744-42749
10.Haussecker D, Huang Y, Lau A, Parameswaran P, Fire AZ, Kay MA
(2010) Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of
RNA silencing. RNA 16: 673-695
11.Zhao H, Bojanowski K, Ingber DE, Panigrahy D, Pepper MS, Montesano R, Shing Y (1999) New role for tRNA and its fragment purified from
human urinary bladder carcinoma conditioned medium: inhibition of
endothelial cell growth. J Cell Biochem 76: 109-117
12.Garcia-Silva MR, Frugier M, Tosar JP, Correa-Dominguez A, Ronal-te-Alves L, Parodi-Talice A, Rovira C, Robello C, Goldenberg S, Cayota A (2010) A population of tRNA-derived small RNAs is actively
produced in Trypanosoma cruzi and recruited to specific cytoplasmic
granules. Mol Biochem Parasitol 171: 64-73
13.Ogawa T, Tomita K, Ueda T, Watanabe K, Uozumi T, Masaki H (1999)
A cytotoxic ribonuclease targeting specific transfer rna anticodons.
Science 283: 2097-2100
deficiency in Arabidopsis by deep sequencing. Plant Physiol 151: 2120213229
29.Yamasaki S, Ivanov P, Hu GF, Anderson P (2009) Angiogenin cleaves
tRNA and promotes stress-induced translational repression. J Cell Biol
185: 35-42
30.Ivanov P, Emara MM, Villen J, Gygi SP, Anderson P (2011) Angiogenin-induced tRNA fragments inhibit translation initiation. Mol Cell
43: 613-623
31.Cole C, Sobala A, Lu C, Thatcher SR, Bowman A, Brown JW, Green PJ,
Barton GJ, Hutvagner G (2009) Filtering of deep sequencing data reveals the existence of abundant Dicer-dependent small RNAs derived
from tRNAs. RNA 15: 2147-2160
32.Kawaji H, Nakamura M, Takahashi Y, Sandelin A, Katayama S, Fukuda S, Daub CO, Kai C, Kawai J, Yasuda J, Carninci P, Hayashizaki
Y (2008) Hidden layers of human small RNAs. BMC Genomics 9: 157
33.Burroughs AM, Ando Y, de Hoon MJ, Tomaru Y, Suzuki H, Hayashizaki Y, Daub CO (2011) Deep sequencing of human Argonaute-associated small RNAs provides insight into miRNA sorting and reveals
Argonaute association with RNA fragments of diverse origin. RNA
Biol 8: 158-177
14.Thompson DM, Parker R (2009) Stressing out over tRNA cleavage.
Cell 138: 215-219
34.Sobala A, Hutvagner G (2013) Small RNAs derived from the 5’ end
of tRNA can inhibit protein translation in human cells. RNA Biol 10:
553-563
15.Fu H, Feng J, Liu Q, Sun F, Tie Y, Zhu J, Xing R, Sun, Z, Zheng X (2009)
Stress induces tRNA cleavage by angiogenin in mammalian cells.
FEBS Lett 583: 437-442
35.Schaefer M, Pollex T, Hanna K, Tuorto F, Meusburger M, HelmM,
Lyko F (2010) RNA methylation by dnmt2 protects transfer RNAs
against stress-induced cleavage. Genes Dev 24: 1590-1595
16.Dhahbi JM, Spindler SR, Atamna H, Yamakawa A, Boffelli D, Mote P,
Martin DI (2013) 5′tRNA halves are present as abundant complexes
in serum, concentrated in blood cells, and modulated by aging and
calorie restriction. BMC Genomics 14: 298
36.Aravin AA, Lagos-Quintana M, Yalcin A, Zavolan M, Marks D, Snyder B, Gaasterland T, Meyer J, Tuschl T (2003) The small RNA profile
during Drosophila melanogaster development. Dev Cell 5: 337-350
17.Nowacka M, Strozycki PM, Jackowiak P, Hojka-Osinska A, Szymanski M, Figlerowicz M (2013) Identification of stable, high copy number, medium sized RNA degradation intermediates that accumulate in
plants under non-stress conditions. Plant Mol Biol 83: 191-204
18.Sobala A, Hutvagner G (2011) Transfer RNA-derived fragments: Origins, processing, and functions. Wiley Interdiscip Rev 2: 853-862
19.Yudelevich A (1971) Specific cleavage of an Escherichia coli leucine
transfer RNA following bacteriophage T4 infection. J Mol Biol 60:
21–29
20.Tomita K, Ogawa T, Uozumi T, Watanabe K, Masaki H (2000) A cytotoxic ribonuclease which specifically cleaves four isoaccepting arginine trnas at their anticodon loops. Proc Natl Acad Sci USA 97: 8278-8283
21.Couvillion MT, Sachidanandam R, Collins K (2010) A growth-essential Tetrahymena Piwi protein carries tRNA fragment cargo. Genes Dev
24: 2742-2747
22.Andersen KL, Collins K (2012) Several RNase T2 enzymes function in
induced tRNA and rRNA turnover in the ciliate Tetrahymena. Mol Biol
Cell 23: 36-44
23.Haiser HJ, Karginov FV, Hannon GJ, Elliot MA (2008) Developmentally regulated cleavage of trnas in the bacterium Streptomyces coelicolor.
Nucleic Acids Res 36: 732-741
24.Jochl C, Rederstorff M, Hertel J, Stadler PF, Hofacker IL, Schrettl M,
Haas H, Huttenhofer A (2008) Small ncRNA transcriptome analysis
from Aspergillus fumigatus suggests a novel mechanism for regulation
of protein synthesis. Nucleic Acids Res 36: 2677-2689
25.Thomson T, Lin H (2009) The biogenesis and function of PIWI proteins and piRNAs: progress and prospect. Annu Rev Cell Dev Biol 25:
355-376
26.Loss-Morais G, Waterhouse PM, Margis R (2013) Description of plant
tRNA-derived RNA fragments (tRFs) associated with Argonaute and
identification of their putative targets. Biol Direct 8: 6
27.Zhang S, Sun L, Kragler F (2009) The phloem-delivered RNA pool
contains small noncoding RNAs and interferes with translation. Plant
Physiol 150: 378
28.Hsieh LC, Lin SI, Shih AC, Chen JW, Lin WY, Tseng CY, Li WH, Chiou
TJ (2009) Uncovering small RNA-mediated responses to phosphate
Postępy Biochemii 60 (3) 2014
37.Gebetsberger J, Zywicki M, Künzi A, Polacek N (2012) tRNA-derived
fragments target the ribosome and function as regulatory non-coding
RNA in Haloferax volcanii. Archaea 2012: 260909
38.Phizicky EM, Hopper AK (2010) tRNA biology charges to the front.
Genes Dev 24: 1832-1840
39.Vanacova S, Wolf J, Martin G, Blank D, Dettwiler S, Friedlein A, Langen H, Keith G, Keller W (2005) A new yeast poly(A) polymerase complex involved in RNA quality control. PLoS Biol 3: e189
40.Mattick JS (2004) RNA regulation: a new genetics? Nat Rev Genet 5:
316-523
41.Maute RL, Schneider C, Sumazin P, Holmes A, Califano A, Basso K,
Dalla-Favera R (2013) tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell
lymphoma. Proc Natl Acad Sci USA 110: 1404-1409
42.Schopman NCT, Heynen S, Haasnoot J, Berkhout B (2010) A miRNA-tRNA mix-up: tRNA origin of proposed miRNA. RNA Biol 7: 573–576
43.Yeung ML, Bennasser Y, Watashi K, Le SY, Houzet L, Jeang KT (2009)
Pyrosequencing of small non-coding RNAs in HIV-1 infected cells:
evidence for the processing of a viral-cellular double-stranded RNA
hybrid. Nucleic Acids Res 37: 6575-6586
44.Heyer R, Dörr M, Jellen-Ritter A, Späth B, Babski J, Jaschinski K, Soppa
J, Marchfelder A (2012) High throughput sequencing reveals a plethora of small RNAs including tRNA derived fragments in Haloferax volcanii. RNA Biol 9: 1011-1018
45.Hanada T, Weitzer S, Mair B, Bernreuther C, Wainger BJ, Ichida J, Hanada R, Orthofer M, Cronin SJ, Komnenovic V, Minis A, Sato F, Mimata H, Yoshimura A, Tamir I, Rainer J, Kofler R, Yaron A, Eggan KC,
Woolf CJ, Glatzel M, Herbst R, Martinez J, Penninger JM (2013) CLP1
links tRNA metabolism to progressive motor-neuron loss. Nature 495:
474-480
46.Bühler M, Spies N, Bartel DP, Moazed D (2008) TRAMP mediated
RNA surveillance prevents spurious entry of RNAs into the Schizosaccharomyces pombe siRNA pathway. Nat Struct Mol Biol 15: 1015–1023
47.Tomari Y, Du T, Zamore PD (2007) Sorting of Drosophila small silencing RNAs. Cell 130: 299–308
48.Förstemann K, Horwich MD, Wee L, Tomari Y, Zamore PD (2007)
Drosophila microRNAs are sorted into functionally distinct argonaute
complexes after production by Dicer-1. Cell 130: 287–297
303
49.Mleczko AM, Celichowski P, Bąkowska-Żywicka K (2014) Ex-translational function of tRNAs and their fragments in cancer. Acta Biochim
Pol 61: 211-216
50.Matera AG, Terns RM, Terns MP (2007) Noncoding RNAs: Lessons
from the small nuclear and small nucleolar RNAs. Nat Rev Mol Cell
Biol 8: 209-220
51.Falaleeva M, Stamm S (2013) Processing of snoRNAs as a new source
of regulatory non-coding RNAs: snoRNA fragments form a new class
of functional RNAs. Bioessays 35: 46-54
52.Valleron W, Laprevotte E, Gautier EF, Quelen C, Demur C, Delabesse
E, Agirre X, Prósper F, Kiss T, Brousset P (2012) Specific small nucleolar RNA expression profiles in acute leukemia. Leukemia 26: 20522060
53.Michel CI, Holley CL, Scruggs BS, Sidhu R, Brookheart RT, Listenberger LL, Behlke MA, Ory DS, Schaffer JE (2011) Small nucleolar RNAs
U32a, U33, and U35a are critical mediators of metabolic stress. Cell
Metab 14: 33-44
caused by paternal deficiency for the HBII-85 C/D box small nucleolar
RNA cluster. Nat Genet 40: 719-721
63.Duker AL, Ballif BC, Bawle EV, Person RE, Mahadevan S, Alliman S,
Thompson R, Traylor R, Bejjani BA, Shaffer LG, Rosenfeld JA, Lamb
AN, Sahoo T (2010) Paternally inherited microdeletion at 15q11.2 confirms a significant role for the SNORD116 C/D box snoRNA cluster in
Prader-Willi syndrome. Eur J Hum Genet 18: 1196-1201
64.Tuck AC, Tollervey D (2011) RNA in pieces. Trends Genet 27: 422-432
65.Okamura K, Chung WJ, Ruby JG, Guo H, Bartel DP, Lai EC (2008) The
Drosophila hairpin RNA pathway generates endogenous short interfering RNAs. Nature 453: 803-806
66.Watanabe T, Totoki Y, Toyoda A, Kaneda M, Kuramochi-Miyagawa S,
Obata Y, Chiba H, Kohara Y, Kono T, Nakano T, Surani MA, Sakaki Y,
Sasaki H (2008) Endogenous siRNAs from naturally formed dsRNAs
regulate transcripts in mouse oocytes. Nature 453: 539-543
54.Saraiya AA, Wang CC (2008) snoRNA, a novel precursor of microRNA in Giardia lamblia. PLoS Pathog 4: e1000224
67.Hess AM, Prasad A, Ptitsyn A, Ebel GD, Olson KE, Barbacioru C, Monighetti C, Campbell CL (2011) Small RNA profiling of Dengue virus-mosquito interactions implicates the PIWI RNA pathway in anti-viral
defense. BMC Microbiol 11: 45
55.Hutzinger R, Feederle R, Mrazek J, Schiefermeier N, Balwierz PJ, Zavolan M, Polacek N, Delecluse HJ, Hüttenhofer A (2009) Expression
and processing of a small nucleolar RNA from the Epstein-Barr virus
genome. PLoS Pathog 5: e1000547
68.Smalheiser NR, Lugli G, Thimmapuram J, Cook EH, Larson J (2011)
Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are
expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training. RNA 17: 166-181
56.Taft RJ, Glazov EA, Lassmann T, Hayashizaki Y, Carninci P, Mattick JS
(2009) Small RNAs derived from snoRNAs. RNA 15: 1233-1240
69.Pircher A, Bakowska-Zywicka K, Schneider L, Zywicki M, Polacek N
(2014) An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the
ribosome. Mol Cell 54: 147-155
57.Brameier M, Herwig A, Reinhardt R, Walter L, Gruber J (2011) Human
boxC/D snoRNAs with miRNA like functions: expanding the range of
regulatory RNAs. Nucleic Acids Res 39: 675-686
58.Kishore S, Khanna A, Zhang Z, Hui J, Balwierz PJ, Stefan M, Beach
C, Nicholls RD, Zavolan M, Stamm S (2010) The snoRNA MBII-52
(SNORD 115) is processed into smaller RNAs and regulates alternative splicing. Hum Mol Genet 19: 1153-1164
59.Tanaka R, Satoh H, Moriyama M, Satoh K, Morishita Y, Yoshida S,
Watanabe T, Nakamura Y, Mori S (2000) Intronic U50 small-nucleolar-RNA (snoRNA) host gene of non protein-coding potential is mapped
at the chromosome breakpoint t(3;6)(q27;q15) of human B-cell lymphoma. Genes Cells 5: 277-287
60.Dong XY, Rodriguez C, Guo P, Sun X, Talbot JT, Zhou W, Petros J, Li
Q, Vessella RL, Kibel AS, Stevens VL, Calle EE, Dong JT (2008) SnoRNA U50 is a candidate tumor-suppressor gene at 6q14.3 with a mutation associated with clinically significant prostate cancer. Hum Mol
Genet 17: 1031-1042
61.Goeze A, Schlüns K, Wolf G, Thäsler Z, Petersen S, Petersen I (2002)
Chromosomal imbalances of primary and metastatic lung adenocarcinomas. J Pathol 196: 8-16
62.Sahoo T, del Gaudio D, German JR, Shinawi M, Peters SU, Person RE,
Garnica A, Cheung SW, Beaudet AL (2008) Prader-Willi phenotype
70.Gasch AP, Spellman PT, Kao CM, Carmel-Harel O, Eisen MB, Storz
G, Botstein D, Brown PO (2000) Genomic expression programs in the
response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell 11:
4241-4257
71.Hajdin CE, Bellaousov S, Huggins W, Leonard CW, Mathews DH,
Weeks KM (2013) Accurate SHAPE-directed RNA secondary structure modeling, including pseudoknots. Proc Natl Acad Sci USA 110:
5498-5503
72.Verhagen AP, Pruijn GJ (2011) Are the Ro RNP-associated Y RNAs
concealing microRNAs? Y RNA-derived miRNAs may be involved in
autoimmunity. BioEssays 33: 674-682
73.Nicolas FE, Hall AE, Csorba T, Turnbull C, Dalmay T (2012) Biogenesis of Y RNA-derived small RNAs is independent of the microRNA
pathway. FEBS Lett 586: 1226-1230
74.Nandy C, Mrázek J, Stoiber H, Grässer FA, Hüttenhofer A, Polacek N
(2009) Epstein-barr virus-induced expression of a novel human vault
RNA. J Mol Biol 388: 776-784
75.Persson H, Kvist A, Vallon-Christersson J, Medstrand P, Borg A, Rovira C (2009) The non-coding RNA of the multidrug resistance-linked
vault particle encodes multiple regulatory small RNAs. Nat Cell Biol
11: 1268-1271
RNA processing — unusual mechanism of generation of novel
classes of noncoding RNAs from functional RNAs
Marta Kasprzyk, Anna M. Mleczko, Piotr Celichowski, Kamilla Bąkowska-Żywicka
Department of RNA Biology, Institute of Bioorganic Chemistry Polish Academy of Sciences, 12/14 Noskowskiego St., 61-704 Poznań, Poland

e-mail: [email protected]
Key words: noncoding RNA, RNA processing, snoRNA, tRNA, mRNA
ABSTRACT
Non-coding RNAs (ncRNAs) play regulatory roles at all stages of the genetic information transmission from DNA to proteins. The ncRNA-mediated mechanisms leading to specific expression or silencing of particular genes seem to be of special importance. In addition to well-known
and well-understood functions of RNAs, we recently discover new and nonobvious aspects and possibilities of regulating cellular processes.
One example is the processing of various RNAs, the mechanism of formation of short non-coding RNAs from existing functional RNAs. Both:
the sources of these short RNAs and the functions performed by them are diverse. Their presence greatly enriches the possibilities of gene
expression regulation, as it turns out, at all stages.
304
www.postepybiochemii.pl