Oglądaj/Otwórz

Autoreferat rozprawy doktorskiej
"Enzymy na stałych podłożach i w układach nanostrukturalnych"
autor: mgr Piotr Olejnik
promotor: dr hab. Barbara Pałys, prof. UW
Pracownia Elektrochemii
Celem pracy było stworzenie oraz scharakteryzowanie układów elektrodowych
zdolnych do wykrywania molekularnego tlenu, a także nadtlenku wodoru, opartych na
elektrokatalitycznych właściwościach enzymów redoks - umożliwiających bezpośrednie
przeniesienie elektronów (DET). Układy tego rodzaju mogą znaleźć potencjalne zastosowanie
zarówno jako biokatody w bioogniwach paliwowych, jak również biosensory.
Takie przedsięwzięcie wymagało opracowania optymalnych metod unieruchamiania
enzymów na wybranych, efektywnych podłożach katalitycznych, biorąc szczególnie pod
uwagę kontrolowanie orientacji przestrzennej enzymatycznych cząsteczek na powierzchni
oraz określenia wpływu orientacji na aktywność bioelektrokatalityczną, strukturę oraz
stabilność biokatalizatorów. Ponadto praca obejmuje charakterystykę fizykochemiczną
układów
nanostrukturalnych:
powierzchni
elektrochemicznie
elektroredukowanego
tlenku
chropowaconej
grafenu
oraz
powierzchni
warstwy
LB
złota,
nanorurek
polianilinowych.
W pracy wykorzystane były trzy wybrane enzymy: lakaza, peroksydaza chrzanowa
(HRP) oraz katalaza (CAT). Stanowią one główny element, otrzymanych a następnie
badanych układów elektrodowych. Ich aktywność elektrokatalityczna sprawdzona została na
kilku podłożach modyfikowanych chemicznie bądź elektrochemicznie np. samoorganizującą
się warstwą tioli, elektroredukowanymi solami diazoniowymi o różnym ładunku, filmem
lipidowym LB, elektrochemicznie redukowanym tlenkiem grafenu (GO), makro- oraz
nanostrukturalną polianiliną lub poprzez proces elektrochemicznego chropowacenia
powierzchni.
Wymienione zadania badawcze były realizowane za pomocą wielu metod badawczych
np.: woltamperometrii cykliczna (CV), chronoamperometrii (CA), techniki LangmuiraBlodgett (LB), mikroskopii kąta Brewstera (BAM), skaningowej mikroskopii elektronowej
(SEM), mikroskopii optycznej i mikroskopii w podczerwieni, spektroskopii UV-Vis, Ramana
oraz absorpcyjnej spektroskopii odbiciowej w podczerwieni z modulacją polaryzacji światła
(PMIRRAS).
Technika PMIRRAS umożliwiła badanie orientacji cząsteczek białka poprzez
porównywanie stosunków intensywności pasm amid I/amid II. Drgania odpowiadające
pasmom amid I i amid II są prostopadłe względem siebie, dlatego zmiana orientacji wpływa
na względne intensywności tych pasm. Wyniki PMIRRAS pokazały, że rodzaj podłoża i
sposób unieruchamiania enzymu wpływają na intensywności pasm amid I i amid II.
Porównanie widm PMIRRAS z odpowiedziami woltamperometrycznymi dla lakazy na
różnych podłożach, pozwoliło wykazać ścisłą zależność pomiędzy orientacją enzymu, a jego
aktywnością elektrokatalityczną. Równoległe ułożenie β-kartek względem powierzchni
skutkuje zatem wysoką aktywnością enzymu. W takim ułożeniu cząsteczki enzymu, centrum
aktywne T1 znajduje się blisko powierzchni elektrody.
Położenie pasma amid I zależy od struktury drugorzędowej i trzeciorzędwoej enzymu.
Przesunięcia tego pasma mogą oznaczać denaturację części białkowej. Co prawda badania
techniką PMIRRAS nie potwierdziły denaturacji enzymów podczas bezpośredniego kontaktu
z powierzchnią złota, ale wykazały, że oddziaływania ze złotem mogą wpływać na proces
protonowania wolnych grup karboksylowych obecnych w strukturze lakazy. Oddziaływania
te zaburzają gospodarkę wymiany protonów pogarszając jednocześnie właściwości
elektrokatalityczne enzymu.
Pomiary orientacji lakazy techniką PMIRRAS pozwoliły także ustalić, że kąt
nachylenia pomiędzy osią β-kartek, a powierzchnią elektrody jest większy w przypadku
pozytywnie naładowanego podłoża. Przykładem takiego podłoża jest elektroredukowana sól
diazoniowa -C6H4-C2H2-NH3+ (AEP). Taka modyfikacja powierzchni z przyczepioną lakazą
zapewniła bezpośredni, niemediowany, elektrokatalityczny prąd związany z redukcją
molekularnego tlenu, który pojawił się przy potencjale 0.6 V względem chlorosrebrowej
elektrody odniesienia Ag/AgCl w pH = 4.5. Osiągnięta wartość zbliżona jest do potencjału
redoks centrum aktywnego T1 lakazy.
Cząsteczki lakazy udało się wbudować w warstwę fosfolipidową utworzoną techniką
Langmuira-Blodgett, co potwierdził kształt i przesunięcie względem siebie izoterm
Langmuira oraz widma PMIRRAS warstw przeniesionych na podłoże złote. Niestety układ
ten nie był elektroaktywny i nie reagował na obecność tlenu w środowisku reakcyjnym.
Widmo inkorporowanego enzymu potwierdziło przesunięcie pasma amid I w stronę niższych
długości fali względem natywnej cząsteczki biokatalizatora. Za przesunięcie odpowiadają
prawdopodobnie oddziaływania enzymu z hydrofobowymi łańcuchami warstwy DPPG.
Badania
orientacji
dotyczyły
także
peroksydazy
chrzanowej.
Została
ona
unieruchomiona na elektrochemicznie redukowanym tlenku grafenu (ERGO) osadzonym na
elektrochemicznie chropowaconej powierzchni złota. Powierzchnia złota powodowała
wzmocnienie widma w podczerwieni przez efekt SEIRA (od ang. Surface Enhanced Infrered
Absorption). SEIRA powoduje selektywne wzmocnienie drgań prostopadłych do powierzchni
złota, co umożliwia badanie orientacji cząsteczek. HRP unieruchomiona na powierzchni
ERGO na chropowaconym złocie katalizowała redukcję nadtlenku wodoru bez konieczności
wykorzystywania mediatora. Odpowiednie ułożenie cząsteczek HRP zwiększyło w tym
przypadku efektywność elektrokatalizy. Na proces redukcji wpływ miała również
elektrochemicznie chropowacona powierzchnia złota, która stanowiła podłoże. Powierzchnia
tego rodzaju składa się z nanostruktur złota o różnych rozmiarach - od kilku do 200 nm. W
porównaniu do węgla szklistego zdecydowanie wzmacniała sygnał prądowy dla procesu
rozkładu H2O2.
Aktywność HRP została zbadana również po jej unieruchomieniu na powierzchni
makrostrukturalnej
polianiliny.
Niezależnie
od
sposobu
immobilizacji,
układy
charakteryzowały się małą czułością w obecności nadtlenku wodoru. Cząsteczki peroksydazy
chrzanowej udało się wbudować w nanostrukturalną warstwę polianilinową LangmuiraBlodgett. Orientacja cząsteczek enzymu w uporządkowanym filmie wzmocniła jej
właściwości elektrokatalityczne, a cały system redukował H2O2 uzyskując wyższe wartości
prądów.
Podobne zależności zostały zaobserwowane w przypadku układów z katalazą. Enzym
ten unieruchomiono wykorzystując adsorpcję fizyczną, poprzez tworzenie wiązania
kowalencyjnego oraz pułapkowanie w sieci polimerowej. Jednak najwyższa aktywność
została zarejestrowana dopiero po udanym procesie wbudowywania pomiędzy nanorurkami
polianiliny w warstwie LB.
Wyniki stanowiące podstawę mojej pracy doktorskiej zostały opublikowane w
czterech publikacjach naukowych w czasopismach o zasięgu międzynarodowym: Journal of
Physical Chemistry C oraz Electrochimica Acta.