Zastosowanie spektroskopii FT-IR oraz techniki wymiany izotopowej

Pracownia analizy instrumentalnej i spektroskopii molekularnej
Makrokierunek Inżynierii Nanostruktur Uniwersytetu Warszawskiego.
Semestr zimowy 2012/2013
Zastosowanie spektroskopii FT-IR oraz techniki wymiany izotopowej H/D do badania
przemian strukturalnych w kolagenie
Cel
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z zastosowaniami spektroskopii FT-IR oraz zjawiskiem
wymiany izotopowej H/D w badaniach struktury i stabilności białek. W ramach ćwiczenia
analizowane są widma absorpcyjne w podczerwieni mieszanin H2O/D2O, oraz cienkich filmów
kolagenu i żelatyny.
Spektroskopia białek w podczerwieni
Bogactwo i różnorodność grup i wiazań chemicznych występujących w białkach sprawia, iż
ich widma wibracyjne (zarówno absorpcyjne jak i Ramana) pełne są nakładających się, i przeze to
trudnych w interpretacji pasm. Samo wiązanie peptydowe (Rys. 1) jest źródłem dziewięciu pasm
spektralnych (tzw. pasma amidowe I, II, …VII, oraz A i B), spośród których tylko pasma A i B
związane są z ze zlokalizowanymi drganiami, podczas gdy drgania odpowiedzialne za pasma amid
I..VII są drganiami złożonymi.
C
O
N
H
Rys. 1. Wiązanie peptydowe wraz z niektórymi elementarnymi drganiami odpowiedzialnymi za pojawienie się
pasm amid I i amid A.
W kontekście badań spektroskopowych ważne jest, iż nawet subtelne różnice w
sprzężeniach i oddziaływaniach wewnątrzmolekularnych, jakie są uwarunkowane typem struktury
II-rzędowej białka znajdują swe odzwierciedlenie w położeniu i kształcie niektórych pasm
amidowych. Z tego względu obecność takich elementów strukturalnych białek jak α-helisa, βkartka, czy kłębek statystyczny pociąga za sobą pojawienie się charakterystycznych składowych
tych pasm, w szczególności w obszarze amid I i amid III - aktywnych zarówno w widmach
absorpcyjnych w podczerwieni jak i w widmach ramanowskich.
Tabela 1. Najbardziej użyteczne diagnostycznie pasma amidowe białek i ich orientacyjne położenia.
1
Band
Frequencies range [cm-1]
Amide A
3300
sterching N-H
Amide B
3100
Amide I
1600-1690
sterching N-H in the Fermi resonance
with the first overtone of amide II
sterching C=O, bendig N-H, sterching C-N
Amide II
1480-1580
Sterching C-N, bendig N-H
Amide III
1220-1300
sterching C-N, bendig N-H
Assignment
Na Rys. 2 przedstawiono jak powolna, wywołana wysoką temperaturą przemiana
konformacyjna α-helisy w antyrównoległą β-kartkę w modelowym polipeptydzie wpływa na
położenie i kształt najważniejszego diagnostycznie z tych pasm, jakim jest pasmo amid I. Typowe
zakresy częstości amid I odpowiadające różnym strukturom II-rzędowym zostały zebrane w Tabeli
2.
β-kartka
α-helisa
1720
1700
1680
1660
1640
1620
-1
Liczba falowa [cm ]
1600
Rys. 2. Widma absorpcyjne w podczerwieni – zakres pasma amid I – przedstawiają stopniową przemiane
konformacji α-helisy w antyrównoległą β-kartkę w poli(L-lizynie).
Zastosowanie spektroskopii w podczerwieni do badań białek napotyka jednak na poważny problem
gdy białko jest rozpuszczone w wodzie, ponieważ pik amid I jest wówczas zakryty znacznie
silniejszym pasmem pochodzącym od drgań deformacyjnych H-O-H (ok. 1650 cm-1). Dwa sposoby
pokonania tej przyszkody to (a) zastosowanie spektroskopii Ramana (pasmo H-O-H jest
praktycznie niewidoczne w widma ramanowskich), lub (b) zamiana H2O na D2O (pasmo D-O-D
jest przesuniete do ok. 1230 cm-1).
2
Tabela 2. Typowe położenia pasma amid I dla różnych struktut II-rzędowych białek.
Amide I location [cm-1]
Secondary structure
1650
α-helix
1632
β-sheet parallel
dublet 1620 (s) i 1690 (w)
β- sheet antyparallel
1655
random coil
1680
loop, β-hairpin
Wymiana H/D
Umieszczenie polipeptydu w środowisku wody ciężkiej pociąga za sobą dodatkowe
konsekwencje, z których najistotniejsza wiąże się z tzw. wymianą izotopową H/D (deuterowaniem
próbki). Atomy wodoru tworzące wiązania kowalencyjne z atomami elektroujemnych pierwiastków
(w przypadku białek dotyczy to głównie tlenu i azotu) ulegają ciągłej, dynamicznej wymianie
między sobą, co można obserwować podstawiając część z tych atomów innym izotopem. Proces ten
biegnie z reguły bardzo szybko (w skali ułamków sekundy), i – w zależności od natury chemicznej
biorących w nim udział grup chemicznych (np. wodoru w wiązaniu peptydowym i deuteru w D2O)
– przebiega według różnych mechanizmów, i może być katalizowany zarówno przez jony H3O+, jak
i OH-, co sprawia, że jego kinetyka silnie zależy od pH (pD). Wymiana H/D biegnie oczywiście w
kierunku najbardziej prawdopodobnego rozkładu obu izotopów pomiędzy różnymi molekułami w
układzie. Na przykład gdy C2H5OH zostanie wprowadzony do nadmiaru równomolowej mieszaniny
H2O i D2O w roztworze pojawią się zbliżone liczby molekuł C2H5OH i C2H5OD (atomy wodoru
połączone z atomami węgla nie ulegają wymianie). Proces wymiany izotopowej można śledzić
wszelkimi metodami, które są czułe na masy jąder (a więc m.in. spektroskopią absorpcyjną w
podczerwieni i Ramana), masy całych czasteczek (spektrometria mas) i na inne zmieniające się
wraz z zamianą izotopu tego samego pierwiastka właściwości fizyczne (np. właściwości
magnetyczne jąder atomowych przy pomocy spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego,
czy też różne trwałości tych jąder (np. para H i T) metodami radioizotopowymi).
W przypadku białek rozpuszczonych w D2O wymianie ulegają wszystkie atomy wodoru,
które tworzą wiązania z elektroujemnymi atomami (a więc atomy wodoru wiązań peptydowych,
aminokwasowych reszt bocznych takich jak –NH2, -COOH, -OH, -CONH2, etc.) pod warunkiem,
że są dostępne dla rozpuszczalnika. Tak więc pierwsze ulegają wymianie protony zlokalizowane na
powierzchni cząsteczki białka, a później te ukryte w jego głębi, co ilustruje Rys. 3a. Im stabilniejsza
i silniej upakowana struktura III-rzędowa białka tym wolniej zachodzi penetracja jego molekuł
przez wodę ciężką i tym wolniej przebiega proces wymiany H/D. Deuteracja białka będzie w
różnym stopniu przesuwać (ale zawsze w kierunku niższych energii) poszczególne pasma amidowe
3
w zależności od tego, jaką rolę odgrywa w danym drganiu masa atomu wodoru. I tak podstawienie
białka deuterem w pozycji wiązania peptydowego przesuwa pasmo amid I jedynie o 5-10 cm-1
(pasmo to jest zdominowane przez drgania rozciągające C=O), ale o około 100 cm-1 pasmo amid II,
w którym zginające drgania N-H mają duży udział. Pasmo amid A jest natomiast przesuwane o
kilkaset cm-1. Zróżnicowany wpływ wymiany H/D na pasma amid I i amid II przedstawia Rys. 3b.
(a)
(b)
O
O
C N
H
C N
D
Amidowe I
+ D2O
HDO
Amidowe II
1800
1700
1600
1500
1400
1300
Liczba falowa [cm-1]
Rys. 3. (a) Powolna penetracja molekuły białka przez wodę jest najwolniejszym etapem procesu wymiany H/D.
Wymienialne atomy wodoru zlokalizowane na powierzchni białka pierwsze wchodzą w kontakt z wodą ciężką i jako
pierwsze ulegaja podstawieniu deuterem. (b) Deuteracja białka w różnym stopniu wpływa na przesunięcie pasm
amidowych I i II. Przedstawione widma odpowiadają kolejnym etapom wymiany H/D pomiędzy włóknami insuliny
wołowej a wodą ciężką, w której zostały zawieszone.
Opisu ilościowego wpływu podstawienia izotopowego na położenie pasma wibracyjnego
można w najprostrzy sposób dokonać stosując model oscylatora harmonicznego: podstawienie
izotopowe zmienia masę zredukowaną, ale pozostaje praktycznie bez wpływu na stałą siłową.
Jedno z głównych zastosowań wymiany H/D w badaniach białek wiąże się z faktem, iż
upakowanie struktur III-rzędowych (spowalniajace deuterację) zależy od temperatury, ciśnienia,
obecności czynników denaturujących, takich jak mocznik, czy też destabilizujących mutacji
punktowych. Szybsza wymiana H/D jest obserwowalna już na przy lekkiej destabilizacji białka (np.
w temperaturze nieco niższej od temperatury denaturacji), tj. w warunkach, w których wciąż
4
stabilne pozostają struktury II-rzędowe (a zatem nie obserwowane są jeszcze jakiekolwiek zmiany
w obszarze pasma amid I).
Kolagen i żelatyna
Wymiana H/D oraz spektroskopia w podczerwieni mogą być wykorzystane do badania
utraty zwartości konformacyjnej, jaka następuje w toku przemiany kolagenu w żelatynę. Kolagen
jest jednym z najważniejszych białek strukturalnych tkanek łącznych o dość nietypowej
konformacji. Podstawowym II-rzędowym motywem włókien kolagenowych jest potrójna helisa
zbudowana z trzech oplatających się ze sobą łańcuchów polipeptydowych o takiej samej,
powtarzającej się sekwencji aminokwasowej: glicyna, prolina, hydroksyprolina. Helisa włókien
kolagenowych jest – w przeciwieństwie do α-helisy – lewoskrętna, nieco od niej luźniejsza, i ma
zupełnie inny układ wiązań wodorowych. We włóknach kolagenu sąsiednie helisy są ze sobą
miejscami kowalencyjnie połączone (via crosslink), co pozwala na budowanie bardzo elastycznych,
a przy tym wytrzymałych superstruktur. Wielogodzinna inkubacja kolagenu w wysokiej
temperaturze i silnie denaturującym środowisku niszczy jego strukturę, czego końcowym efektem
jest powstanie żelatyny. Proces ten ilustruje Rys. 4.
Rys. 4. Przemiana kolagenu w żelatynę wiąże się z nieodwracalnym zniszczeniem struktury potrójnej helisy.
Wykonanie ćwiczenia:
1. Na pojedyncze szkiełko CaF2 nanieść, a następnie wysuszyć bardzo cienką warstwę
roztworu żelatyny w H2O. Zarejestrować widmo FT-IR otrzymanego filmu. Po rejestracji
pierwszego widma nakroplić nań D2O i po krótkiej inkubacji ponownie wysuszyć, po czym
zarejestrować widmo.
2. Powtórzyć operacje opisane w punkcie 1 stosując roztwór żelatyny w D2O, oraz H2O do
nakraplania na film białka.
3. Przygotować zawiesinę kolagenu w H2O poprzez ok. 20 minutowe energiczne rozcieranie
szczypty liofilizowanego białka z wodą w moździerzu. Kilka kropli zawiesiny należy
nanieść na pojedyncze szkiełko CaF2, a następnie przygotować cienki, suchy i w miarę
możliwości jednorodny film w celu późniejszej rejestracji widm FT-IR – przed i po
nakraplaniu H2O.
5
4.
Powtórzyć operacje opisane w punkcie 3 stosując zawiesinę kolagenu w D2O, oraz
późniejsze zwilżanie za pomocą H2O.
Opracowanie wyników i ich dyskusja:
Wskaż pasma amid I, II, III oraz A w widmie niedeuterowanej żelatyny. Jak bardzo proces
deuteracji wpływa na przesunięcia spektralne tych pasm? Przeprowadź dyskusję obserwowanych
efektów w kontekście natury drgań związanych z poszczególnymi pasmami. Czy natywny kolagen
przechodzi proces wymiany H/D w podobnym do żelatyny stopniu? Jak wytłumaczyć obserwowane
różnice w świetle odmiennych struktur kolagenu i żelatyny?
Wymagania kolokwialne:
1)Ogólne podstawy spektroskopii molekularnej
- formy energii molekuł
- kwantowanie energii
- rozkład energii w stanie równowagi termicznej
- prawdopodobieństwo absorpcji i emisji promieniowania
- rodzaje spektroskopii
2)Widmo oscylacyjne
- model oscylatora harmonicznego; oscylator anharmoniczny
- energia oscylacji molekuł
- rodzaje drgań normalnych
- oddziaływanie promieniowania z oscylującymi molekułami
- aparatura do rejestracji widm oscylacyjnych
- zastosowanie spektroskopii oscylacyjnej
Literatura
1) Zbigniew Kęcki "Podstawy spektroskopii molekularnej" Wydawnictwo Naukowe PWN
lub Joanna Sadlej "Spektroskopia molekularna" Wydawnictwa Naukowo-Techniczne
2) Artykuły i materiały dodatkowe- dostępne u prowadzącego
Oprac. dr hab. Wojciech Dzwolak
6