Instrukcja do ćwiczeń Temat: Powietrze jako środowisko życia

Mikrobiologia ogólna
o
Biotechnologia medyczna II rok / I
Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii
Wydział Farmaceutyczny z
Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Instrukcja do ćwiczeń
Temat: Powietrze jako środowisko życia mikroorganizmów. Mikrobiologiczne badanie
powietrza i powierzchni płaskich – Cz.1/Cz.2.
I. Część teoretyczna
1.1. Bioaerozol
Wszystkie mikroorganizmy obecne w powietrzu występują w postaci bioaerozoli. Bioaerozol jest to układ dwu- lub
trójfazowy składający się z fazy rozpraszającej (powietrze) oraz rozproszonej (stałej lub ciekłej), zawierającej drobnoustroje.
Faza rozproszona bioaerozolu składa się z drobnych cząsteczek wody, substancji organicznych pochodzących od człowieka i
zwierząt oraz cząstek stałych - nasion, pyłków roślin, kurzu, komórek wegetatywnych i przetrwalników bakterii, fragmentów
strzępek grzybów i zarodników, komórek drożdży i wirusów. Zawiera również endotoksyny oraz produkty metabolizmu grzybów
- cząsteczki mikotoksyn, związane z komórkami lub innymi stałymi elementami bioaerozolu. Bioaerozole rozprzestrzeniają się w
środowisku różnymi sposobami:
- poprzez, tzw. drogę inhalacyjną, w momencie kaszlu, kichania, mówienia, w ten sposób rozprzestrzenia się głównie
mikroflora patogenna człowieka,
- przez przenoszenie cząstek aerozolu za pomocą prądów konwekcyjnych powietrza, ta droga jest charakterystyczna dla
drobnoustrojów powietrza atmosferycznego oraz w pomieszczeniach, w których panuje wymuszony ruch powietrza
(korytarze, budynki użyteczności publicznej),
- poprzez system wentylacyjno-klimatyzacyjny pomieszczeń, przykładem może być rozprzestrzenianie się bakterii
patogennych Legionella pneumophila w wilgotnych urządzeniach klimatyzacyjnych.
Czas przeżycia mikroorganizmów w powietrzu zależy od wielu czynników, przede wszystkim od genetycznie
uwarunkowanych cech gatunkowych, a nawet szczepowych, stanu fizjologicznego, wielkości oraz składu cząstek bioaerozolu,
liczby mikroorganizmów obecnych w bioaerozolu oraz od warunków klimatycznych, głównie wilgotności i temperatury
powietrza. Drobnoustroje w bioaerozolach mogą przetrwać znacznie dłużej niż pojedyncze komórki. Najdłużej pozostają przy
życiu, oporne na niekorzystne wpływy warunków atmosfery, spory grzybów, przetrwalniki bakterii, szczególnie tolerujące
niską wilgotność. Ze względu na skład jakościowy aerozole biologiczne można podzielić na: saprofityczne i zakaźne, a także
mieszane, czyli składające się z dwóch wymienionych. Bioaerozole saprofityczne są odpowiedzialne za pogorszenie stanu
higienicznego powietrza, co wiąże się przede wszystkim z wywoływaniem alergii u ludzi, a także z psuciem się produktów
spożywczych, środków leczniczych, surowców dla wielu gałęzi przemysłu, materiałów budowlanych i innych. Bioaerozole
zakaźne wywołują wiele chorób roślin, zwierząt i ludzi. Należą do nich: błonica, gruźlica płuc, grypa, katar, krztusiec, odra, ospa
wietrzna, płonica, różyczka, grzybice oraz alergie. Ze względu na miejsce występowania bioaerozole dzielimy na zewnętrzne
(powietrze atmosferyczne) i wewnętrzne (powietrze wewnątrz pomieszczeń). Podział ten wynika z różnego składu ilościowego
mikroorganizmów w tych środowiskach oraz innych czynników kształtujących ten skład. Skład jakościowy mikroorganizmów
jest zbliżony w bioaerozolach zewnętrznych i wewnątrz pomieszczeń.
1.2. Powietrze atmosferyczne
Dominującą mikroflorą są grzyby strzępkowe, które stanowią około 70% wszystkich mikroorganizmów. Reprezentowane
są głównie przez Cladosporium, Alternaria, Aureobasidium, Penicillium, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Acremonium, Absidia,
Botrytis, Fusarium, Geotrichum, Paecilomyces, Scopulariopsis, Trichoderma, Ulocladium. Ponadto obserwuje się sezonową
dominację określonych rodzajów grzybów strzępkowych. Maksymalne stężenie popularnych aeroalergenów z rodzaju
Cladosporium i Altemaria stwierdza się w lipcu i sierpniu; spory tych grzybów stanowią wtedy ponad 90% wszystkich spor
obecnych w powietrzu atmosferycznym. Udział ilościowy bakterii waha się od 18 do 20%. Najczęściej spotykane są bakterie
saprofityczne z rodzaju Micrococcus, Achromobacter i Bacillus. Bakterie z rodzaju Micrococcus stanowią od 30 do 70%
wszystkich bakterii obecnych w powietrzu. Drugą liczną grupą są bakterie przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus, ich udział
wynosi od 20 do 60%. Zwykle około 5% bakterii wyizolowanych z powietrza stanowią promieniowce, pochodzące głównie z
gleby. Drożdże są najczęściej reprezentowane przez rodzaje Torulopsis, Rhodotorula, Candida, Saccharomyces, lecz stanowią
zaledwie 5% ogólnej liczby mikroorganizmów obecnych w powietrzu atmosferycznym.
1
1.3. Powietrze pomieszczeń zamkniętych
Wśród mikroflory zanieczyszczającej powietrze pomieszczeń zamkniętych przeważa mikroflora saprofityczna. Najczęściej
występują bakterie należące do rodzajów Micrococcus (ponad 42% izolatów), Staphylococcus (38,8%), Bacillus (10%), stanowiące w tym środowisku 68-80% wszystkich mikroorganizmów. Występować mogą również bakterie z rodzajów: Aeromonas,
Mycobacterium, Pseudomonas, Xantomonas, Ochrobactrum, Pasteurella, Sphingomonas. W powietrzu o wysokiej wilgotności
4
3
względnej (powyżej 70%) mogą być obecne promieniowce w ilości od 7 do 5,3x10 jtk/m powietrza. Najczęściej występują
gatunki należące do rodzajów: Streptomyces i Nocardia. Promieniowce mogą stanowić nawet 25-40% ogólnej liczby bakterii w
powietrzu. Drobnoustroje te wydzielają do powietrza silne aromatyczne związki lotne, które mogą być przyczyną powstania
objawów "Zespołu Chorego Budynku" (ang. .Sick Building Syndrome" - SBS).
Występowanie spor grzybów strzępkowych w powietrzu pomieszczeń zamkniętych wynika z możliwości doskonałej
adaptacji grzybów do warunków tam panujących. W powietrzu pomieszczeń zagrzybionych najczęściej występują pleśnie
wywołujące alergię, z rodzajów Penicillium (częstotliwość izolacji w zależności od rodzaju pomieszczeń 45-90%), Cladosporium
(22-73%), Aspergillus (17-52%), Altemaria (3-5%) i inne. Niepokojąca jest również obecność w tych pomieszczeniach grzybów
toksynotwórczych, takich jak Aspergillus versicolor, A. flavus, A. ochraceus, Stachybotrys atra.
II. Część praktyczna
2.1. Analiza mikrobiologiczna powietrza
Schemat I – oznaczanie liczby bakterii
wg. PN-89/Z-04111/02 (Ochrona czystości powietrza. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie liczby bakterii w powietrzu
atmosferycznym (imisja) przy pobieraniu próbek metodą aspiracyjną i sedymentacyjną).
Przygotować podłoża
Ogólna liczebność
bakterii
Agar odżywczy
Promieniowce
Podłoże Pochona
Pseudomonas
fluorescens
Podłoże Kinga B
Gronkowce
hemolizujące *
Gronkowce
mannitolododatnie
i mannitoloujemne **
Agar na bulionie
z krwią baranią
Podłoże Chapmana
otworzyć płytki na określony czas (5, 10, 15 min)
(w pomieszczeniu zamkniętym i na zewnątrz budynku)
inkubacja
o
temp 37 C, 24-48 h
o
temp 26 C, 5 dni
o
temp 26 C, 5 dni
o
temp 4 C, 7 dni
o
o
4 płytki w temp. 37 C temp 37 C, 24-48 h
(2 pł. przez 18-24 h
2 pł. po 1 h przenieść
o
do 10 C na 18 h)
WYNIK
3
policzyć kolonie na poszczególnych płytkach i obliczyć ilość bakterii w 1 m powietrza wg wzoru
o
* - hemolizę α liczyć na podłożu w temp. 37 C
o
* - hemolizę β na podłożu w temp. 10 C
** - szczepy mannitolododatnie: kolonie duże, 1-3 mm, otoczone żółtą strefą
** - szczepy mannitoloujemne: kolonie mniejsze, białe i bez zabarwienia podłoża
*,** - wykonać potwierdzenie obecności gronkowców i wykonać preparaty barwione metodą Grama (do obliczeń wybrać
te kolonie z których preparaty wykazały obecność komórek kulistych, Gram dodatnich, występujących na ogół w
nieregularnych skupiskach – gronach.
4
2
X = 5 x 10 x c / Πr x t
c– średnia liczba kolonii bakterii na płytkach
r – promień płytki Petriego, cm
t – czas ekspozycji, min
3
4
5 x 10 – współczynnik przeliczeniowy dla uzyskania liczby bakterii w 1 m powietrza
Wynik końcowy:
Obliczyć liczbę oznaczanych bakterii i dokonać klasyfikacji zanieczyszczenia powietrza wg odpowiednich tabel.
2
Schemat II – oznaczanie liczby grzybów
wg. PN-89/Z-04111/03 (Ochrona czystości powietrza. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie liczby grzybów mikroskopowych w
powietrzu atmosferycznym (imisja) przy pobieraniu próbek metodą aspiracyjną i sedymentacyjną).
Przygotować podłoża
3 płytki
z pożywką brzeczkowo-agarową
3 płytki
z podłożem Czapek-Doxa (lub Sabourauda)
otworzyć płytki w miejscu badania
na okres 5, 10 i 15 minut (w pomieszczeniu zamkniętym i na zewnątrz budynku)
inkubacja
o
temp. 26 C przez 3-5 dni
(w razie słabego wzrostu czas inkubacji przedłużyć do 7 dni)
3
policzyć wyrosłe kolonie grzybów i obliczyć liczbę grzybów w 1 m powietrza wg wzoru:
4
2
X = a x 10 / Πr x 0,2 x t
a – średnia liczba kolonii grzybów
r – promień płytki Petriego, cm
t – czas ekspozycji, min
0,2 – współczynnik przeliczeniowy
Wynik końcowy:
Obliczyć liczbę oznaczanych grzybów i dokonać klasyfikacji zanieczyszczenia powietrza wg odpowiednich tabel.
2.2. Ocena sanitarna otoczenia
·
·
·
·
·
·
·
Zwilżyć sterylny tampon z waty w roztworze soli fizjologicznej (50 ml)
Wykonać wymazy z powierzchni stołu i dłoni o znanych wymiarach ograniczonej sterylnym
szablonem
Tampon wrzucić do buteleczki z płynem fizjologicznym i dokładnie wytrząsnąć przez ok. 30
sekund (rozcieńczenie 100)
Wykonać szereg dziesięciokrotnych rozcieńczeń zawiesiny wyjściowej (10-1 i 10-2)
Z zawiesiny wyjściowej i kolejnych rozcieńczeń pobrać po 1ml i przenieść do sterylnej płytki
Petriego, a następnie zalać agarem odżywczym (ok. 15 ml) i pozostawić do zestalenia
Płytki odwrócić i poddać inkubacji w temp. 30oC przez okres 72h
Po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie i podać ich liczbę na 1 cm2 wg wzoru:
X=axV/p
gdzie:
a – liczba koloni wyrosłych na płytce z agarem odżywczym (należy uwzględnić stopień
rozcieńczenia)
V – objętość soli fizjologicznej użytej do wypłukania tamponu z waty
p – powierzchnia (cm2), z której pobrano wymaz
3
Tabela. Mikroorganizmy występujące w powietrzu pomieszczeń zamkniętych
Tabela. Dopuszczalny stopień mikrobiologicznego zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego oraz
różnych pomieszczeń (wg Krzysztofika, 1992).
4
Tabela. Zanieczyszczenie mikrobiologiczne powietrza w pomieszczeniach produkcyjnych
Tabela. Stan mikrobiologiczny powietrza atmosferycznego
Tabela. Klasyfikacja zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego bakteriami wg PN 89/Z-04111/02
Tabela. Klasyfikacja zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego grzybami wg PN 89/Z-04111/03
5
6