Próbka badana

ĆWICZENIE IV
Autor i główny prowadzący dr Dorota Korsak
WYKRYWANIE OBECNOŚCI BAKTERII Z RODZAJU LISTERIA W ŻYWNOŚCI
Wstęp
Rodzaj Listeria należy do typu Firmicutes wspólnie z rodzajem Staphylococcus,
Streptococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Bacillus oraz Clostridium. Listeria
monocytogenes, główny przedstawiciel tego rodzaju, jest jednym z sześciu gatunków
należących do tego rodzaju. Pozostałe gatunki to: L. seeligeri, L. ivanovii, L. innocua, L.
welshimeri oraz L. grayi.
Wśród wyżej wymienionych gatunków tylko dwa są patogenne i są to: L. monocytogenes
będący patogenem zarówno ludzi jak i zwierząt oraz L. ivanovii infekująca zwierzęta, głównie
owce i bydło. Pojawiają się również nieliczne raporty, w których opisywane są przypadki
listeriozy u ludzi wywołanej przez L. ivanovii i L. seeligeri.
L. monocytogenes to mała (0,5-2 μm długości i 0,4-0,5 μm szerokości) gramdodatnia
ieprzetrwalnikująca pałeczka, wykazująca tendencję do polimorfizmu. W zakresie temperatur
20-25 oC bakteria ta jest zdolna do ruchu przy pomocy rzęsek. Jednak w temperaturze 37 oC
produkcja flageliny (białka budującego rzęskę) jest ograniczona, co powoduje brak zdolności
poruszania się Bakteria ta jest względnym tlenowcem. Jest katalazo-dodatnia, oksydazoujemna. Wytwarza również β–hemolizynę tworzącą strefy przejaśnienia na krwawym agarze
L. monocytogenes jest bakterią powszechnie bytującą w środowisku naturalnym.
Występuje w glebie, wodzie, roślinach, ściekach, w przewodach pokarmowych wielu
gatunków zwierząt domowych i dzikich. Drobnoustrój ten rośnie w bardzo szerokim zakresie
temperatur (1-45oC), pH (4,3-9,6), toleruje wysokie stężenia soli (do 10%) i niską aktywność
wodną 0,83. Konsekwencją powszechnego występowania tego mikroorganizmu w
środowisku, jego relatywnie wysokiej odporności na czynniki fizyko-chemiczne, a także
wyjątkowej w świecie bakterii zdolności nie tylko do przeżycia, ale również do namnażania
się w szerokim zakresie temperatur, jest jego obecność w surowcach zwierzęcych i roślinnych
oraz produktach spożywczych. Szacuje się, że 99% przypadków listeriozy u ludzi jest
spowodowanych spożyciem żywności zanieczyszczonej tym drobnoustrojem. Częsta
obecność L. monocytogenes w żywności w połączeniu z wysoką śmiertelnością w wyniku
infekcji wywołanej przez ten patogen (sięgającą od 20 do 30%) zdecydowanie wyróżnia
listeriozę spośród innych zatruć pokarmowych i stanowi poważny publiczny problem
zdrowotny.
Celem ćwiczenia jest wykrycie obecności bakterii z rodzaju Listeria, w tym
L. monocytegens w różnych rodzajach żywności zgodnie z procedurą opisaną w normie
„Horyzontalna metoda wykrywania
obecności i oznaczania liczby
Listeria
monocytogenes PN –EN ISO 11290-1999/A1:2005. Metoda wykrywania obecności”
Wykrywanie obecności L. monocytogenes w próbkach żywności obejmuje kilka etapów:
I. Wstępne namnażanie w płynnej pożywce „pół-selektywnej” – bulion pół-Fraser
II. Namnażanie wtórne w płynnej pożywce selektywnej – bulion Fraser
III. Różnicowanie na podłożach agarowych – agar ALOA, agar Palcam lub Oxford
IV. Identyfikacja na podstawie testów biochemicznnych
I. Schemat badania
1.
Odważyć odpowiednią naważkę badanej próbki żywności.
Próbka badana
( x g lub x ml )
9 x pożywki płynnej selektywnej
podczas inkubacji – zaczernienie pożywki
bulion pół Frasera
(inkubacja 30C, 24 godz.±2)
0,1 ml hodowli
2.
10 ml bulion Frasera
(inkubacja 37C, 48 ± 2 godz)
Agar Oxford
lub Palcam
3.
Agar ALOA
Agar ALOA
Agar Oxford lub Palcam
Posiew Agar ALOA - inkubacja w 37C przez 24 godz.±3 do 48 godz.±3
Agar Oxford lub Palcam – inkubacja w temperaturze zalecanej przez producenta przez 24
godz.±3 do 48 godz.±3
agar ALOA – zielononiebieskie kolonie otoczone mętną strefą lub nie
agar Oxford - kolonie szare, otoczone strefą zaczernienia, 1mm średnicy, po 48 godz. ciemnoszare z
zielonkawym odcieniem, pępkowate zagłębienie z wyraźną strefą zaczernienia wokół kolonii.
agar Palcam – kolonie małe lub bardzo małe, oliwkowozielone lub szarozielone, czasami z czarno
zabarwionym środkiem, zawsze z czarną otoczką. Po 48 godz. zielone kolonie, średnicy od 1.5
mm do 2 mm z charakterystycznym wgłębieniem w środku.
4. Testy potwierdzające
Z każdej pożywki agarowej pobrać po 1 podejrzanej kolonii
Posiew rysowy na podłoże agarowe TSYEA
(inkubacja 37C, 18-24 godz. )
kolonie wypukłe, bezbarwne, nieprzezroczyste
4.1 Testy potwierdzające dla Listeria sp.
Katalaza - dodatnia
TSYEA
Barwienie Grama - G +, cienkie, krótkie pałeczki
Zdolność ruchu
(inkubacja 25C, 8– 24 godz.)
do zmętnienia pożywki
Wykrywanie katalazy
Pobrać pełne oczko hodowli wyrosłej na TSYEA i zawiesić w kropli roztworu nadtlenku
wodoru na czystym szkiełku mikroskopowym.
Wynik testu jest dodatni, jeżeli w ciągu 30 s pojawią się pęcherzyki gazu.
Kontrola dodatnia - Staphylococcus aureus
Kontrola ujemna – Enterococcus faecalis
Test na wykrywanie zdolności ruchu
Posiew kłuty, za pomocą igły inokulacyjnej agaru półpłynnego materiałem pobranym z
pożywki TSYEA. Posiewy inkubować w cieplarce w temperaturze 25oC przez 48 godz.
4.2 Testy potwierdzające dla L. monocytogenes
Test na hemolizę
Pobrać materiał z podłoża TSYEA, a następnie posiać na podłoże agar z krwią,
wykonując jednocześnie w przypadku każdej hodowli posiew kłuty w jednym miejscu.
Hodowle inkubować w cieplarce w temperaturze 37 oC przez 24 godz.
Test Camp
Pobrać materiał z podłoża TSYEA, a następnie posiać na podłoże agar z krwią zgodnie ze
schematem przedstawionym poniżej.
Hodowle inkubować w cieplarce w temperaturze 37 oC przez 24 godz.
S - Staphylococcus aureus ATCC 25923
R - Rhodococcus equi ATCC 6939
R
S
Fermentacja ramnozy i ksylozy
Pobrać materiał z podłoża TSYEA, a następnie posiać na podłoże płynne uzupełnione
odpowiednim cukrem. Hodowle inkubować w cieplarce w temperaturze 37 oC przez 24 godz.
Po przeprowadzeniu badania stwierdzić, czy w analizowanej próbce
a) obecne były bakterie z rodzaju Listeria
b) określić gatune
II Metody molekularne
1.1. Izolacja DNA metodą lizy termicznej
Pobrać kilka kolonii bakteryjnych z podłożu TSYEA i zawiesić w 20 l roztworu 0,25% SDS i
0,05 NaOH. Całość inkubować w 95 oC przez 15 minut, a następnie dodać 180 l zimnej
redestylowanej jałowej wody. Zawiesinę wirować 3 minuty przy 13,4 obrotów/min. Supernatant jest
źródłem totalnego DNA.
1.2. Określenie przynależności gatunkowej badanych szczepów Listeria spp. metodą PCR
W celu określenia przynależności gatunkowej przeprowadzić reakcję amplifikacji DNA metodą
PCR stosując odpowiednią parę starterów. Startery, amplifikowane fragmenty genów i wielkość
powstających produktów przedstawiono w Tab. 1.
Matrycą w reakcji amplifikacji jest DNA otrzymany metodą lizy termicznej. Końcowa objętość
mieszaniny reakcyjnej wynosi 25 l, jej skład przedstawiono w Tab.2.
Warunki reakcji amplifikacji:
wstępna denaturacja: 95 oC, 4 min,
30 cykli:
denaturacja - temp. 94 oC , 30 s;
przyłączanie starterów - temp. 60 oC , 30 s;
synteza DNA - temp 72 oC, 1 min.
Ostatni etap reakcji: 7-minutową synteza w 72 oC w celu wypełnienia jednoniciowych końców
zamplifikowanych fragmentów.
Tab.1
Starter
Gatunek
Produkt amlifikacjii genu
LisI-F
LisI-R
?
potencjalny regulator
transkrypcji
453
?
N-acetylomuramidaza
493
?
iap
250
LisII-F
LisII-R
LisIII-F
LisIII-R
Produkt
(pz)
Tab.2
Składnik
woda redestylowana
Ilość składnika na
1 x próbę
18.3l
bufor do polimerazy
2,5 l
mieszanina dNTP
odpowiedni starter F
odpowiedni starter R
polimeraza Taq
matryca DNA
1 l
1 l
1 l
0.2 l
1 l
Stężenie końcowe
składnika
400 M
400 nM
400 nM
1U
-
1. 3. Analiza produktów amplifikacji PCR
Elektroforeza DNA w żelu agarozowym
Rozdział elektroforetyczny prowadzić w 1 % żelu agarozowych w buforze TAE przez 50 min przy
napięciu 120 V. Na żel agarozowy nanieść po 10 l odpowiedniej próby, do której wcześniej dodano
barwnik do elektroforezy. Po zakończeniu rozdziału żel wybarwić w wodnym roztworze bromku
etydyny przez 10–15 min i oglądać UV.