materiały

Ćwiczenie 11
Wykrywanie antybiotyków o aktywności przeciwgrzybiczej w hodowli promieniowców
Streptomyces coelicolor
Cel ćwiczenia:
Biosynteza, detekcja i ocena aktywności przeciwgrzybiczej antybiotyków w hodowli S.
coelicolor.
Materiał:
szczep badany: Streptomyces coelicolor PCM 2324 (Waksman i Henrici, 1948)
szczepy wzorcowe: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae
Podłoże produkcyjne dla S. coelicolor (I):
bacto-pepton
10 g
hydrolizat kazeiny 2 g
ekstrakt drożdżowy 2 g
NaCl
6g
glukoza
20 g
woda
1000 ml; pH=7,5
(podłoże zestalone: 20 g agaru na 1000 ml pożywki)
Podłoże produkcyjne dla S. coelicolor (II):
mannitol
20 g
mąka sojowa
20 g
woda
do 1000 ml
(podłoże zestalone: 20 g agaru na 1000 ml pożywki)
Podłoże MYPG (dla C. albicans i drożdży)
wyciąg słodowy
3,0 g
wyciąg drożdżowy 3,0 g
pepton
5,0 g
glukoza
20,0 g
woda
do 1000 ml
(podłoże zestalone: 20 g agaru na 1000 ml pożywki)
Wykonanie ćwiczenia:
A. Analiza morfologiczna i mikroskopowa S. coelicolor
Obejrzeć płytki z hodowlą na podłożach stałych pod mikroskopem stereoskopowym. Opisać
morfologię ogólną kolonii, rozróżnić grzybnię substratową i powietrzną, wykonać rysunek.
Wykonać preparat mikroskopowy, utrwalić w płomieniu, wybawić fioletem krystalicznym.
Oglądać pod imersją, wykonać rysunek. Opisać wygląd hodowli płynnej.
1
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
Przeanalizować płytki z 2-, 5-, 7-, 10-, 15- i 20-dniową hodowlą na podłożu produkcyjnym II.
Opisać wygląd kolonii promieniowca. Zwrócić uwagę na zmiany barwy w odniesieniu do
czystego podłoża.
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
B. Biosynteza antybiotyków i analiza spektrofotometryczna mieszaniny
pofermentacyjnej
1. Zmyć zarodniki S. coelicolor solą fizjologiczną ze skosu i przenieść do kolby z 50 ml
płynnego podłoża produkcyjnego I. Inkubować z wytrząsaniem przez 2 doby w temp.
28°C.
2. Przenieść po 10 ml hodowli do nowych kolb z 200 ml podłoża produkcyjnego I dla S.
coelicolor. Inkubować przez 5 dni z intensywnym wytrząsaniem (w temp. 30°C).
3. Odwirować 10 ml mieszaniny pofermentacyjnej (10 min., 10 000 g).
2
4. Przenieść 5 ml nadsączu do nowej probówki i dodać 3 ml butanolu. Zakręcić i wytrząsać
intensywnie przez 15 min.
5. Rozdzielić fazy przez odwirowanie próbki (5 min., 3000 g). Przenieść fazę organiczną do
nowej probówki – zwrócić uwagę na zmianę barwy (wywołana obecnością
antybiotyków).
6. Zmierzyć absorbancję dla fazy organicznej i wodnej w zakresie 300-700 nm. Wykreślić
widmo i zaznaczyć maksima absorpcji promieniowania.
C. Badanie aktywności biologicznej
1. Wykonać posiew murawkowy szczepów wzorcowych (C. albicans, S. cerevisiae) na
dwóch płytkach z agarem MYPG.
2. Płytki odpowiednio opisać i umieścić na nich krążki bibułowe nasączone:
a. medium pofermentacyjnym z hodowli S. coelicolor na podłożu hodowlanym
b. medium pofermentacyjnym z hodowli S. coelicolor na podłożu produkcyjnym (I)
c. warstwą butanolową ekstraktu z medium pofermentacyjnego (podłoże I)
d. butanolem
e. krążki nietraktowane żadnym czynnikiem.
3. Inkubować płytki przez 24 lub 48 h w temperaturze 30°C.
4. Ocenić stopień zahamowania wzrostu kolonii C. albicans i S. cerevisiae.
Wyniki:
Tabela. Pomiar stref zahamowania wzrostu szczepów wzorcowych
Średnica stref zahamowania wzrostu [mm]
medium
warstwa
pofermentacyjne
butanolowa
butanol
czyste krążki
C. albicans
S. cerevisiae
Wnioski:
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
3