Zajęcia 4 liczba godzin Seminarium Fizjologia drobnoustrojów

Zajęcia 4 liczba godzin Seminarium Fizjologia drobnoustrojów

MIKROBIOLOGIA I IMMUNOLOGIA
dla studentów II roku studiów I st.
na kierunku KOSMETOLOGIA
Zajęcia 4
Seminarium Fizjologia drobnoustrojów – wymagania metaboliczne bakterii. Rodzaje podłóż
mikrobiologicznych. Zasady hodowli drobnoustrojów (zawartość składników
odżywczych w podłożu, pH, ciśnienie osmotyczne, temperatura, potencjał oksydoredukcyjny, czas).
Ćwiczenia Badanie wybranych właściwości biochemicznych bakterii – Wykonywanie
posiewu na podłożach mikrobiologicznych. Opis morfologii kolonii bakteryjnych.
liczba godzin
1
1
Zagadnienia do zajęć 4.
1. Wymagania metaboliczne bakterii.
2. Rodzaje podłóż mikrobiologicznych - podział ze względu na skład, konsystencję, funkcje:
- naturalne, półsyntetyczne, sztuczne,
- płynne, półpłynne, stałe,
- proste, wzbogacone, specjalne, wybiórcze, różnicujące, wybiórczo-różnicujące, wybiórczonamnażające, transportowe, transportowo-wzrostowe
3. Zasady hodowli drobnoustrojów (zawartość składników odżywczych w podłożu, pH, ciśnienie
osmotyczne, temperatura, potencjał oksydo-redukcyjny, czas).
4. Techniki posiewów na podłożach płynnych i stałych.
5. Opis morfologii kolonii bakteryjnych (kształt, wielkość, brzeg, powierzchnia, struktura, kolor,
przejrzystość, konsystencja, zapach, inne np. typ hemolizy).
6. Typy wzrostu bakterii na podłożach płynnych.
7. Materiały zapasowe i przetrwalniki bakteryjne.
lp. Ćwiczenia praktyczne
1 Opisać morfologię dwóch wybranych kolonii drobnoustrojów wyrosłych na agarze odżywczym
(wybrać dowolną płytkę z ćwiczenia 3).
Opis morfologii kolonii bakteryjnych powinien obejmować następujące dane: kształt, wielkość, kolor,
brzeg, powierzchnia, struktura, przejrzystość, (konsystencja, zapach)
kolonia 1
.............................................................................................................................................................................
.............................................................................................................................................................................
.............................................................................................................................................................................
kolonia 2
.............................................................................................................................................................................
.............................................................................................................................................................................
.............................................................................................................................................................................
1
2
A
Właściwości biochemiczne- wykorzystywanie różnych źródeł węgla i azotu przez bakterie
Źródła węgla:
A.1. Badanie właściwości glikolitycznych - mały szereg cukrowy
Aby zbadać właściwości glikolityczne bakterii do pożywki zawierającej wybrany cukier wprowadza się
testowany mikroorganizm i przeprowadza inkubację w temperaturze 37°C, przez 24-48 godzin. Po okresie
inkubacji sprawdza się, czy cukier zawarty w pożywce został wykorzystany przez bakterie.
Jeśli nastąpi bakteryjny rozkład cukru dochodzi do zakwaszenia (obniżenia pH) pożywki przez akumulujące
się produkty przemian metabolicznych – kwasy organiczne. Ponieważ w skład pożywki wchodzi wskaźnik
pH, tj. związek zmieniający zabarwienie pod wpływem zmiany pH – zmiana barwy pożywki informuje o
zmianie pH związanej z rozkładem cukru.
Wskaźnik pH: ........................................................................
Wyjściowa barwa pożywki: ....................................................
Barwa podłoża świadcząca o wykorzystaniu badanego cukru (wynik dodatni): ...............................................
pożywka czysta
pożywka zaszczepiona Escherichia coli
woda peptonowa z 1%
glukozą
maltozą
mannitolem
sacharozą
laktozą
Wnioski:......................................................................................................................................................................
.....................................................................................................................................................................................
A.2. Badanie zdolności do beztlenowego rozkładu laktozy - woda peptonowa z 10% laktozą pod parafiną
Aby zbadać zdolność bakterii do beztlenowego rozkładu laktozy do pożywki zawierającej laktozę
wprowadza się testowany mikroorganizm, na zaszczepioną pożywkę nanosi się płynną sterylną parafinę
celem stworzenia warunków beztlenowych i przeprowadza inkubację w temperaturze 37°C, przez 24-48
godzin. Po okresie inkubacji sprawdza się, czy cukier zawarty w pożywce został wykorzystany przez
bakterie.
Jeśli nastąpi beztlenowy, bakteryjny rozkład laktozy dochodzi do zakwaszenia (obniżenia pH) pożywki
przez akumulujące się produkty przemian metabolicznych. Ponieważ w skład pożywki wchodzi wskaźnik
pH – zmiana barwy pożywki informuje o zmianie pH związanej z rozkładem cukru.
Wskaźnik pH: .........................................................................
Wyjściowa barwa pożywki: ....................................................
Barwa podłoża świadcząca o beztlenowym wykorzystaniu laktozy (wynik dodatni): .......................................
pożywka zaszczepiona
pożywka zaszczepiona
pożywka czysta
pożywka
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
woda peptonowa
z 10% laktozą pod
parafiną
Wnioski:......................................................................................................................................................................
.....................................................................................................................................................................................
2
A.3. Badanie zdolności do rozkładu skrobi - agar skrobiowy
Wykonanie posiewu redukcyjnego na płytkach z agarem skrobiowym
płytka 1: Escherichia coli,
płytka 2: Bacillus subtilis
- płytki inkubować w temperaturze 37ºC, do 7 dni, do góry dnem
- po okresie inkubacji na powierzchnie płytek nakropić płyn Lugola, żółte zabarwienie wokół bakterii
świadczy o wykorzystaniu skrobi, zabarwienie granatowe – brak rozkładu
- określić, który z badanych gatunków bakterii posiada zdolność hydrolizy skrobi
podłoże z Escherichia coli
podłoże z Bacillus subtilis
podłoże
agar skrobiowy
Wnioski:......................................................................................................................................................................
.....................................................................................................................................................................................
B Źródła azotu
B.1. Rozkład mocznika - podłoże Christensena
Mocznik może stanowić źródło azotu dla bakterii posiadających enzym umożliwiający hydrolizę tego
związku, tj. ureazę. Przy udziale ureazy mocznik jest rozkładany do dwutlenku węgla i amoniaku. Aby
zbadać zdolność bakterii do rozkładu mocznika testowany mikroorganizm wprowadza się do pożywki
Christensena zawierającej mocznik jako jedyne źródło azotu i przeprowadza inkubację w temperaturze
37°C, przez 24-48 godzin. Po okresie inkubacji sprawdza się, czy mocznik zawarty w pożywce uległ
rozkładowi pod wpływem bakteryjnej ureazy.
Jeśli nastąpi bakteryjny rozkład mocznika dochodzi do alkalizacji (wzrostu pH) pożywki wskutek
uwalniania amoniaku. Ponieważ w skład pożywki wchodzi wskaźnik pH – zmiana barwy pożywki
informuje o zmianie pH związanej z rozkładem mocznika.
Wskaźnik pH - ...............................................................
Wyjściowa barwa pożywki: ...........................................
Barwa podłoża świadcząca o hydrolizie mocznika (wynik dodatni): ..............................................
pożywka czysta
pożywka zaszczepiona Pseudomonas aeruginosa
pożywka
podłoże Christensena
Wnioski:......................................................................................................................................................................
.....................................................................................................................................................................................
3
Przykład podłoża wybiórczo-różnicującego - opis wzrostu bakterii na podłożu Chapmana
Podłoże Chapmana jest podłożem umożliwiającym różnicowanie gronkowców zawierającym:
Czynnik wybiórczy: 7,5% NaCl, - hamujący wzrost większości bakterii, szczególnie Gram-ujemnych
Czynnik różnicujący: ..........................................,
Wskaźnik pH: ......................................................
Wyjściowa barwa podłoża: .................................
Barwa podłoża świadcząca o rozkładzie mannitolu: .............................
podłoże ze
podłoże ze
podłoże czyste
podłoże
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
podłoże Chapmana
Wnioski:......................................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................................
3
4
Prezentacja testu API
Test API jest testem biochemicznym umożliwiającym identyfikację gatunku mikroorganizmu. Składa się
z 20 miniprobówek z przezroczystego tworzywa wtopionych w pasek również wykonany z tworzywa.
W każdej miniprobówce znajduje się odwodniony substrat i wskaźnik umożliwiający odczytanie reakcji.
Oznaczenie polega na dodaniu zawiesiny badanych bakterii do wszystkich probówek i po inkubacji dodaniu
do niektórych probówek odpowiednich odczynników. Zmiany barwy zawartości probówek umożliwiają
określenie, jakie substraty są rozkładane, czy też jaki rodzaj aktywności enzymatycznej występuje.
Określenie grupy lub gatunku dokonuje się na podstawie załączonego przez producenta klucza
diagnostycznego. Do odczytu służy książka kodowa lub program komputerowy.
4