Badanie zawartości morfiny w płynach ustrojowych osób po

Badanie zawartości morfiny w płynach ustrojowych osób po

Mariola Burstein
Badanie zawartości morfiny
w płynach ustrojowych osób po spożyciu
produktów spożywczych zawierających mak
oraz jej oznaczanie w tych wyrobach
Mak jest jedn¹ z najstarszych roœlin rolniczych, któkontrolê zasiewów, a tak¿e likwidacjê nielegalnych
rej œlady uprawy s¹ spotykane w wykopaliskach archeplantacji.
ologicznych z czasów prehistorycznych. WykorzystyZgodnie z Ustaw¹ o przeciwdzia³aniu narkomanii
wano go w celu pozyskania œrodków odurzaj¹cych,
uprawa maku, z wyj¹tkiem maku niskomorfinowego,
zw³aszcza opium, którym handel w wiekach
mo¿e byæ prowadzona wy³¹cznie na potrzeby przemyXVII–XIX przyczyni³ siê do rozwoju francuskich i ans³u farmaceutycznego i nasiennictwa. Mak mo¿na progielskich kolonii w Indiach. W Europie do XIX wieku
dukowaæ na podstawie umowy kontraktacyjnej i uzymak uprawiano na potrzeby domowe oraz jako roœlinê
skanego z urzêdów gmin p³atnego pozwolenia na upraozdobn¹. Po II wojnie œwiatowej nast¹pi³ wzrost area³u
wê [2].
jego uprawy.
Aktualne zapotrzebowanie na nasiona maku na rynDo rodzaju mak (Papaver) nale¿y oko³o stu gatunku krajowym nie jest pokrywane przez rodzimych proków ró¿ni¹cych siê wieloma cechami, m.in. pokrojem
ducentów. Jest to spowodowane przede wszystkim
roœliny, kolorem i kszta³tem p³atków korony, kszta³tem
wprowadzeniem zakazu uprawy maku wysokomorfinomakówki, barw¹ i sk³adem chemicznym nasion oraz
wego, œcis³ej kontroli jego uprawy i rejonizacji. W 2001
zawartoœci¹ alkaloidów w roœlinie. Znaczenie rolnicze
ma mak lekarski (Papaver somniTabela 1
ferum L.). Najbardziej rozpoZestawienie odmian maków niskomorfinowych w Rejestrze Odmian
wszechniony jest jego podgatunek
Varieties of low morphine poppies registered on Variety Index
euroazjatycki – ssp. euroasiaticum
o torebkach zamkniêtych pod tarOdmiana
Rok
ZawartoϾ morfiny
Barwa kwiatów
cz¹ znamienia i nieosypuj¹cych
Hodowca rejestracji w makowinach [%]
siê nasionach.
Obecnie w Polsce, w celu uzyPRZEMKO
bia³e z fioletowym
1990
< 0,06
oczkiem
skania nasion bêd¹cych surow- IHAR Poznañ we wspó³pracy
z ZD HAR Borowo
cem w przemyœle cukierniczym
i piekarniczym, uprawiany jest wyMIESZKO
ciemnoró¿owe
³¹cznie mak niskomorfinowy.
ZD HAR Borowo we
1999
< 0,04
z jasnofioletowym,
wspó³pracy z IHAR Poznañ
oczkiem
W 1990 r. zarejestrowano jego
pierwsz¹ odmianê – Przemko,
MICHA£KO
charakteryzuj¹c¹ siê bardzo nisk¹
IHAR Poznañ we wspó³pracy
1999
< 0,04
bia³e z fioletowym
zawartoœci¹ alkaloidów morfinoz ZD HAR Borowo
oczkiem
wych w dojrza³ych makówkach.
RUBIN
ciemnoró¿owe
W nastêpnych latach wyhodowano
ZD HAR Borowo we
2000
< 0,04
z jasnofioletowym,
kolejne odmiany maków niskomorwspó³pracy z IHAR Poznañ
oczkiem
finowych, które zosta³y zapisane
w Rejestrze Odmian [1] (tab. 1).
AGAT
ró¿owe
ZD HAR Borowo we
2000
< 0,05
z jasnofioletowym,
Wyhodowanie nowych odmian
wspó³pracy z IHAR Borowo
oczkiem
maków niskomorfinowych maj¹cych ró¿ny pokrój lub barwê p³atZAMBO
ró¿owe
ków korony, w porównaniu do od- IHAR Poznañ we wspó³pracy
2000
< 0,05
z jasnofioletowym,
z ZD HAR Borowo
oczkiem
miany wysokomorfinowej, której
uprawa jest zakazana, u³atwia
24
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ–czerwiec) 2008
r. zbierano plony z powierzchni 2054 ha, a w 2003 r. ju¿
tylko z 1200 ha.
Mak zajmuje w Polsce stosunkowo niewielk¹ powierzchniê uprawy, a jego cena jest bardzo wysoka.
Tak jak w pañstwach oœciennych jego nasiona s¹ u¿ywane w naszym kraju przede wszystkim w przemyœle
piekarniczym, cukierniczym i gastronomicznym. Wysoko ceni siê tak¿e spo¿ywczy i przemys³owy olej makowy.
Sta³e zagro¿enie stwarza import konsumpcyjnych
nasion maku wysokomorfinowego wykorzystywanych
do zak³adania nielegalnych plantacji.
Wyniki wielu badañ analitycznych i liczne doniesienia wskazywa³y, ¿e po spo¿yciu produktów zawieraj¹cych mak lub po za¿yciu leków, których sk³adnikiem
jest kodeina, w moczu pozostaj¹ œlady morfiny. Potwierdzi³y to badania przeprowadzone w Pracowni Psychofarmakologii Katedry Psychiatrycznej Akademii Medycznej w Warszawie. Jednorazowym testem jakoœciowym na obecnoœæ narkotyków zbadano mocz 16-letniego ch³opca. Uzyskano wynik dodatni, poniewa¿ test
wskaza³ obecnoœæ morfiny.
Mocz poddano badaniu metod¹ FPIA na analizatorze TDX firmy Abott. Stê¿enie morfiny w moczu wynios³o 425 ng/ml i przekroczy³o wartoœæ progow¹ wynosz¹c¹ 250 ng/ml. Z przeprowadzonego z ch³opcem i jego matk¹ wywiadu wynika³o, ¿e badany zjad³ poprzedniego dnia dro¿d¿ówkê z makiem. Zaniepokojona takim wynikiem matka ch³opca, w celu sprawdzenia wiarygodnoœci otrzymanych wyników badañ, zjad³a w ci¹gu dwóch dni trzy dro¿d¿ówki, które kupi³a w tej samej
piekarni. Równie¿ w jej moczu wykazano obecnoœæ
morfiny, której stê¿enie w teœcie FPIA wynios³o 975
ng/ml. Badanie przeprowadzono nastêpnie na kolejnych trzech osobach, które spo¿y³y dro¿d¿ówki pochodz¹ce z tego samego Ÿród³a. Wyniki równie¿ by³y dodatnie.
Pozytywne wyniki w tych samych próbkach moczu
zosta³y potwierdzone przez inne laboratoria: Pracowniê Toksykologiczn¹ Instytutu Ekspertyz S¹dowych
w Krakowie, Pracowniê Badañ Narkotyków w P³ynach
Ustrojowych CLK KGP oraz Pracowniê Zak³adu Badañ
Antydopingowych Instytutu Sportu. Oznaczenia wykonano metodami HPLC i GC-MS [3].
Opisany w raporcie opublikowanym przez Pracowniê Psychofarmakologii problem wystêpowania morfiny
w moczu powy¿ej wartoœci progowej po zjedzeniu wyrobów zawieraj¹cych mak zainspirowa³ autorkê niniejszej pracy do przeprowadzenia niezale¿nych, w³asnych badañ. Dodatkowym bodŸcem by³ fakt, ¿e nie
znaleziono publikacji naukowych dotycz¹cych badañ
na wykrywanie obecnoœci morfiny w p³ynach ustrojowych po spo¿yciu produktów cukierniczych zawieraj¹cych mak.
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ–czerwiec) 2008
Alkaloidy opium – charakterystyka
Opium otrzymuje siê przez wysuszenie odpowiednio przygotowanego soku z niedojrza³ych makówek
maku lekarskiego (Papaver somniferum L.). Zawarte
w opium substancje maj¹ silne dzia³anie farmakologiczne, co odkryto ju¿ ponad 6000 lat temu (œwiadcz¹
o tym zapisy na sumeryjskich tabliczkach). Obecnie
na œwiecie produkuje siê oko³o 520 ton opium w przeliczeniu na czyst¹ morfinê – g³ównie w po³udniowo-wschodniej i po³udniowo-zachodniej Azji, Ameryce
Po³udniowej i Meksyku.
Opium zawiera oko³o 20 alkaloidów nale¿¹cych
do dwóch grup:
– alkaloidy fenantrenowe (morfina, kodeina, tebaina),
– alkaloidy izochinolinowe (papaweryna, narkotyna
(noskapina), narceina).
Spoœród tych alkaloidów najwiêksze znaczenie maj¹ morfina, kodeina i tebaina, która nie ma dzia³ania
narkotycznego, ale s³u¿y do produkcji innych zwi¹zków
psychoaktywnych [4].
Morfina – charakterystyka
Morfina (3,6-dihydroksy-4,5-epoksy-N-metylomorfinen-7) zosta³a po raz pierwszy wyizolowana z opium
przez Sertürnera w 1805 r. Jej strukturê okreœli³
w 1927 r. Richardson, a jej pierwsza synteza zosta³a
przeprowadzona 150 lat po wyizolowaniu, czyli
w 1952 r. (ryc. 1).
Ryc. 1. Wzór strukturalny morfiny
Fig. 1. Morphine structural formula
W celach klinicznych morfina jest stosowana w postaci siarczanu – bia³ego proszku rozpuszczalnego
w wodzie (1 g w 15,5 ml wody) i praktycznie nierozpuszczalnego w chloroformie i eterze. Wch³ania siê
z przewodu pokarmowego w ograniczonym stopniu,
w 15–75% zale¿nie od w³aœciwoœci osobniczych. Dzia³a uspokajaj¹co i przeciwlêkowo, poprawia samopoczucie, zmniejsza zdolnoœæ odczuwania bólu. Wi¹¿e
siê z bia³kami krwi w 35–40% i ³atwo przenika
do wszystkich tkanek. Metabolizowana jest w w¹trobie,
25
przez O-metylacjê do kodeiny i N-metylacjê do normorfiny, szybko przenika przez œcianê b³ony ³o¿yska
i do mleka matki. Wydalana jest g³ównie z moczem
i w niewielkiej iloœci z ka³em. Okres po³owicznego wydalania wynosi 1–2 godziny.
Dawka toksyczna morfiny wynosi oko³o 60 mg,
a dawka œmiertelna 300 mg po przyjêciu doustnym
i 120–200 mg przy podaniu pozajelitowym. Morfina i jej
metabolity s¹ sprzêgane z kwasem glukuronowym
i wydalane z moczem.
Podstawowym zagro¿eniem, jakie stwarza przyjmowanie morfiny, jest rozwój tolerancji, a nastêpnie uzale¿nienie. Nag³e odstawienie morfiny prowadzi do wyst¹pienia objawów abstynencji. Morfina nasila dzia³anie innych opioidów, leków uspokajaj¹cych, nasennych, psychotropowych i etanolu.
Morfina wystêpuje w organizmie w postaci wolnej
i sprzê¿onej. W moczu ludzkim w 10% w postaci wolnej i 75% w postaci 3-glukuronidu morfiny (o okresie
po³owicznego wydalania do 4 godzin). Pozosta³¹ czêœæ
stanowi 6-glukuronid, 3-etero-siarczan i 3,6-diglukuronid morfiny. Wymienione metabolity s¹ równie¿ obecne
we krwi i w osoczu.
Rycina 3 ukazuje metabolizm opiatów zachodz¹cy
w organizmie cz³owieka.
Heroina – charakterystyka
Znacznie silniejszym œrodkiem uzale¿niaj¹cym jest
heroina (diacetylomorfina) (ryc. 2), która zosta³a otrzymana przez diacetylacjê morfiny w 1898 r. i wprowadzona do u¿ytku jako lek przeciwbólowy przez firmê
Bayer. Na rynku narkotykowym wystêpuje w postaci
bia³ego proszku. Zawartoœæ heroiny w jednej dawce
wynosi 21–60%. Pozosta³e sk³adniki to wype³niacze,
którymi mog¹ byæ zwi¹zki obojêtne farmakologicznie
(laktoza, skrobia), jak równie¿ aktywne: benzodiazepiny, strychnina, skopolamina i paracetamol.
Ryc. 2. Wzór strukturalny heroiny
Fig. 2. Heroin structural formula
Osoby uzale¿nione za¿ywaj¹ morfinê i heroinê ró¿nymi drogami: do¿ylnie, donosowo, przez wdychanie
lub palenie. Heroinê (w Polsce tzw. kompot) najczêœciej przyjmuje siê do¿ylnie.
26
Ryc. 3. Metabolizm opiatów w organizmie cz³owieka
Fig. 3. Opiates metabolism in human body
Heroina wprowadzona do ustroju ulega szybkiej hydrolizie do 6-O-monoacetylomorfiny, która nastêpnie
ulega powolnej hydrolizie do morfiny. G³ównymi metabolitami heroiny wystêpuj¹cymi w moczu przez 20–40
godzin po podaniu do¿ylnym s¹: 3-O-glukuronian morfiny (38,2% dawki), 6-O-monoacetylomorfina (1,3%),
wolna morfina (4,2%) oraz niezmieniona heroina
(0,1%). Inne glukuroniany morfiny oraz normorfina powstaj¹ z heroiny w znikomych iloœciach [6].
W moczu ludzi przyjmuj¹cych ten narkotyk wystêpuje czêsto kodeina, która nie jest metabolitem heroiny,
ale powstaje w wyniku deacetylacji acetylokodeiny stanowi¹cej zanieczyszczenie nielegalnie produkowanej
heroiny.
Heroina ulega bardzo szybkiemu metabolizmowi,
przez co nie mo¿na jej w zasadzie wykryæ w p³ynach
biologicznych – okres pó³trwania wynosi 2–3 minuty.
Informacjê o tym, czy dana osoba za¿ywa³a heroinê,
uzyskuje siê, oznaczaj¹c jej g³ówny metabolit – morfinê. O stosowaniu heroiny mo¿e œwiadczyæ tak¿e obecnoœæ w moczu 6-O-monoacetylomorfiny (MAM), jednak
metabolit ten udaje siê wykryæ jedynie bezpoœrednio
w ci¹gu 2–8 godzin po przyjêciu heroiny, gdy¿ szybko
przekszta³ca siê on w woln¹ morfinê.
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ–czerwiec) 2008
Kodeina – charakterystyka
Kodeina (metylomorfina) jest naturalnym alkaloidem
wystêpuj¹cym w opium. Po raz pierwszy zosta³a wyizolowana w 1832 r. przez Robiqueta (ryc. 4). Jest stosowana w postaci fosforanów i siarczanów jako lek przeciwkaszlowy i w mieszankach przeciwbólowych (wykazuje 20% przeciwbólowej aktywnoœci morfiny). Jako lek
kodeina jest podawana doustnie lub podskórnie.
Ryc. 4. Model cz¹steczki kodeiny
Fig. 4. Codeine particle
Kodeina stanowi sk³adnik „polskiej heroiny” i jest
przyjmowana do¿ylnie. Dobrze wch³ania siê z przewodu pokarmowego i po podaniu domiêœniowym (maksymalne stê¿enie jest obserwowane po 15–60 minutach).
Po podaniu doustnym maksymalne stê¿enie jest osi¹gane po oko³o godzinie do dwóch.
Kodeina ulega biotransformacji do morfiny (O-demetylacja) i norkodeiny (N-demetylacja). Zarówno kodeina, jak i jej metabolity ulegaj¹ nastêpnie sprzêganiu
z kwasem glukuronowym (ryc. 5).
Ryc. 5. Schemat metabolizmu kodeiny [4]
Fig. 5. Codeine metabolism scheme [4]
Tabela 2
Wyniki badañ próbek moczu
Results of urine sample analysis
Nr próbki
(kolejna
badana
osoba)
Czas, po
którym
pobrano
próbkê
[h]
Uzyskane
stê¿enie
narkotyków
z grupy opiatów
[ng/ml]
Wynik
badania
próbki
1
d1M
7,5
965,7
Pozytywny
Oznaczanie morfiny
obecnej w moczu i ślinie
po spożyciu cukierniczych produktów
spożywczych zawierających mak
– wyniki własne
2
d2M
7,5
255,1
Pozytywny
3
d3M
6
99,3
Negatywny
4
d4M
7,5
100,0
Negatywny
5
d5M
7,5
186,2
???1
Oznaczanie morfiny obecnej w moczu po spo¿yciu
dro¿d¿ówek z makiem – eksperyment I
6
d6M
6
93,9
Negatywny
7
d7M
6
94,4
Negatywny
Zebrano grupê jedenastu ochotników, którym podano do zjedzenia dro¿d¿ówki z makiem kupione w jednej z warszawskich piekarni (pochodzi³a z niej tak¿e
dro¿d¿ówka zjedzona przez ch³opca, którego mocz badano w Pracowni Psychofarmakologii Katedry Psychiatrycznej AM w Warszawie). Nastêpnie po up³ywie okreœlonego czasu od ka¿dej z osób pobrano próbkê moczu, któr¹ nastêpnie poddano badaniom metod¹ immunoenzymatyczn¹ na automatycznym analizatorze
EVOLIS firmy Bio-Rad z wykorzystaniem firmowego
zestawu odczynników na opiaty. Wyniki przedstawia
tabela 2.
8
d8M
6
81,4
Negatywny
9
d9M
7,5
151,7
???1
10
d10M
7,5
97,8
Negatywny
11
d11M
–
–
–
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ–czerwiec) 2008
Lp.
1 – ??? – wynik w¹tpliwy (nieco mniejszy od „cut-off”)
„Cut-off” – graniczna wartoœæ detekcji oddzielaj¹ca wyniki pozytywne od
negatywnych w przypadku opiatów dla badania moczu wynosi 200 ng/ml.
1 – ??? – questionable result (slightly lower than „cut-off”)
„Cut-off” – treshold value of detection which separates positive and
negative results, in case of opiates – amounts to 200 ng/ml for urine
samples
27
Wyniki powy¿ej wartoœci „cut-off” s¹ wynikami
pozytywnymi, w przedziale miêdzy 150 ng/ml a 200
ng/ml, w¹tpliwymi, zaœ poni¿ej wartoœci 150 ng/ml
negatywnymi.
Kryteria walidacji metody immunoenzymatycznej na
obecnoœæ opiatów przedstawiono w tabeli 3.
Tabela 3
Wynik
Stê¿enie opiatów
[ng/ml]
Absorbancja
S1
0,000
1,142
S2
50,000
0,147
S3
300,000
0,089
S4
500,000
0,054
Ryc. 6. Wykres zale¿noœci absorbancji od stê¿enia morfiny
Fig. 6. Relationship between absorbance and morphine concentration
Oznaczanie morfiny obecnej w œlinie po spo¿yciu
dro¿d¿ówek z makiem – eksperyment II
S1 > S2, 1,142 > 0,147
S2 > S3, 0,147 > 0,089
S3 > S4, 0,089 > 0,054
Na podstawie uzyskanych parametrów zosta³a wykreœlona krzywa zale¿noœci absorbancji od stê¿enia
morfiny (ryc. 6).
Od tej samej grupy ochotników pobrano równie¿
próbki œliny w odstêpach czasowych odpowiednio po 2
i 4 godzinach od zjedzenia dro¿d¿ówki z makiem.
Próbki te, podobnie jak próbki moczu, poddano badaniu metod¹ immunoenzymatyczn¹ na automatycznym
analizatorze EVOLIS firmy Bio-Rad z wykorzystaniem
firmowych zestawów odczynników na opiaty. Uzyskane
wyniki badañ zosta³y przedstawione w tabeli 4.
Tabela 4
Wyniki badañ próbek œliny
Results of saliva sample analysis
Lp.
Nr próbki
(kolejna badana
osoba)
Uzyskane
stê¿enie po 2 h
[ng/ml]
Wynik badania próbki
Nr próbki
Uzyskane
(kolejna badana stê¿enie po 4 h Wynik badania próbki
osoba)
[ng/ml]
1
d1S1
15,1
???1
d1S2
2,7
Negatywny
2
d2S1
15,4
???1
d2S2
15,4
???1
3
d3S1
9,4
Negatywny
d3S2
7,1
Negatywny
4
d4S1
8,7
Negatywny
d4S2
7,6
Negatywny
5
d5S1
13,3
Negatywny
d5S2
11,7
Negatywny
6
d6S1
18,3
???1
d6S2
16,6
???1
7
d7S1
64,3
Pozytywny
d7S2
3,9
Negatywny
8
d8S1
6,2
Pozytywny
d8S2
1,9
Negatywny
9
d9S1
105,4
Pozytywny
d9S2
11,1
Negatywny
10
d10S1
13,5
Negatywny
d10S2
6,8
Negatywny
11
d11S1
17,0
???1
d11S2
11,7
Negatywny
1 – ??? – wynik w¹tpliwy (nieco mniejszy od „cut-off”)
„Cut-off” – graniczna wartoœæ detekcji oddzielaj¹ca wyniki pozytywne od negatywnych w przypadku opiatów dla badania œliny wynosi 20 ng/ml
1 – ??? – questionable result (slightly lower than „cut-off”)
„Cut-off” – treshold value of detection which separates positive and negative results, in case of opiates – amounts to 20 ng/ml for saliva samples
28
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ–czerwiec) 2008
Wyniki powy¿ej wartoœci „cut-off” s¹ wynikami
pozytywnymi, w przedziale pomiêdzy 15 ng/ml a 20
ng/ml s¹ wynikami w¹tpliwymi, a poni¿ej wartoœci 15
ng/ml s¹ wynikami negatywnymi.
Kryteria walidacji dla tej metody zilustrowano
w tabeli 5.
Tabela 5
Wynik
Stê¿enie opiatów
[ng/ml]
Absorbancja
S1
0,000
1,263
S2
10,000
0,597
S3
100,000
0,199
S4
500,000
0,060
S1>S2, 1,263 > 0,597
S2>S3, 0,597 > 0,199
S3>S4, 0,199 > 0,060
Osoba d11 bra³a tylko udzia³ w badaniu œliny.
Na podstawie parametrów zosta³a wykreœlona
krzywa zale¿noœci absorbancji od stê¿enia morfiny
(ryc. 7).
– kolumna HP-5MS, d³ugoœæ 15 m, œrednica wewnêtrzna 0,25 mm, gruboœæ filmu 0,25 μm, przep³yw – 1,8 ml/min,
– program temperaturowy: izoterma 100oC – 2 min,
przyrost 24oC/min do 280oC, izoterma 280oC
– 3,5 min,
– dozownik – temp. 250oC, nastrzyk: 1 μl, temperatura linii transferowej: 280oC.
Monitorowane jony wyszczególniono w tabeli 6.
Tabela 6
Lp.
Nazwa
Widmo masowe [m/z]
1
kodeina
178, 196, 371
2
kodeina D3
181, 199, 374
3
morfina
401, 414, 429
4
morfina D3
404, 417, 432
5
6-MAM
287, 340, 399
6
6-MAM D3
290, 343, 402
W wyniku przeprowadzonych badañ stwierdzono w
próbkach moczu d1M, d2M, d5M, d9M obecnoœæ
morfiny oraz kodeiny (tab. 7).
Tabela 7
Stê¿enie kodeiny i morfiny w próbkach moczu
Concentration of codeine and morphine in urine samples
Ryc. 7. Wykres zale¿noœci absorbancji od stê¿enia morfiny
Fig. 7. Relationship between absorbance and morphine concentration
Badania instrumentalne próbek moczu i śliny
Próbki moczu i œliny z wynikami pozytywnymi, tj.
d1M, d2M, d5M, d9M oraz d1S1, d2S1, d6S1, d7S1,
d9S1, d11S1, d2S2 i d6S2 zosta³y poddane chemicznym badaniom instrumentalnym metod¹ chromatografii gazowej sprzê¿onej ze spektrometri¹ masow¹
na urz¹dzeniu GC/MS QP-5050 firmy Shimadzu, zgodnie z ustalon¹ w CLK KGP metodyk¹ do wykrywania
opiatów i oznaczania morfiny i kodeiny. Badania przeprowadzono w nastêpuj¹cych warunkach analitycznych:
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ–czerwiec) 2008
Nr próbki
ZawartoϾ
iloœciowa morfiny
[ng/ml]
ZawartoϾ
iloœciowa kodeiny
[ng/ml]
d1M
786
131
d2M
274
53
d5M
251
32
d9M
300
56
Chromatogramy próbki moczu d1M i jej widmo
masowe przedstawiono na rycinach 8 i 9.
W próbkach œliny d1S1, d2S1, d6S1, d11S1 oraz
d2S2, d6S2 stwierdzono obecnoϾ morfiny na
poziomie „œlepej próby”, a w próbce d7S1 œladow¹
iloœæ kodeiny oraz morfiny. Próbki d9S1, ze wzglêdu na
bardzo ma³¹ iloœæ badanego materia³u, nie poddano
badaniom potwierdzaj¹cym (tab. 8).
29
ko. Próbki moczu, które poddawano badaniu,
pobierano od niego co godzinê. Wyniki badania zestawiono w tabeli 9.
Tabela 9
Zestawienie wyników badania moczu po zjedzeniu
przez ochotnika dwóch kawa³ków makowca
Collation of results (urine) after consumption
of two pieces of poppy seeds cake
Ryc. 8. Chromatogram próbki moczu d1M
Fig. 8. d1M urine sample chromatogram
Ryc. 9. Widmo masowe próbki moczu d1M
Fig. 9. Mass spectrum of d1M urine sample
Tabela 8
Stê¿enie kodeiny i morfiny w próbce œliny d7S1
Concentration of codeine and morphine in d7S1 saliva sample
Nr próbki
ZawartoϾ
iloœciowa morfiny
[ng/ml]
ZawartoϾ
iloœciowa kodeiny
[ng/ml]
d7S1
14
6
Oznaczanie morfiny obecnej w moczu i w œlinie po
spo¿yciu dro¿d¿ówek z makiem – eksperyment III
(z u¿yciem testu IsoTech oraz SmartClip)
W eksperymencie wzi¹³ udzia³ ochotnik, któremu
podano dwa kawa³ki makowca kupione w przypadkowej cukierni oraz dro¿d¿ówkê z makiem pochodz¹c¹
z tego samego Ÿród³a, co dro¿d¿ówki spo¿ywane przez
ochotników w dwóch wczeœniejszych eksperymentach.
Celem eksperymentu by³o zbadanie, czy wystêpuj¹
ró¿nice w obecnoœci morfiny w cukierniczych wyrobach
spo¿ywczych zawieraj¹cych mak, pochodz¹cych z ró¿nych Ÿróde³. Aby to stwierdziæ, wykorzystano test immunologiczny do wykrywania morfiny w moczu o stê¿eniu powy¿ej 300 ng/ml – Morfina-TEST IsoTech.
Przed przyst¹pieniem do badañ, czyli zanim ochotnik zjad³ ciastka, wykonano tzw. œlep¹ próbê – pobrano
od niego próbkê moczu i zbadano za pomoc¹ testu
– wynik by³ negatywny. Nastêpnie ochotnik zjad³ ciast-
30
Lp.
Czas badania
moczu od spo¿ycia
ciastka
[h]
Wynik testu
1
„œlepa próba”
ujemny
2
0,5
ujemny
3
1
ujemny
4
2
dodatni
5
3
dodatni
6
4
dodatni
7
5
ujemny
8
6
ujemny
Po tygodniu podjêto eksperyment i podano ochotnikowi dro¿d¿ówkê z makiem pochodz¹c¹ ze wspomnianej ju¿ piekarni. Jednoczeœnie pobierano od niego
do badañ próbki œliny – równie¿ co godzinê od chwili
zjedzenia ciastka. Nastêpnie próbki œliny poddano badaniu za pomoc¹ testów œlinowych SmartClip firmy
Envitec. Wyniki przedstawiono w tabelach 10 i 11.
Tabela 10
Zestawienie wyników badania moczu po zjedzeniu
przez ochotnika dro¿d¿ówki z makiem
Collation of results (urine) after consumption
of poppy seeds cookie
Lp.
Czas badania moczu od
spo¿ycia ciastka
[h]
Wynik testu
1
„œlepa próba”
ujemny
2
1
ujemny
3
2
dodatni
4
3
dodatni
5
4
dodatni
6
5
dodatni
7
6
dodatni
8
22
ujemny
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ–czerwiec) 2008
Tabela 11
Zestawienie wyników badania œliny po zjedzeniu
przez ochotnika dro¿d¿ówki z makiem
Collation of results (saliva) after consumption
of poppy seeds cookie
Lp.
Czas badania œliny
od spo¿ycia ciastka
[h]
Wynik testu
1
„œlepa próba”
ujemny
2
1
dodatni
3
2
ujemny
4
3
ujemny
5
4
ujemny
6
5
ujemny
7
6
ujemny
Oznaczanie morfiny obecnej w moczu
i w ślinie metodą immunoenzymatyczną
na automatycznym analizatorze EVOLIS
W celu sprawdzenia powtarzalnoœci wyników po kolejnym tygodniu podano ochotnikowi dro¿d¿ówkê z makiem (z tej samej co wczeœniej piekarni). Nastêpnie
po up³ywie okreœlonego przedzia³u czasu pobierano
od niego próbki moczu oraz œliny, które nastêpnie poddano badaniom metod¹ immunoenzymatyczn¹ na automatycznym analizatorze EVOLIS firmy Bio-Rad z wykorzystaniem firmowych zestawów odczynników
na opiaty.
Mocz zbadano jednoczeœnie za pomoc¹ testu IsoTech. Wyniki badania ukazuj¹ tabele 12 i 13 oraz rycina 10.
Ryc. 10. Wykres zale¿noœci uzyskanego stê¿enia od czasu badania
moczu
Fig. 10. Relationship between obtained concentration and time of urine
sample analysis
Wyniki powy¿ej wartoœci „cut-off” s¹ wynikami pozytywnymi, w przedziale pomiêdzy 150 ng/ml a 200 ng/ml
w¹tpliwymi, zaœ poni¿ej wartoœci 150 ng/ml negatywnymi.
Tabela 12
Wyniki badañ próbek moczu
Results of urine sample analysis
Lp.
Nr próbki
Czas badania moczu
od spo¿ycia ciastka
[h]
Uzyskane
stê¿enie
[ng/ml]
Wynik
badania próbki
1
dOM1
1
88,4
Negatywny
ujemny
2
dOM2
2
911,6
Pozytywny
dodatni
3
dOM3
3
748,5
Pozytywny
dodatni
4
dOM4
4
436,2
Pozytywny
dodatni
5
dOM5
5
96,0
Negatywny
dodatni
6
dOM6
6
90,5
Negatywny
dodatni
7
dOM7
7
85,2
Negatywny
ujemny
8
dOM8
48
65,8
Negatywny
ujemny
Wynik testu
IsoTech
„Cut-off” – graniczna wartoœæ detekcji oddzielaj¹ca wyniki pozytywne od negatywnych w przypadku opiatów dla badania moczu wynosi 200 ng/ml
„Cut-off” – treshold value of detection which separates positive and negative results, in case of opiates – amounts to 200 ng/ml for urine samples
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ–czerwiec) 2008
31
Tabela 13
Wyniki badañ próbek œliny
Results of saliva sample analysis
Lp.
Nr
próbki
Czas badania
œliny
od spo¿ycia
ciastka
[h]
Uzyskane
stê¿enie
[ng/ml]
Wynik badania
próbki
1
dOS1
1
25,8
Pozytywny
2
dOS2
2
16,2
???1
3
dOS3
3
11,4
Negatywny
4
dOS4
4
10,5
Negatywny
5
dOS5
5
6,4
Negatywny
6
dOS6
6
3,8
Negatywny
7
dOS7
7
2,9
Negatywny
1 – ??? – wynik w¹tpliwy (nieco mniejszy od „cut-off”)
„Cut-off” – graniczna wartoœæ detekcji oddzielaj¹ca wyniki pozytywne
od negatywnych w przypadku opiatów dla badania œliny wynosi 20 ng/ml.
1 – ??? – questionable result (slightly lower than „cut-off”)
„Cut-off” – treshold value of detection which separates positive and
negative results, in case of opiates – amounts to 20 ng/ml for saliva
samples
tów i oznaczania morfiny i kodeiny. W wyniku przeprowadzonych badañ w próbkach moczu dOM2, dOM3,
dOM4 stwierdzono obecnoϾ morfiny oraz kodeiny
(tab. 14). W próbkach œliny dOS1 i dOS2 obecnoœæ morfiny i kodeiny stwierdzono na poziomie „œlepej próby”.
Tabela 14
Stê¿enie kodeiny i morfiny w próbkach moczu
Concentration of codeine and morphine in urine samples
Nr
próbki
Czas badania
moczu od
spo¿ycia
ciastka
[h]
ZawartoϾ
iloœciowa
morfiny
[ng/ml]
ZawartoϾ
iloœciowa
kodeiny
[ng/ml]
dOM2
2
761
65
dOM3
3
490
39
dOM4
4
376
34
dOM16
16
119
18
Ryc. 11. Wykres zale¿noœci uzyskanego stê¿enia od czasu badania œliny
Fig. 11. Relationship between obtained concentration and saliva analysis
time
Ryc. 12. Wykres zale¿noœci uzyskanego stê¿enia morfiny i kodeiny
od czasu badania moczu
Fig. 12. Relationship between obtained codeine and morphine
concentration and urine analysis time
Wyniki powy¿ej wartoœci „cut-off” s¹ wynikami pozytywnymi, w przedziale miêdzy 15 ng/ml a 20 ng/ml w¹tpliwymi, zaœ poni¿ej wartoœci 15 ng/ml negatywnymi.
Wszystkie próbki wskazane do powy¿szych badañ
potwierdzaj¹cych wykaza³y obecnoœæ morfiny i kodeiny.
Oznaczanie morfiny
obecnej w moczu i w ślinie
za pomocą badań instrumentalnych
Próbki moczu i œliny z wynikami pozytywnymi, tj.
dOM2, dOM3, dOM4 oraz dOS1 i dOS2, zosta³y poddane badaniom instrumentalnym metod¹ chromatografii
gazowej sprzê¿onej ze spektrometri¹ masow¹ na urz¹dzeniu GC/MS QP-5050 firmy Shimadzu, zgodnie
z ustalon¹ w CLK KGP metodyk¹ do wykrywania opia-
32
Ryc. 13. Chromatogram próbki moczu dOM3
Fig. 13. dOM3 urine sample chromatogram
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ–czerwiec) 2008
Tak przygotowane próbki maku zosta³y poddane
chemicznym badaniom instrumentalnym metod¹ chromatografii gazowej sprzê¿onej ze spektrometri¹ masow¹ na urz¹dzeniu GC/MS QP-5050 firmy Shimadzu,
zgodnie z ustalon¹ w CLK KGP metodyk¹ do wykrywania opiatów i oznaczania morfiny i kodeiny. Wyniki badañ ukazuje tabela 15.
Ryc. 14. Widmo masowe próbki moczu dOM3
Fig. 14. Mass spectrum of dOM3 urine sample
Oznaczanie morfiny obecnej w maku
pochodzącym z różnych źródeł
W celu zbadania, czy w maku dostêpnym w handlu
detalicznym mo¿na stwierdziæ obecnoœæ morfiny, a jeœli tak, to w jakim stê¿eniu, kupiono mak pochodz¹cy
z ró¿nych Ÿróde³:
– M1 i M2: kupiony na wagê na bazarze i w hali
targowej,
– M3: mak niebieski paczkowany firmy WIKPOL
z Piotrkowa Trybunalskiego.
Wszystkie trzy próbki maku poddano badaniom
za pomoc¹ mikroskopu steroskopowego firmy OLYMPUS SZX12, stosuj¹c dziesiêciokrotne powiêkszenie.
W próbkach maku M1 i M3 stwierdzono obecnoœæ
domieszek s³omy makowej (ryc. 15–16).
Tabela 15
Stê¿enie kodeiny i morfiny w próbkach maku
Concentration of codeine and morphine in poppy seed samples
ZawartoϾ
Nr
iloœciowa
próbki morfiny
w 15 g
nawa¿ki
[ng]
ZawartoϾ
iloœciowa
morfiny
w1g
[ng]
ZawartoϾ
iloœciowa
kodeiny
w 15 g
nawa¿ki
[ng]
ZawartoϾ
iloœciowa
kodeiny
w1g
[ng]
M1
2669
178
369
25
M2
2520
168
404
27
M3
69
5
16
1
Z próbek maku M1, M2 i M3 oraz masy makowej pobranej z dro¿d¿ówki z piekarni warszawskiej (M1PL)
oraz z ciastka makowego (M2CM) pobrano próbki
po oko³o 400 mg i ka¿d¹ z nich ekstrahowano:
Ryc. 16. Próbka maku M3
Fig. 16. M3 poppy seed sample
Ryc. 15. Próbka maku M1
Fig. 15. M1 poppy seed sample
W próbce maku M2 nie znaleziono domieszek s³omy makowej (ryc. 17).
Ze wszystkich trzech próbek pobrano nawa¿ki po
15 g, po czym ka¿d¹ zalano 50 ml gor¹cej wody. Po
dekantacji otrzymano oko³o 5 ml roztworu do analizy
i dodano standardy wewnêtrzne: morfiny-D3, kodeiny-D3 i 6-MAM-D3, 4 ml 0,1 M buforu fosforanowego
o pH 6 i ekstrahowano na kolumienkach Bond Eluit
Certify zgodnie z metodyk¹.
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ–czerwiec) 2008
Ryc. 17. Próbka maku M2
Fig. 17. M2 poppy seed sample
33
noznacznie stwierdziæ, czy by³ to szum, czy pik zwi¹zku.
2. Badania metod¹ chromatografii gazowej sprzê¿onej ze spektrometri¹ masow¹ (GC/MS)
Ryc. 18. Chromatogram nawa¿ki maku – próbki M2
Fig. 18. Chromatogram of poppy seed analytical sample – M2
Ryc. 19. Widmo masowe nawa¿ki maku – próbki M2
Fig. 19. Mass spectrum of poppy seed analytical sample – M2
– 40 ml metanolu (5 cykli): M1, M2, M3, M1PL,
M2CM),
– 40 ml wody destylowanej (6 cykli): M1W, M2W,
M3W, M1PLW, M2CMW,
z u¿yciem sterowanego automatycznie ekstraktora
firmy IKA Werke.
1. Badania metod¹ chromatografii cieczowej
Otrzymane ekstrakty analizowano na chromatografie cieczowym firmy Shimadzu HPLC10Avp z automatycznym podajnikiem próbek w nastêpuj¹cych warunkach:
– kolumna LiChrospherTM 5μ, 60 RP-select B, 4 mm
na 125 mm,
– eluent: A: woda: kwas fosforowy (1000:0,1),
B: acetonitryl, w gradiencie stê¿enia: od 10%B,
w 5 min – 35%B, od 6 do 10 min – 80%B, w 11 min
– 10%B, od 11 do 22 min – 10%B,
– przep³yw 1,0 ml/min,
– czas analizy 22 min,
– temp. 30oC,
– detektor DAD, UV λ = 210 nm.
W wyniku przeprowadzonych badañ w opisanych
warunkach w analizowanych próbkach nie stwierdzono
obecnoœci morfiny w iloœci >0,01%. Dla czasu retencji
morfiny w tych próbkach by³o porównywalne widmo absorpcji promieniowania z widmem bibliotecznym morfiny. OdpowiedŸ detektora by³a rejestrowana, ale nie
mo¿na by³o tych widm porównaæ. Nie mo¿na by³o jed-
34
Z próbek M2, M2CM, M1PL oraz M2W pobrano po
2 ml ekstraktu, odparowano do sucha w strumieniu
azotu, a nastêpnie poddano derywatyzacji (200 μl BSA
i 1 ml acetonitrylu ogrzewano w temp. 70oC przez 30
minut) i analizowano na chromatografie gazowym
GC/MS HP-6890 (+)/MSD-5973 firmy Hewlett Packard.
Badania przeprowadzono w nastêpuj¹cych warunkach analitycznych i z wykorzystaniem sprzêtu:
– kolumna HP-5: d³ugoœæ – 30 m, œrednica wewnêtrzna – 0,25 mm, gruboœæ filmu – 0,25 μm,
przep³yw – 1,7 ml/min,
– program temperaturowy: izoterma 100oC – 0,5
min; przyrost 15oC/min do 290oC, izoterma 290oC
– 2 min, czas ca³kowity – 15,17 min,
– dozownik: split 1:80, temp. – 250oC, nastrzyk
– 1–2 μl, solvent delay – 2 min, temperatura linii
transferowej – 300oC,
– skanowanie: 41–550 m/z.
Nie uzyskano jednoznacznych wyników. Otrzymane
na chromatogramie piki nie wskazuj¹ jednoznacznie
na obecnoœæ morfiny w badanych próbkach. Powodem
s¹ zbyt ma³e nawa¿ki przygotowanych próbek do analizy lub niew³aœciwy dobór warunków analitycznych.
Dyskusja
W Polsce, zgodnie z Ustaw¹ o ruchu drogowym,
obowi¹zuje bezwzglêdny zakaz prowadzenia pojazdów mechanicznych pod wp³ywem „œrodków dzia³aj¹cych podobnie do alkoholu” (zasada „zero tolerancji”).
Rozporz¹dzenie Ministra Zdrowia z dnia 11 czerwca 2003 r. (nowelizacja 2004 r.) wskazuje na koniecznoœæ wykonywania badañ na obecnoœæ wymienionych
w rozporz¹dzeniu, nastêpuj¹cych œrodków dzia³aj¹cych podobnie do alkoholu:
– opiaty,
– amfetamina i jej analogi,
– kokaina,
– tetrahydrokannabinole,
– benzodiazepiny.
Dopuszcza siê badania œliny (metod¹ nielaboratoryjn¹ wykorzystuj¹c¹ jednorazowe testy immunochemiczne), krwi i moczu (metoda laboratoryjna).
W przypadku wykrywania opiatów w materiale biologicznym substancj¹ oznaczan¹ jest g³ównie morfina,
kodeina i glukuronidy morfiny. Praktycznie nie da siê
oznaczyæ heroiny ani 6-O-monoacetylomorfiny, gdy¿
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ–czerwiec) 2008
ich okres po³owicznego rozk³adu jest bardzo krótki: dla
heroiny wynosi 9 minut, a dla 6-O-monoacetylomorfiny 38 minut. Ujawnienie obecnoœci morfiny i kodeiny
w materiale biologicznym, zgodnie z zasad¹ „zero tolerancji”, mo¿e poci¹gaæ za sob¹ dalsze czynnoœci prawne wobec badanego kierowcy, w tym mo¿liwoœæ oskar¿enia o przestêpstwo z artyku³u 178a k.k., w przypadku stwierdzenia morfiny we krwi.
Z przeprowadzonych badañ wynika, ¿e obecnoœæ
morfiny i kodeiny w organizmie nie musi byæ skutkiem
za¿ywania tylko narkotyków opiatowych.
Od 12 ochotników nieza¿ywaj¹cych narkotyków pobrano próbki œliny i moczu. U piêciu osób stwierdzono
pozytywne wyniki wstêpnych badañ immunologicznych
na zawartoœæ opiatów po zjedzeniu ciastka z makiem.
Wyniki w badanych próbkach moczu potwierdzi³y siê
w trzech przypadkach i waha³y siê w granicach od
436 ng/m (dOM4) do 965 ng/ml (d1M). W próbkach œliny pozytywne wyniki potwierdzi³y siê równie¿ u trzech
osób i waha³y siê w granicach od 25 ng/ml (dOS1)
do 105 ng/ml (d7S1).
Próbki w badaniach potwierdzaj¹cych metod¹
GC-MS wykaza³y obecnoœæ morfiny i kodeiny, których
iloœciowa zawartoœæ waha³a siê w granicach od 119
ng/ml do 786 ng/ml w przypadku morfiny i od 18 ng/ml
do 131 ng/ml dla kodeiny.
Wyniki powy¿szych badañ potwierdzaj¹ istnienie
problemu poruszonego w raporcie opracowanym przez
Instytut Psychiatrii i Neurologii w biuletynie „Alkoholizm
i Narkomania” [3] i wskazuj¹ na potrzebê wykonania
przez w³aœciwe instytucje naukowo-badawcze dalszych badañ na obecnoœæ morfiny: nie tylko w moczu
i œlinie, lecz tak¿e – a raczej przede wszystkim – we
krwi.
W powy¿szej pracy przeprowadzono równie¿ badania próbek maku pochodz¹cych z trzech Ÿróde³:
– supermarketu (w oryginalnym opakowaniu, z etykiet¹ producenta),
– hali handlowej (bez opisu i charakterystyki producenta),
– bazaru (bez opisu i charakterystyki producenta), tj.
prawdopodobnie z prywatnej uprawy.
Spo¿ywanie maku w Polsce w postaci cukierniczych
wyrobów (makowce, torty makowe, dro¿d¿ówki z makiem) jest bardzo popularne i czêsto wi¹¿e siê z tradycjami œwi¹tecznymi. Uprawê maku w Polsce reguluj¹
przepisy Ustawy o przeciwdzia³aniu narkomanii (Ustawa z dnia 29 lipca 2005 r).
Uprawa maku wysokomorfinowego mo¿e byæ prowadzona wy³¹cznie na potrzeby przemys³u farmaceutycznego i nasiennictwa, zaœ maku niskomorfinowego
dla celów spo¿ywczych i nasiennictwa.
Makiem niskomorfinowym okreœla siê roœlinê z gatunku mak lekarski nale¿¹c¹ do odmiany, w której za-
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ–czerwiec) 2008
wartoœæ morfiny w torebce (makówce) bez nasion,
wraz z przylegaj¹c¹ do niej ³odyg¹ o d³ugoœci do 7 cm,
wynosi poni¿ej 0,06% w przeliczeniu na zasadê morfiny i na such¹ masê wymienionych czêœci roœliny.
Istnieje ogólne przekonanie, ¿e dojrza³e nasiona
maku przeznaczone do celów spo¿ywczych nie powinny zawieraæ morfiny. W ramach pracy wykonano badania na obecnoœæ morfiny trzech próbek maku spo¿ywczego, kupionych w ró¿nych miejscach handlowych.
Próbki te wykaza³y obecnoœæ morfiny w iloœci od 5 ng
do 178 ng w przeliczeniu na 1 gram nasion.
Mo¿na przypuszczaæ, ¿e morfina jest obecna w drobinach pochodz¹cych z torebek makowych (elementy
s³omy makowej), które znajduj¹ siê miêdzy nasionami
maku, a które wykazano na zamieszczonych w pracy
zdjêciach z oglêdzin mikroskopowych. W zale¿noœci
od iloœci tych drobin mo¿e jej byæ wiêcej lub mniej.
Wnioski
1. Wykrycie morfiny w p³ynach ustrojowych mo¿e
wskazywaæ nie tylko na spo¿ycie narkotyków opiatowych, lecz tak¿e na konsumpcjê cukierniczych produktów spo¿ywczych zawieraj¹cych mak.
2. Problem wykrywania morfiny w moczu po spo¿yciu ciastka z makiem, poruszony w raporcie opracowanym przez Instytut Psychiatrii i Neurologii w biuletynie
„Alkoholizm i Narkomania” (2006), potwierdzi³ siê
w wynikach badañ powy¿szej pracy i wymaga udokumentowania po przeprowadzeniu dalszych badañ.
3. Problem jest otwarty i stanowi podstawê do dyskusji.
ryciny: 1, 2, 4 – Internet; 3 [6], 5 [4], 6–19 – autorka;
tabele: 1 [1], 2–15 – autorka
BIBLIOGRAFIA
1. Mak, Zd HAr Borowo, IHAR Poznañ 2000.
2. Ustawa z dnia 29 lipca 2005 roku o przeciwdzia³aniu
narkomanii (Dz.U. Nr 179, poz. 1485) wraz z nowelizacj¹
z dnia 7 grudnia 2006 r. (Dz.U. Nr 7, poz. 48 i 49).
3. „Alkoholizm i Narkomania” 2006, t. 19, nr 2, s. 207–210.
4. Toksykologia wspó³czesna pod red. Witolda Señczuka,
Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2006.
5. Ka³a M.: Analiza toksykologiczna œrodków uzale¿niaj¹cych, Wyd. IES, Kraków 2000.
6. Szukalski B.: Metody analizy œrodków uzale¿niaj¹cych,
Wyd. Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa 1997.
7. Krawczyk W.: Chromatografia gazowa w kryminalistyce, Wydawnictwo CLK KGP, Warszawa 1999.
8. Szukalski B.: Prowadzenie pojazdów pod wp³ywem
narkotyków – nowe zagro¿enie, „Problemy Kryminalistyki” 2006, nr 252, s. 5.
35