wyklad 10-chromatografia

Chromatografia jest to metoda fizykochemicznego rozdziału
składników mieszaniny związków w wyniku ich różnego podziału
pomiędzy fazę ruchomą a nieruchomą.
Fazą ruchomą może być gaz, ciecz lub ciecz w stanie
nadkrytycznym, a fazą nieruchomą ciało stałe lub ciecz.
Rozdział mieszaniny związków jest spowodowany procesem
rozpuszczania lub procesem adsorpcji w zależności od rodzaju
fazy nieruchomej.
O czasie przebywania poszczególnych składników w układzie
chromatograficznym decyduje energia adsorpcji lub wielkości
stałej podziału pomiędzy fazę ruchomą a nieruchomą. Aby
nastąpił pełen rozdział składników mieszaniny muszą one różnić
się między sobą powyższymi parametrami.
Proces rozdziału można opisać następująco:
Próbka mieszaniny w postaci gazowej jest wprowadzona na
początek kolumny chromatograficznej. W kolumnie znajduje się
wypełnienie (faza nieruchoma) i przepływa przez nie gaz (faza
ruchoma).
Gdy składniki mieszaniny rozdzielanej zetkną się z fazą nieruchomą
np. fazą ciekłą (wypełnieniem) pewna część każdego z nich
rozpuszcza się w tej fazie, reszta pozostaje w fazie gazowej.
Bezwzględna ilość rozpuszczającego się składnika zależy od jego
stężenia w gazie nośnym oraz od wartości współczynnika podziału
pomiędzy fazę gazową a fazę ciekłą. Zakłada się, że podział
każdej substancji pomiędzy dwie fazy jest niezależny od obecności
innych substancji i zależy jedynie od temperatury kolumn i rodzaju
fazy ciekłej. Pomiędzy fazą ruchomą a nieruchomą ustala się
równowaga dynamiczna z ciągłym przechodzeniem danego
związku z jednej fazy do drugiej. Przenoszenie odbywa się tylko w
fazie gazowej z szybkością powiązaną ze stałą podziału. Jeżeli
różnice w wartościach stałych podziału są odpowiednio duże
otrzymujemy pełny rozdział składników
W przypadku wypełnienia stałego podczas przejścia rozdzielanej
mieszaniny następują ciągłe procesy adsorpcji i desorpcji na
powierzchni wypełnienia kolumny. W zależności od energii
adsorpcji poszczególne składniki przesuwają się wzdłuż kolumny z
różną szybkością. Związki o dużej energii adsorpcji
wędrują wolno, a o małej szybko. Jeżeli różnica w energii adsorpcji
jest wystarczająco duża to proces rozdziału jest całkowity.
Ze względu na naturę zjawisk chromatografię dzielimy na:
adsorpcyjną - rozdział odbywa się w wyniku różnego powinowactwa
adsorpcyjnego składników mieszaniny do powierzchni fazy stacjonarnej,
zwanej adsorbentem;
podziałową rozdział związany jest z rożnymi wartościami
współczynnika podziału składników mieszaniny między dwie nie
mieszające się fazy, z których jedną jest faza stacjonarna (ciecz na
nośniku), a drugą faza ruchoma (gaz, ciecz lub płyn w stanie
nadkrytycznym);
jonowymienną - podstawą rozdzielania są różnice w sile oddziaływań
międzycząsteczkowych pomiędzy jonami z roztworu a jonami
związanymi z fazą stacjonarną (zwaną jonitem);
sitową, - zwaną żelową lub chromatografią wykluczania, w której
o rozdzielaniu składników mieszaniny decydują rozmiary cząsteczek.
Ze względu na stosowane techniki eksperymentalne chromatografię
możemy podzielić na:
planarną (możliwa jedynie w chromatografii cieczowej, którą można
podzielić na chromatografię bibułową i cienkowarstwową;
kolumnową
(stosowaną
we
wszystkich
metodach
chromatograficznych).
Aparatura do chromatografii gazowej
Analizę chromatograficzną zarówno ilościową jak i
jakościową prowadzi się za pomocą chromatografu.
l - butla z gazem nośnym; 2 - zawór redukcyjny; 3 - zawór dokładnej
regulacji; 4 - układ oczyszczający gaz nośny; 5 - blok dozownika wraz z
dzielnikiem strumienia; 6 - układ regulujący przepływ i mierzący ciśnienie
gazu; 7 - komora z kolumnami chromatograficznymi; 8 - detektor; 9 elektroniczny układ zasilający; l0 – urządzenie rejestrujące; 11przepływomierz; 12 - komory termostatujące
Zasada działania chromatografu jest następująca: gaz nośny ze
zbiornika lub wytwornicy poprzez system zaworów i regulatorów oraz
układ oczyszczający przepływa do dozownika, a następnie kolumny i
detektora. Mieszaninę substancji wprowadza się w dozowniku do
strumienia gazu nośnego, który transportuje ją do kolumny. W kolumnie
chromatograficznej następuje rozdział i poszczególne składniki
docierają do detektora, gdzie są wykrywane i przetwarzane na sygnał
elektryczny. Sygnał ten jest wzmacniany i rejestrowany przez rejestrator
w postaci pików chromatograficznych.
Gazy nośne
Gaz nośny w chromatografii gazowej nie bierze udziału w procesie
rozdziału, a jego rola sprowadza się do mechanicznego przenoszenia
substancji rozdzielanych. W związku z tym o wyborze rodzaju gazu
decydują czynniki niezwiązane bezpośrednio z rozdziałem. Gazy nośne
powinny charakteryzować się następującymi cechami: obojętność w
stosunku do badanej próbki, wysoka czystość, powinny spełniać
wymagania stawiane przez detektor. Ponadto gazy te powinny być
bezpieczne, tanie i łatwo dostępne. Najczęściej stosowane gazy
w chromatografii to hel, argon, azot oraz wodór.
Wypełnienia i fazy ciekłe stosowane w chromatografii
Wypełnienia stałe w chromatografii gazowej powinny charakteryzować
się powierzchniami właściwymi rzędu kilkudziesięciu do kilkuset m 2/g.
Powierzchnie nie mogą być zbyt małe ponieważ nie uzyska się rozdziału,
ani zbyt duże, gdyż proces adsorpcji będzie procesem nieodwracalnym.
Inne cechy to: bierność chemiczna w stosunku do substancji i gazu
nośnego, jednorodność powierzchni. Ziarna adsorbentu powinny
posiadać określoną granulację pozwalającą na przepływ gazu nośnego
oraz dużą wytrzymałość mechaniczną.
Najczęściej jako adsorbenty stosuje się sita molekularne, tlenki glinu,
krzemionkę, węgle aktywne lub porowate polimery.
Na wypełnieniach stałych najczęściej rozdziela się mieszaniny gazowe
lub związki ciekłe o niskich masach cząsteczkowych.
Rozdzielanie składników mieszaniny na ciekłych fazach stacjonarnych
następuje na skutek różnic w ich rozpuszczalności. Najważniejszym
wymogiem w stosunku do fazy ciekłej jest jej selektywność w stosunku do
składników rozdzielanej mieszaniny. Ponadto faza ciekła musi być cieczą
w warunkach pracy kolumny. Jednocześnie powinna być możliwie
najmniej lotna. Faza ciekła powinna być trwała i nie reagować z
rozdzielanymi związkami.
Detektory
Do
najczęściej
stosowanych
detektorów należą:
detektor
przewodnictwa cieplnego - katarometr (TDC) oraz detektor
płomieniowo-jonizacyjny (FID). Schemat i układ elektryczny
katarometu przedstawiono na rys.2
Tego typu detektor mierzy zmiany przewodnictwa cieplnego
przepływającego gazu. Poszczególne gazy różnią się znacznie
przewodnictwem cieplnym.
Dla mieszanin gazowych wartość przewodnictwa jest funkcją ich
składu.
Detektor płomieniowo- jonizacyjny (FiD)
Detektor ten mierzy zmianę natężenia prądu jonowego płomienia
wodorowopowietrznego, do którego wprowadza się gaz opuszczający
kolumnę chromatograficzną - rys. 3.
Palnik znajduje się pomiędzy dwiema elektrodami. Jeżeli do płomienia
dociera czysty gaz nośny to wytwarzana jest niewielka ilość termojonów
tego gazu. Jony te docierają do elektrody, powodując powstanie prądu
jonowego o niewielkim natężeniu. Jest to prąd podstawowy. Gdy z
kolumny do palnika dopływają związki organiczne to proces jonizacji
zachodzi w znacznym stopniu i obserwujemy wzrost prądu jonowego. Jest
on wzmacniany i rejestrowany w postaci piku chromatograficznego.
Schemat
detektor
plomieniowojonizacyjnego
A - wlot gazu nośnego; B - wlot
wodorowy; C - wlot powietrza; D dyfuzor; E - palnik; F - kominek; Gelementy chłodzące; 1- gniazdo
współosiowe; K - elektroda zbierająca
Wielkości mierzone w chromatografii
Krzywe elucji
Całkowity czas retencji tR (odcinek OB) - jest to czas przebywania
danego składnika w kolumnie od momentu zadozowania do momentu
zarejestrowania piku tego składnika. Jest to suma czasu, w którym
związek oddziałuje z wypełnieniem kolumny i czasu przejścia przez układ
chromatograficzny.
Czas retencji substancji niezatrzymywanej tm (odcinek OA) jest to czas
przejścia przez układ chromatograficzny substancji, która nie oddziałuje
z wypełnieniem kolumny chromatograficznej.
Zredukowany czas retencji t' R (odcinek OB - OA) jest to czas, w którym
dany związek oddziałuje z wypełnieniem kolumny chromatograficznej,
charakterystyczny dla danego związku i danego wypełnienia.
Jeżeli wartości poszczególnych czasów retencji pomnożymy przez
objętościową szybkość przepływu to otrzymamy odpowiednie wielkości
objętości retencji.
współczynnik retencji
(tR-tm)/tm
Współczynnik podziału możemy wyrazić wzorem Nernsta
K=Cs/Cm
Wzrost współczynnika K wydłuża czas retencji
Wzrost objętości fazy stacjonarnej wydłuża czas retencji Vs=10% Vr
Wzrost szybkości przepływu fazy ruchomej zmniejszenie czasu retencji
Czas retencji zależy od długości kolumny
Oddziaływania międzycząsteczkowe:
Kulombowskie, dipol-dipol, dipol-dipol indukowany, siły dyspersyjne,
siły związane z tworzeniem wiązań wodorowych, oddziaływania
akceptorowo-donorowe,
Kształt pikówizoterma
sorpcji
Sprawność kolumny chromatograficznej= wysokość równoważna półce
teoretycznej
Półka teoretyczna-objętość kolumny, w której osiąga się stan równowagi
między stężeniami substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i
nieruchomej.
Kolumny chromatograficzne:
kolumny z wypełnieniem (analityczne o średnicy wew. 2-6mm i dł-0,5-3m,
mikropakowane 0,8-2 mm, kilkanaście metrów, preparatywne 2,5-5 cm,
1-16m); stal nierdzewna, szkło, aluminium, miedź, teflon
kolumny o przekroju otwartym (kapilary ze szkła lub kwarcu średnicy 0,1-1
mm, dł. 10-300m
Kolumny z warstwą porowatą adsorbentu na ściankach
Kolumny z naniesionym na ścianki nośnikiem nasyconym ciekłą fazą
stacjonarną
Kolumny z ciekłą fazą stacjonarną na ściankach
Wybór parametrów analizy- wybór fazy stacjonarnej-wybór wypełnienia,
długość kolumny, temperatura pieca, wybór detektora, wielkość próbki,
szybkość przepływu gazu nośnego.
Analiza jakościowa w chromatografii
Analizę jakościową w chromatografii można prowadzić dwojako. Pierwsze
to wykorzystanie czasu lub objętości retencji drugie zaś zastosowanie
chemicznych lub fizykochemicznych metod identyfikacji.
Analiza ilościowa w chromatografii
Powierzchnia piku jest proporcjonalna do całkowitej ilości związku
opuszczającego kolumnę. Jakikolwiek przyrost tej powierzchni musi być
również proporcjonalny do przyrostu ilości tego związku.
Molowy
współczynnik korekcji
Względne powierzchnie
molowe
Metoda kalibracji bezwzględnej, metoda wzorca wewnętrznego, metoda
normalizacji wewnętrznej
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC - High Performance
Liquid Chromatography; High Pressure Liquid Chromatography) jest dziś
popularną i najbardziej uniwersalną techniką chromatograficzną. Jest
to technika kolumnowa, ciśnieniowa, w której faza ruchoma przepływa
przez kolumnę wypełnioną drobnoziarnistą fazą stacjonarną pod
dużym ciśnieniem (najczęściej 200-400 atm.). Dzięki temu faza
stacjonarna może być drobnoziarnista i gęsto upakowana (duża
powierzchnia styku z fazą ruchomą, ale i duże opory dla
przepływu fazy ruchomej), a faza ruchoma przepływa z prędkością
kilkunastu mililitrów na minutę (w standardowych kolumnach) co
pozwala skrócić czas analizy. Stałość przepływu i wysokie ciśnienie
zapewnia specjalna pompa, a jako detektor najczęściej stosuje się
spektrofotometr UV, który sprzężony z komputerem rejestruje
chromatogram, na podstawie którego można
jakościowo i ilościowo określić konkretny składnik mieszaniny.
HPLC jest stosowana jako chromatografia podziałowa, adsorpcyjna
HPLC jest stosowana jako chromatografia podziałowa, adsorpcyjna,
w układzie faz odwróconych, zarówno izokratycznie (taki sam skład fazy
ruchomej przez cały proces) jak i gradientowo. Ten ostatni sposób polega
na tym, że w czasie procesu faza ruchoma zmienia swój skład (w sposób
kontrolowany) tak, aby wszystkie składniki uległy rozdzieleniu, a czas analizy
nie był zbyt długi. Elucja gradientowa ma szerokie zastosowanie w
przypadku chromatografowania mieszanin złożonych, które zawierają
składniki różniące się polarnością. W elucji gradientowej proces
chromatografowania rozpoczyna się eluentem o małej mocy elucyjnej, a
następnie, dodając rozpuszczalnika o dużej mocy elucyjnej, zwiększa się
moc elucyjną mieszaniny w czasie.
W chromatografii cieczowej występują dwa pojęcia: eluent (faza ruchoma
wprowadzana do kolumny) oraz eluat (faza ruchoma wypływająca z
kolumny).
Analiza jakościowa
Analiza jakościowa polega na identyfikacji pików
odpowiadających poszczególnym składnikom próbki. Analiza
opiera się na porównaniu czasu retencji piku identyfikowanej
substancji z czasem retencji piku wzorca, ale pod warunkiem
zachowania jednakowych warunków chromatograficznych.
Korzy tając z wielkości retencyjnych, należy pamiętać, że retencja
może się zmieniać przy niewielkich zmianach składu fazy ruchomej.
Analiza ilościowa
Ilościową zawartość składników w próbce oblicza się, wiedząc, że
ilość składników jest proporcjonalna do powierzchni lub wysokości
pików im odpowiadających (przy założeniu, że są symetryczne). Na
wyniki analizy chromatograficznej wpływ ma jakość zastosowanego
przyrządu oraz stałość warunków prowadzenia analizy. W czasie
analizy temperatura kolumny, skład fazy ruchomej i wielkość
próbek dozowanych do kolumny nie powinny ulegać
zmianie. W chromatografii cieczowej analizę można wykonać przez
porównywanie powierzchni lub wysokości piku składnika
analizowanej próbki i powierzchni bądź wysokości piku wzorca
zewnętrznego.