7. rozdział preparatywny w kolumnie chromatograficznej.

7. ROZDZIAŁ PREPARATYWNY W KOLUMNIE
CHROMATOGRAFICZNEJ.
opracował Wojciech Zapała
I. WPROWADZENIE
W tabeli 1. przedstawiono ogólne porównanie procesów chromatografii cieczowej
prowadzonych w skali analitycznej i preparatywnej.
Tabela 1. Ogólne porównanie chromatografii analitycznej i preparatywnej.
PARAMETR
CHROMATOGRAFIA
ANALITYCZNA
CHROMATOGRAFIA
PREPARATYWNA
Rozmiar cząstek adsorbentu
Długość kolumny
Średnica wewn. Kolumny
Liczba półek teoretycznych
NatęŜenie przepływu eluentu
Ciśnienie na wlocie
3 –5 µm
5 – 25 cm
4 – 8 mm
6000 – 15000
1,5 – 2,5 cm3/min
10 – 100 MPa
5 – 100 µm
25 –100 cm
20 – 500 mm
1000 – 15000
10 – 1000 cm3/min
0,001 – 20 MPa
Model matematyczny
wystarczająco dokładny do opisu
dynamiki sorpcji w kolumnie
chromatograficznej
Proste zaleŜności
algebraiczne, lub model
idealny kolumny
ZłoŜone modele uwzględniające
dyspersję wzdłuŜną oraz opory
transportu masy (model ogólny, POR,
model RD, itp.)
Sposób rozwiązania modelu
Spotykane liczne
rozwiązania analityczne.
Zastosowania
Głównie do analizy
jakościowej i ilościowej
Rozwiązania numeryczne przy
zastosowaniu zaawansowanych metod
numerycznych (przykładowo metody
kolokacyjne, zmodyfikowane metody
róŜnicowe).
Otrzymywanie róŜnych substancji o
bardzo wysokim stopniu czystości
(np. rozdział róŜnego typu izomerów
oraz innych związków trudnych, lub
wręcz niemoŜliwych do rozdzielenia
innymi metodami). MoŜliwość
wykorzystania zarówno w skali
laboratoryjnej, jak i przemysłowej.
Z punktu widzenia inŜynierii chemicznej chromatografia cieczowa jest jedną z operacji
rozdziału mieszanin wieloskładnikowych na pojedyncze czyste składniki. Podstawową zaletą
tego procesu jest moŜliwość otrzymywania pojedynczych związków o bardzo duŜej czystości,
co jest bardzo istotne np. przy produkcji leków.
Istotne róŜnice pomiędzy chromatografią analityczną i preparatywną występują równieŜ
w wielkościach i stęŜeniach wprowadzanych do kolumny próbek. W cieczowej
1
chromatografii analitycznej objętość i stęŜenie analitu (chromatografowanej substancji)
powinny być moŜliwie małe. Dzięki temu uzyskuje się piki chromatograficzne o kształtach
zbliŜonych do krzywej Gaussa.
W odróŜnieniu od chromatografii analitycznej, w chromatografii preparatywnej
(stosowanej na skalę produkcyjną) w celu zwiększenia wydajności procesu wykorzystuje się
zjawisko przeładowania kolumny chromatografowaną substancją. Przeładowanie to moŜe być
dwojakiego rodzaju:
• Przeładowanie stęŜeniowe (rys. 1a) polega na wprowadzeniu do kolumny próbki
zawierającej rozdzielane substancje o bardzo duŜych stęŜeniach. Czas wprowadzania takiej
próbki do kolumny (czas trwania impulsu) jest tu zwykle stosunkowo krótki. Ten typ
przeładowania powoduje odstępstwa od gaussowskiego kształtu piku – pik chromatograficzny
przyjmuje kształt trójkątny, w którym (zaleŜnie od typu izotermy) moŜemy zwykle wyróŜnić
bardzo strome przednie zbocze piku (część piku wychodząca z kolumny jako pierwsza aŜ do
stęŜenia maksymalnego w piku) zwane szokiem oraz jego część schodzącą (część piku od
stęŜenia maksymalnego aŜ do zera) zwaną zboczem dyfuzyjnym piku lub falą. W zaleŜności
od rodzaju izotermy adsorpcji przeładowanie stęŜeniowe powoduje rozmycie szoku lub fali,
co nazywane jest ogonowaniem piku. Na rys. 1a przedstawiono przykłady pików
przeładowanych stęŜeniowo: o kształcie antylangmuirowkim (dla izotermy wklęsłej, np.
anty–Langmuira) oraz o kształcie langmurowskim (dla izotermy wypukłej, np. Langmuira).
• Przeładowanie masowe (rys. 1b) polega na wprowadzeniu do kolumny duŜej masy
(i/lub objętości) próbki. Czas trwania impulsu jest tu dość długi. Przy duŜym przeładowaniu
masowym kolumny próbką, następuje nasycenie powierzchni złoŜa aŜ do warunków
równowagi i pik zmienia swój kształt na trapezoidalny o stęŜeniu w plateau równym stęŜeniu
wlotowemu chromatografowanej substancji.
a)
b)
Pik o kształcie
langmuirowskim
StęŜenie/Sygnał
StęŜenie/Sygnał
Pik o kształcie
anty-langmuirowskim
Czas
Czas
Rys. 1. Przykład przeładowania stęŜeniowego (a) i masowego (b) kolumny
chromatograficznej.
2
Warunkiem przeprowadzenia rozdziału chromatograficznego substancji na duŜą skalę
jest uzyskanie optymalnej zdolności rozdzielczej układu w małej skali. WaŜne jest zatem
ustalenie jak najlepszych warunków rozdziału danej mieszaniny w warunkach analitycznych
lub semi-preparatywnych, w kolumnach o stosunkowo niewielkich gabarytach. Dopiero po
osiągnięciu w/w celu moŜna przystąpić do przenoszenia skali procesu na kolumny o duŜych
gabarytach. Jednocześnie, w przypadku produkcyjnych zastosowań chromatografii konieczne
jest
(w
przeciwieństwie
do
chromatografii
analitycznej)
określenie
maksymalnej
produktywności procesu – przeprowadzenie optymalizacji warunków ruchowych pracy
kolumny oraz dobór jej gabarytów.
Rozdzielczość kolumny chromatograficznej, Rs, w odniesieniu do dwóch rozdzielanych
substancji definiuje się najczęściej równaniem Purnella [1,2]:
√
·
· ·
(1)
gdzie: N oznacza liczbę półek teoretycznych kolumny chromatograficznej, α – współczynnik
rozdzielenia (selektywności) obliczany z zaleŜności:
(2)
gdzie: k1 i k2 są współczynnikami retencji odpowiednio składnika 1 i 2.
Jeśli α = 1 wtedy dwie substancje nie mogą być rozdzielone i następuje jednoczesne ich
wymywanie. Im większa jest wartość α, tym lepszy jest rozdział dwóch substancji. JednakŜe
kiedy rośnie α, to wzrasta takŜe czas potrzebny do rozdziału, więc w praktyce dąŜy się do
wartości współczynników selektywności na poziomie α = 1,5 [3]. NaleŜy przy tym pamiętać,
Ŝe zarówno przy bardzo małych, jak i bardzo duŜych wartościach współczynników retencji
rozdzielczość kolumny chromatograficznej jest bardzo zła. Piki o małych współczynnikach
retencji są zwykle słabo rozdzielone, natomiast piki o duŜych wartościach retencji są bardzo
rozmyte, przez co ich rozdzielczość, a takŜe detekcja nie są najlepsze. Zdecydowanie wzrasta
równieŜ procesowe zapotrzebowanie na eluent. W praktyce dobrze rozdzielone piki uzyskuje
się w zakresie wartości współczynników retencji od 2 do 10.
Współczynnik selektywności α nie opisuje jakości rozdziału. Jakość rozdziału uwzględnia
natomiast
inaczej
zdefiniowany
współczynnik
rozdzielczości
kolumny,
′ ,
w którym uwzględnia się nie tylko względne połoŜenia pików, lecz takŜe ich szerokość
podstawy (S):
′ · (3)
3
Schemat wyznaczania zdolności rozdzielczej przedstawiono na rys. 2. Jeśli róŜnica między
czasami retencji dwóch pików jest duŜa w stosunku do szerokości ich podstaw, to wtedy
rozdzielczość jest dobra. Jeśli załoŜy się idealną symetrię pików, wtedy dwie substancje
o ′ = 0,5 mogą być jeszcze zidentyfikowane. Dla rozdziału jakościowego ′ powinno
wynosić 1, dla oznaczeń ilościowych naleŜy dąŜyć do rozdzielczości od ′ = 1,2 do ′ = 1,5
[4]. NaleŜy unikać rozdzielczości ′ ≥ 2, ze względu na długie czasy analizy.
Rys. 2. Schemat wyznaczania zdolności rozdzielczej dla mieszaniny dwuskładnikowej.
II. CEL ĆWICZENIA
Zapoznanie
się
z
przebiegiem
chromatograficznego
rozdziału
mieszaniny
dwuskładnikowej prowadzonym w warunkach przeładowania stęŜeniowego oraz masowego
kolumny.
III. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
III.1. Aparatura doświadczalna i odczynniki
Doświadczenia wykonuje się stosując analityczny chromatograf cieczowy LaChrom firmy
Merck–Hitachi złoŜony z pompy, termostatu i detektora DAD w układzie:
•
kolumna: RP–18e 125x4 mm, dp=5 µm, Merck – Niemcy,
•
faza ruchoma: roztwór metanolu w wodzie 80:20 V/V,
•
próbka:
mieszanina
3
tert–butylofenolu
(C0=0,026
g/50cm3)
i
amylobenzenu
3
(C0=0,6 cm /50cm ) w eluencie,
•
natęŜenie przepływu eluentu: 1,0 cm3/min, temperatura kolumny 20oC,
•
czas martwy przewodów dla warunków prowadzenia procesu: tm=0,093 min.
4
III.2. Metodyka badań
Przygotować eluent o składzie podanym w poprzednim punkcie, oraz roztwór
tert–butylofenolu i amylobenzenu w eluencie. Do chromatografu zamontować pętlę dozującą
o pojemności 20 µl oraz kolumnę. Nasycić kolumnę eluentem aŜ do uzyskania stabilnej linii
zerowej detektora. Wyznaczyć czas martwy kolumny, t0, wprowadzając do kolumny jako
próbkę roztwór uracylu o bardzo małym stęŜeniu. Odczytać i zapisać czas retencji tej
substancji uwzględniając przy tym czas martwy przewodów tm=0,093 min. Następnie do
kolumny wprowadzić próbkę analizowanej mieszaniny, zarejestrować chromatogram
i wyeksportować dane w postaci pliku tekstowego. Po wykonaniu doświadczenia,
zamontować pętlę dozującą o objętości 1,0 cm3. Po ustaleniu się warunków procesu,
ponownie wprowadzić do kolumny próbkę analizowanego roztworu i postąpić tak jak
poprzednio.
III.3. Opracowanie i dyskusja wyników pomiarów
Na podstawie otrzymanych chromatogramów, wyznaczyć w pierwszej kolejności
wartości czasów retencji poszczególnych pików mieszaniny z uwzględnieniem czasu
martwego przewodów. Czasy retencji wyznaczać przy pomocy programu Kolumna
Chromatograficzna.exe jako czasy wyjścia środków cięŜkości obu pików. Wyznaczyć
wartości współczynnika rozdzielenia (selektywności), α, z zaleŜności (2) oraz wartości
współczynnika rozdzielczości kolumny, ′ , z zaleŜności (3). Schemat wyznaczania
współczynnika rozdzielczości, ′ , pokazano na rys. 2. Przedyskutować otrzymane wyniki
oraz obserwacje związane z kształtami pików poszczególnych składników mieszaniny.
W sprawozdaniu załączyć otrzymane chromatogramy i wyniki obliczeń.
IV. LITERATURA
[1] L.R. Snyder, J.J. Kirkland, J.L. Glajch, „Practical HPLC Method Development”, wyd. 2,
John Wiley & Sons, Inc., New York, 1997
[2] A. Rizzi, w Handbook of HPLC, pod red. E. Katz, R. Eksteen, P. Schoenmakers, Marcel
Dekker, Inc., New York 1998
[3] V.R. Meyer “Praxis der Hochleistungsflüssigchromatographie”, 5.Aufl., Diesterweg
Verlag, Frankfurt/Main 1988
[4] D.R. Jenke, G.K. Pagenkopf, Anal. Chem., 56 (1984), 85
5