Prowadzący ćwiczenia:

Badanie tolerancji bakterii na antybiotyki -laktamowe
Prowadzący ćwiczenia:
dr Agata Krawczyk-Balska
Wstęp:
Oprócz oporności bakterii na antybiotyki -laktamowe, innym znanym zjawiskiem jest
tolerancja bakterii wobec antybiotyków -laktamowych. O tolerancji mówimy, gdy bakterie
nie giną w obecności antybiotyku, lecz trwają nie rosnąc i nie dzieląc się (bakteriostaza).
Zjawisko to zostało po raz pierwszy zaobserwowane w 1942 roku przez Hobby’ego i
współpracowników, jednak oddzielne określenie nadano mu w latach 70-tych ubiegłego
wieku. Wyróżnia się dwa rodzaje tolerancji na antybiotyki -laktamowe: genotypową oraz
fenotypową. Tolerancja genotypowa wynika z mutacji w genomie, w wyniku których bakterie
unikają bakteriobójczego działania antybiotyku. Zmiany te dotyczą najczęściej genów
kodujących autolizyny i/lub genów regulatorowych zaangażowanych w procesy regulacji
ekspresji i/lub aktywności autolizyn. Tolerancja genotypowa może być wrodzona - wówczas
jest stałą cechą gatunku lub szczepu bakterii albo nabyta – wówczas w początkowo nie
wykazującej tolerancji populacji bakterii, z czasem na skutek mutacji, pojawia się
subpopulacja bakterii wykazujących tolerancję; zmiana ta staje się dziedziczna. Natomiast
tolerancja fenotypowa na antybiotyki -laktamowe nie wiąże się ze zmianami w genomie i
jest cechą charakterystyczną wszystkich niedzielących się lub wolno dzielących się komórek
bakteryjnych. Tolerancja fenotypowa jest ściśle związana ze stanem fizjologicznym bakterii
np. głodzenie spowalnia wzrost bakterii, co zwiększa ich tolerancję wobec antybiotyku.
Niedzielące się bakterie mogą teoretycznie trwać w stanie stazy przez nieokreślony czas i
stanowić rezerwuar żywych komórek, prowadząc do utrzymującej się infekcji, co powoduje,
że tolerancja bakterii na antybiotyki postrzegana jest jako zjawisko równie niebezpieczne co
oporność. W ujęciu klinicznym o tolerancji mówimy, wówczas, gdy w określonych
warunkach, badany antybiotyk wykazuje zmniejszenie lub brak właściwości bakteriobójczych
bez utraty działania hamującego (nie występuje zmiana w MIC). Aby zbadać tolerancję
należy określić wartości MIC oraz MBC. Jeżeli stosunek MBC:MIC jest równy lub wyższy
od
32
to
badany
szczep
jest
uznawany
za
tolerancyjny.
MBC – minimal bactericidal concentration – najmniejsze stężenie antybiotyku, które w
określonych warunkach redukuje o 99,9 % (3 jednostki logarytmiczne) liczbę bakterii
obecnych w innoculum.
Cel ćwiczenia: Zbadanie tolerancji
ampicylinę.
Escherichia coli oraz Listeria monocytogenes na
Wykonanie ćwiczenia:
Dzień I
1. Przygotować szereg podwójnych rozcienczeń ampicyliny w podłożu płynnym LB (zakres
stężeń 1024 – 2 g/ml). W tym celu odpipetować sterylnie po 1 ml podłoża do 9
probówek oraz 2 ml do pierwszej probówki szeregu. Do probówki zawierającej 2 ml
podłoża dodać ampicylinę do końcowego stężenia 1024 g/ml z roztworu antybiotyku o
stężeniu 20 mg/ml.
2. Przygotować szereg podwójnych rozcienczeń ampicyliny w podłożu płynnym BHI
(zakres stężeń 64 – 0,125 g/ml). W tym celu odpipetować sterylnie po 1 ml podłoża do 9
probówek oraz 2 ml do pierwszej probówki szeregu. Do probówki zawierającej 2 ml
1
3.
4.
5.
6.
podłoża dodać ampicylinę do końcowego stężenia 64 g/ml z roztworu antybiotyku o
stężeniu 1 mg/ml.
Z jednodniowych hodowli Escherichia coli oraz Listeria monocytogenes na podłożu
stałym pobrać pojedyncze kolonie i zawiesić w roztworze soli fizjologicznej (2 ml) przygotować zawiesiny bakterii o gęstości 0.5 McFarlanda.
Przygotowany szereg podwójnych rozcienczeń ampicyliny w podłożu LB zaszczepić
zawiesiną E. coli wprowadzając do każdej probówki 50 l zawiesiny.
Przygotowany szereg podwójnych rozcienczeń ampicyliny w podłożu BHI zaszczepić
zawiesiną L. monocytogenes wprowadzając do każdej probówki 50 l zawiesiny.
Określić liczbę bakterii obecnych w innoculum. W tym celu wykonać szereg rozcienczeń
przygotowanych zawiesin E. coli i L. monocytogenes w roztworze RF, a następnie z
rozcieńczenia 10-5 wysiać 100 l na 2 szalki z podłożem stałym LB (w przypadku E. coli)
oraz na 2 szalki z podłożem stałym BHI (w przypadku L. monocytogenes). Zaszczepione
szeregi podwójnych rozcienczeń oraz szalki z wysianymi bakteriami pozostawić na 24
godzinną inkubację w 37 oC.
Dzień II
1. Odczytać wartości MIC ampicyliny dla badanych szczepów bakterii.
2. Zliczyć kolonie wyrosłe na szalkach wykonanych w pierwszym dniu eksperymentu. Na
podstawie uzyskanych wyników obliczyć liczbę bakterii obecnych w innoculum.
3. Określić liczbę bakterii obecnych w podłożu zawierającym ampicylinę w stężeniu
równym MIC oraz w stężeniu równym 32wartość MIC. W tym celu, wykonać szeregi
rozcienczeń bakterii w roztworze RF, a następnie z rozcieńczenia 10 -1 10-2 10-3 wysiać
100 l na szalki z podłożem stałym LB (w przypadku E. coli) oraz na szalki z podłożem
stałym BHI (w przypadku L. monocytogenes).
4. Szalki z wysianymi bakteriami pozostawić na 24 godzinną inkubację w 37 oC.
Dzień III
1. Zliczyć kolonie wyrosłe na szalkach wykonanych w drugim dniu eksperymentu. Na
podstawie uzyskanych wyników obliczyć liczbę bakterii obecnych w podłożu
zawierającym ampicylinę w stężeniu równym MIC oraz w stężeniu równym 32wartość
MIC.
2. Na podstawie uzyskanych wyników określić procent redukcji liczby żywych bakterii
obecnych w podłożu zawierającym ampicylinę w stężeniu równym MIC oraz w stężeniu
równym 32wartość MIC w stosunku do liczby bakterii obecnych w innoculum.
Opracowanie wyników:
Na podstawie uzyskanych wyników określić tolerancję E. coli oraz L. monocytogenes na
ampicylinę.
Literatura:
1. EuropeanCommittee forAntimicrobial SusceptibilityTesting (EUCAST) of the
European Society of ClinicalMicrobiology and Infectious Diseases (ESCMID). 2000.
Terminology relating to methods for the determination of susceptibility of
bacteria to antimicrobial agents.
2. RiceK.C., Bayles K.W.:Molecular Control of Bacterial Death and Lysis. Microbiol
Mol Biol Rev. 2008, (72): 85–109
3. Markiewicz Z i Kwiatkowski A.: Bakterie, antybiotyki, lekooporność. PWN 2001
2