Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2011 • Volume 47 • Number 2 • 187-192
Praca poglądowa • Review Article
Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste
– nowe rozwiązanie w medycynie regeneracyjnej
Induced pluripotent stem cells – new solution in regenerative
medicine
Marek Żurawski, Marcin Majka
Zakład Transplantologii, Katedra Immunologii Klinicznej i Transplantologii, Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum, Kraków
Streszczenie
W ostatnich latach nastąpił przełom w badaniach nad komórkami macierzystymi. Ze zróżnicowanych komórek somatycznych
wytworzono komórki, które posiadają właściwości niezróżnicowanych, pluripotencjalnych komórek macierzystych. Otrzymywanie nowego typu komórek, nazwanych indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (ang: induced pluripotent stem cells - iPS cells), stało się możliwe dzięki wykorzystaniu wiedzy pochodzącej z wcześniejszych badań nad pluripotencjalnością oraz technik inżynierii genetycznej. Wiedza ta umożliwiła dobór czynników koniecznych do otrzymania komórek
iPS (geny, małocząsteczkowe substancje organiczne) oraz warunków hodowli komórkowej sprzyjających temu procesowi
(skład pożywek, warstwy odżywcze dla komórek). Dzięki możliwości generowania wprost z komórek pacjenta komórki iPS
mogą stać się nowym źródłem tkanek mających zastosowanie w medycynie regeneracyjnej. W niniejszej pracy przedstawiono
rozwój technologii otrzymywania komórek iPS oraz zagrożenia i nadzieje z nimi związane.
Summary
In recent years there has been a breakthrough in stem cell research. Pluripotent stem cells have been generated from terminally differentiated somatic cells. Preparation of a new type of cells, called induced pluripotent stem cells (iPS cells), was made​​
possible by using techniques of genetic engineering and knowledge gained from previous studies on pluripotency. This knowledge has allowed the selection of factors leading to generation of iPS cells (genes, low-molecular weight organic substances)
and cell culture conditions necessary to facilitate the process (composition of culture media, feeder layers). The ability to generate iPS cells directly from patient’s somatic cells may become new source of tissues applicable in regenerative medicine.
The paper presents development of technology for producing iPS cells as well as risks and hopes associated with them.
Słowa kluczowe:komórki macierzyste, komórki iPS, pluripotencjalność, reprogramowanie, medycyna regeneracyjna, terapia
genowa
Key words:stem cells, iPS cells, pluripotency, reprogramming, regenerative medicine, gene therapy
Medycyna regeneracyjna stawia sobie za zadanie otrzymanie żywych tkanek i organów w celu naprawy uszkodzonych
lub ich wymiany na nowe. Do pełnienia tej funkcji nadają
się komórki macierzyste obecne w organizmie człowieka.
W chwili obecnej ich wykorzystanie umożliwia m.in. udane
przeszczepy skóry oraz szpiku kostnego. Niestety, zarówno przyczyny techniczne, jak i biologiczne uniemożliwiają
zastosowanie tych komórek w przypadkach wielu innych
schorzeń. Istnieje jednak możliwość otrzymywania dużej ilości deficytowych tkanek dzięki właściwościom pluripotencjalnych komórek macierzystych, które są w stanie różnicować
w dowolną z tkanek dorosłego organizmu [18]. Uzyskanie
łatwo dostępnego źródła komórek pluripotencjalnych umożliwi otrzymanie i hodowlę in vitro tkanek, które do tej pory
musiały być pobierane od innych dawców lub nie kwalifikowały się do przeszczepiania. Takim źródłem mogą stać się
indukowane komórki pluripotencjalne, jedno z najnowszych
osiągnięć inżynierii komórkowej.
Zastosowanie komórek macierzystych w dzisiejszej medycynie
Komórki macierzyste wykorzystywane są w medycynie od
kilkudziesięciu lat. Izolowane z organizmu dawców nazywane są somatycznymi komórkami macierzystymi (ang:
187
Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste – nowe rozwiązanie w medycynie regeneracyjnej
somatic stem cells – SSC). To dzięki nim można dokonywać m.in. przeszczepów szpiku kostnego i skóry. Dzieje się
tak dlatego, że tkanki te są ewolucyjnie przystosowane do
ciągłego odtwarzania, przez co w odpowiednich warunkach
są w stanie zrekonstruować zarówno ubytki fizjologiczne,
jak i wywołane chorobą czy urazami. Przeszczepy szpiku
kostnego i zawartych w nim hematopoetycznych komórek
macierzystych (ang: hematopoietic stem cells – HSC) są
najczęstszym zastosowaniem terapeutycznym komórek macierzystych. Przeszczepy przeprowadza się m.in. w leczeniu
nowotworów krwi i niektórych ciężkich postaci anemii. Źródłem komórek hematopoetycznych jest szpik kostny, krew
obwodowa (po uprzedniej mobilizacji komórek ze szpiku)
i krew pępowinowa [18]. Transplantacje komórek hematopoetycznych wykonuje się także w Polsce. Pierwszy udany allogeniczny przeszczep szpiku wykonała grupa prof. Jędrzejczaka w 1984 r. w Warszawie. Był to przeszczep od dawcy
spokrewnionego wykonany u pacjentki z rzadką niedokrwistością Diamonda-Blackfana i drugi taki przypadek na świecie [32]. W 1987 r. dokonano pierwszego w kraju typowania
antygenów zgodności tkankowej (HLA) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej we Wrocławiu. W tym samym roku powstał powiązany z nim Oddział Immunoterapii
i Przeszczepiania Szpiku pod kierownictwem prof. Langego.
Była to pierwsza jednostka w polskiej służbie zdrowia, która
mogła samodzielnie wykonywać wszystkie czynności związane z przeszczepianiem komórek krwiotwórczych [13]. Procedury dotyczące przeszczepów opracowane we Wrocławiu
przyczyniły się do rozwoju polskiej hematologii. Wrocławski
ośrodek były także pierwszym w Polsce, w którym wykonano przeszczep szpiku w leczeniu guza litego [32]. Kamieniem milowym polskiej transplantologii był rok 1997, kiedy to
pierwszy przeszczep szpiku od dawcy niespokrewnionego
przeprowadził prof. Jerzy Hołowiecki z Kliniki Hematologii
i Transplantacji Szpiku w Katowicach. Dwa lata później wykonano w tym ośrodku pierwszy przeszczep, w którym dawcą
była osoba pochodząca z Polski [7]. Rozwój polskiej hematologii daje możliwość wykonywania coraz bardziej skomplikowanych zabiegów, takich jak np. przeszczep allogeniczny
komórek krwiotwórczych z redukowanym kondycjonowaniem
stosowany u osób osłabionych chorobą lub w podeszłym
wieku [8]. Co więcej, wdrażane są coraz dokładniejsze metody doboru dawcy i biorcy, co zwiększa odsetek udanych
dopasowań [12]. Współczesna transplantologia to nie tylko
komórki krwiotwórcze. Corocznie dokonuje się szeregu przeszczepów skóry do leczenia oparzeń i trudno gojących się
ran. Oprócz klasycznych, polegających na przeszczepianiu
fragmentów skóry, stosuje się terapię komórkową z zastosowaniem najnowszych technologii inżynierii tkankowych.
Przykładem mogą być autologiczne komórki skóry hodowane in vitro i przenoszone na ranę na specjalnych podłożach
umożliwiających ich wzrost i odtworzenie skóry [16]. Spektrum terapeutycznego zastosowania somatycznych komórek
macierzystych może się poszerzyć wskutek lepszego zrozumienia mechanizmów kierujących ich wzrostem i różnicowa188
niem. W ostatnich latach przeprowadzono w Polsce próby
kliniczne oceny przydatności komórek szpiku we wspomaganiu leczenia zawału mięśnia sercowego. Zaobserwowano
poprawę mierzoną frakcją wyrzutową serca i porównując ją
do wartości u osób nieleczonych [29]. Prowadzone są również próby kliniczne zastosowania terapeutycznego mezenchymalnych komórek macierzystych (ang: mesenchymal
stem cells – MSC). Są to komórki pochodzenia mezodermalnego, które występują m.in. w szpiku kostnym i tkance
tłuszczowej. Są m.in. prekursorami dla osteocytów, chondrocytów i adipocytów. Mimo ograniczonej liczby możliwych
do wykonania podziałów komórkowych można je namnażać
in vitro w stopniu pozwalającym na uzyskanie odpowiedniej
ilości materiału do dalszych zastosowań [1]. W 2008 r. na
terenie Europy prowadzono leczenie 252 pacjentów z użyciem mezenchymalnych komórek macierzystych, głównie
w schorzeniach autoimmunologicznych oraz układu mięśniowo-szkieletowego [15]. Somatyczne komórki macierzyste,
pomimo swojego potencjału, nie znajdują się w organizmie
w ilości dostatecznie dużej, aby stać się źródłem zapasowego materiału umożliwiającego regenerację w każdym przypadku choroby. Dotyczy to zwłaszcza schorzeń tkanek nie
podlegających łatwej regeneracji, jak np. tkanka nerwowa.
Ponadto, te z somatycznych komórek macierzystych, które
dzielą się łatwiej, przeważnie nie mogą zregenerować tkanek
innych, niż bezpośrednio się z nich wywodzące. Przyczyną
jest częściowe zdefiniowanie ich losu (zróżnicowanie), które
zaszło podczas rozwoju płodowego. Przykładowo komórki
macierzyste krwi (ang: hematopoietic stem cells – HSC)
mogą się różnicować tylko w komórki krwi, gdyż informacja
odpowiedzialna za przyjęcie postaci innych typów komórek
została w nich zablokowana [18]. Komórki macierzyste krwi
są zatem unipotencjalne, co oznacza, że mogą różnicować
w jedną tkankę jaką jest krew1. Pomimo postulowanych
w niektórych publikacjach sygnałach o możliwości przeróżnicowania (transdyferencjacji) komórek, nadal nie wiadomo,
czy rzeczywiście zachodzi ono in vivo, czy jest tylko efektem działania czynników indukujących ten proces w testach
in vitro [1]. Taka sytuacja skłania do zwrócenia się w stronę
mniej zróżnicowanych komórek macierzystych które oferują
większą plastyczność oraz potencjał proliferacyjny.
Komórki pluripotencjalne
Unipotencjalne, hematopoetyczne komórki macierzyste powstają z multipotencjalnych, mezodermalnych komórek macierzystych, które są m.in. prekursorami tkanki mięśniowej,
Niektórzy autorzy uważają komórki hematopoetyczne za komórki multipotencjalne, jako że tworzą one kilka typów komórek [por.
w 18]. Pojęcie multipotencjalności jest dość elastyczne i może prowadzić do nieporozumień. Na potrzeby tej pracy zarezerwowano
termin komórki multipotencjalnej dla komórki mogącej wytworzyć
wszystkie komórki należące jednego z trzech listków zarodkowych:
ektodermy, endodermy lub mezodermy. Komórki takie posiadają
zdecydowanie większy potencjał niż unipotencjalne komórki specyficzne narządowo takie jak komórki hematopoetyczne, czy mezenchymalne.
1
M. Żurawski i M. Majka
łącznej i układu wydalniczego [18]. Do multipotencjalnych
komórek macierzystych zalicza się jeszcze ektodermalne
i endodermalne komórki macierzyste. Komórki ektodermalne
odpowiadają m.in. za powstawanie naskórka, zębów i tkanki
nerwowej. Komórki endodermalne tworzą m.in. komórki rozrodcze, wątrobę, jelita oraz płuca [18]. Wszystkie trzy typy
komórek multipotencjalnych powstają natomiast z komórek
pluripotencjalnych. Komórki pluripotencjalne są obecne na
etapie blastocysty, formując jej węzeł zarodkowy, który jest
odżywiany przez trofoblast [18]. Komórki pluripotencjalne posiadają zdolność do samoodtwarzania oraz ogromny potencjał proliferacyjny. Mogą ponadto różnicować się w dowolną
komórkę organizmu [18]. Do niedawna jedynym dostępnym
źródłem komórek pluripotencjalnych były embriony, stąd też
nadano im nazwę embrionalnych komórek macierzystych
(ang: embryonic stem cells – ESC). Embrionalne komórki
macierzyste po raz pierwszy zostały wyizolowane w 1981 r.
z embrionów mysich [4], a w 1998 r. wyprowadzono pierwszą linię komórkową z embrionów ludzkich [30]. Opracowanie metody izolacji i hodowli embrionalnych komórek macierzystych dało nadzieję na ich wykorzystanie w medycynie
regeneracyjnej, ponieważ mogą być z łatwością namnożone
i różnicowane w komórki dowolnej tkanki in vitro [18]. Stają
się tym samym źródłem nieosiągalnych wcześniej w dużej
ilości komórek będących prekursorami tkanek nie podlegających regeneracji. Rozwiązanie takie ma jednak pewne
wady; komórki pluripotencjalne, jako izolowane z ludzkich
embrionów niewykorzystanych w procesie zapłodnienia
metodą in vitro, budzą wiele zastrzeżeń etycznych [31]. Co
więcej, przy zastosowaniach terapeutycznych komórki uzyskane w ten sposób należałoby sprawdzić pod względem
zgodności tkankowej z biorcą, gdyż istnieje duże ryzyko odrzucenia przeszczepu. Stwarzałoby to konieczność wyprowadzenia wielu linii komórek pluripotencjalnych z różnych
embrionów i zdeponowanie ich w bankach na wzór banków
szpiku kostnego. Rozwiązaniem problemu zgodności dawcy i biorcy jest metoda transferu jądra komórki somatycznej
(ang: somatic cell nuclear transfer – SCNT) [5]. Klonowanie
terapeutyczne, bo takim synonimem określa się SCNT, polega na wprowadzeniu jądra krańcowo zróżnicowanej komórki
somatycznej pacjenta do enukleowanej (pozbawionej jądra) komórki jajowej. Środowisko cytoplazmatyczne oocytu
w połączeniu z odpowiednimi warunkami hodowli odblokowuje informację genetyczną potrzebną do rozpoczęcia podziałów komórkowych jako nowa zygota [5]. W ten sposób
otrzymujemy embrion, który po przejściu w stadium blastocysty in vitro staje się źródłem komórek pluripotencjalnych
genetycznie identycznych z komórkami pacjenta. Jedyną
różnicą jest mitochondrialne DNA pochodzące od dawcy
komórki jajowej, lecz nie ma ono wpływu na ekspresję antygenów zgodności tkankowej [5]. Metoda klonowania terapeutycznego budzi jednak kontrowersje etyczne i prawne,
w związku z międzynarodowym zakazem klonowania ludzi
[31]. Kolejnym czynnikiem sprawiającym trudności jest niska
wydajność procedury klonowania, która przy obecnym sta-
nie nauki wymaga użycia znacznej ilości komórek jajowych
do uzyskania jednego prawidłowego embrionu [31]. Powyższe trudności znacznie ograniczają zastosowanie tej metody
jako źródła komórek pluripotencjalnych do celów medycznych. Pisząc o komórkach pluripotencjalnych nie sposób nie
wspomnieć o odkryciu uczonych pod kierunkiem prof. Ratajczaka. W ostatnich latach zidentyfikowali oni w tkankach mysich oraz ludzkich rzadką populację bardzo małych (o średnicy 2-4 μm) komórek posiadających markery specyficzne dla
komórek pluripotencjalnych. Bardzo małe embrionalnopodobne komórki macierzyste (very small embryonic-like stem
cells – VSEL) [11] obecne są m.in. w szpiku i podlegają mobilizacji do krwi obwodowej w czasie zawału serca. Mogłoby
to tłumaczyć korzystny efekt komórek szpiku stosowanych
w leczeniu pozawałowym [29, 34]. Przeprowadzono także
różnicowanie komórek VSEL w komórki mięśnia sercowego u myszy [33] oraz w komórki hematopoetyczne u ludzi
[21]. Autorzy prac sugerują, że komórki VSEL mogą stać się
w przyszłości źródłem zapasowych tkanek i organów.
Indukcja pluripotencji
Badania nad klonowaniem ssaków i ich embrionalnymi komórkami macierzystymi pozwoliły na zidentyfikowanie genów, których ekspresja jest odpowiedzialna za właściwości
pluripotencjalne komórek. Umożliwiło to Yamanace i Takahashiemu [28] przeprowadzenie eksperymentu, w którym
genetyczna modyfikacja mysich embrionalnych fibroblastów
(MEF) za pomocą genów pluripotencjalności umożliwiła
wyhodowanie kolonii komórek morfologicznie identycznych
z mysimi ESC. Wektorami przenoszącymi geny były wektory lentiwirusowe, które wykazują bardzo dużą wydajność
transdukcji (infekcji) oraz gwarantują trwałą ekspresję wprowadzanych transgenów poprzez integrację z genomem komórki. Komórki otrzymane w ten sposób zostały nazwane
indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi
(ang: induced Pluripotent Stem cells – iPS cells), a procedura ich otrzymania reprogramowaniem [28]. Testy uzyskanych
komórek wykazały, że reprogramowanie przebiega najefektywniej przy równoczesnym udziale czterech spośród 24 testowanych genów: Klf4, Sox2, Oct3, c-Myc [28]. Identyczna
kompozycja genów pozwoliła grupie Yamanaki na uzyskanie
komórek iPS z ludzkich fibroblastów, co ostatecznie potwierdziło podatność ludzkich komórek na reprogramowanie [27].
Geny odpowiedzialne za reprogramowanie występują zarówno u człowieka, jak i u myszy i są czynnikami transkrypcyjnymi związanymi bezpośrednio z zachowaniem fenotypu
komórek pluripotencjalnych. Są one również używane jako
markery pluripotencjalności embrionalnych komórek macierzystych, a ich ekspresja zanika wraz z różnicowaniem się
komórek [27]. Dlatego reaktywacja ich ekspresji prowadzi do
powstania komórek posiadających właściwości pluripotencjalne. Stwierdzenie tych właściwości odbywa się poprzez
badanie ekspresji wspomnianych genów na poziomie mRNA
i białka. Nowo otrzymane komórki iPS są także badane pod
kątem metylacji promotorów genów odpowiedzialnych za
189
Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste – nowe rozwiązanie w medycynie regeneracyjnej
pluripotencjalność. Wzory metylacji powinny być podobne
do tych obserwowanych w komórkach embrionalnych, gdyż
oznacza to ekspresję genów pluripotencjalności na poziomie
odpowiadającym komórkom embrionalnym [14]. Należy przy
tym zaznaczyć, że w dojrzałych, prawidłowych komórkach
iPS ekspresja transgenów powinna być wyciszona po tym,
jak spełnią one swoją rolę przy reprogramowaniu. Istotna jest
również stabilność genomu – należy regularnie sprawdzać,
czy nie występują aberracje chromosomowe, co jest rutynowo praktykowane także w przypadku prowadzenia hodowli
embrionalnych komórek macierzystych [14]. Indukowane
komórki pluripotencjalne również przechodzą funkcjonalne
testy pluripotencjalności. Składa się na nie m.in. kontrolowane różnicowanie w komórki każdego z trzech listków zarodkowych in vitro oraz test tworzenia potworniaka (teratoma) in
vivo u myszy szczepu NOD-SCID, które nie posiadają układu odpornościowego [14].
Rozwój technologii otrzymywania komórek iPS
Otrzymanie komórek iPS w sposób przedstawiony powyżej
pozwala przezwyciężyć trudności związane z wytwarzaniem
embrionalnych komórek macierzystych, ale stwarza nowe
problemy, zwłaszcza w aspekcie potencjalnego zastosowania terapeutycznego. Zastosowanie do reprogramowania wektorów integrujących się losowo w genom komórek
gospodarza (lentiwirusy i retrowirusy) powoduje ryzyko tzw.
mutagenezy insercyjnej. Polega ona na integracji wektora
wirusowego w przypadkowym miejscu genomu reprogramowanych komórek. Istnieje wobec tego ryzyko wyłączenia innych genów przez wbudowanie się w ich sekwencję
[20]. Proces mutagenezy insercyjnej może spowodować np.
przerwanie represora jakiegoś onkogenu i stać się przyczyną nowotworu. Stanowi to poważne zagrożenie dla potencjalnych pacjentów. Kolejnym problemem jest fakt wprowadzania do reprogramowanych komórek dodatkowych kopii
genów będących silnymi mitogenami (przede wszystkim
c-Myc, a także Klf4 i w mniejszym stopniu pozostałych genów). Pomimo iż użycie genu c-Myc powoduje zwiększenie
efektywności reprogramowania, zostało wykazane, że może
on powodować niepożądane działania. Po wszczepieniu komórek iPS generowanych z udziałem c-Myc do węzła zarodkowego mysiej blastocysty uzyskano myszy-chimery, które
w dorosłym życiu częściej rozwijały nowotwory, co mogło
być spowodowane obecnością nadmiernej ilości kopii c-Myc
w komórkach [19]. Podobnych objawów nie zaobserwowano
w przypadku Klf4, ale z racji tego, że należy on do onkogenów jego zastosowanie jest ryzykowne [9]. Zmniejszenie
ryzyka uzyskano poprzez użycie wektorów lentiwirusowych,
które można wyciąć z genomu reprogramowanych komórek. W ten sposób transgeny po spełnieniu swojej funkcji są
usuwane z komórek i nie stwarzają zagrożenia związanego
z nadekspresją onkogenów [23]. Istnieje też tendencja do
redukcji ilości czynników transkrypcyjnych używanych do reprogramowania. Opracowano metodę reprogramowania bez
genu c-Myc, jako że niesie ryzyko związane z wystąpieniem
190
nowotworów [19]. Wyeliminowano także gen Klf4, a związane z tym zmniejszenie wydajności reprogramowania skompensowano za pomocą inhibitorów deacetylaz histonów. Są
to związki chemiczne powodujące rozluźnianie chromatyny,
przez co dostęp czynników transkrypcyjnych do DNA jest
ułatwiony [9]. Przeprowadzono reprogramowanie komórek
przy pomocy plazmidowego DNA, aczkolwiek z niższą wydajnością niż w przypadku wektorów wirusowych [20]. Wytworzono również komórki iPS wprowadzając do komórek
somatycznych rekombinowane białka kodowane przez geny
odpowiedzialne za reprogramowanie [10]. Zabiegi zwiększające bezpieczeństwo potencjalnej terapii odbywają się
jednak kosztem wydajności reprogramowania. Zwiększenie
wydajności można uzyskać wspomnianymi już deacetylazami histonów. Stosuje się także czynniki demetylujące DNA,
które usuwają reszty metylowe z obszaru promotorów genów odpowiedzialnych za pluripotencję, zwiększając ich aktywność [17]. Pojawiły się wektory policistronowe, niosące
wszystkie niezbędne geny w jednym wirusie lub plazmidzie,
pod kontrolą jednego promotora i z jednym sygnałem poliadenylacji. Znalazła w nich zastosowanie krótka sekwencja
zaczerpnięta z wirusa pryszczycy (ang: foot and mouth disease virus - FMDV), która oddziela poszczególne geny, a po
translacji przyczynia się do podziału białka [2]. Takie podejście nie tylko zwiększa efektywność, ale - w przypadku integrujących wektorów wirusowych - zapobiega wystąpieniu
nadmiernej ilości losowych miejsc integracji. Zjawisko to występuje w przypadku użycia kilku różnych populacji wirusów,
tak jak to miało miejsce w pierwszych eksperymentach [2,
28]. Prace nad indukcją pluripotencjalności trwają obecnie
w wielu laboratoriach. Jest zatem wysoce prawdopodobne,
że w najbliższym czasie zostaną opracowane jeszcze bardziej efektywne i bezpieczne rozwiązania.
Metody hodowli komórek pluripotencjalnych
Istotą każdej hodowli komórkowej jest zapewnienie komórkom odpowiednich warunków do wzrostu. Składa się na
to kompozycja pożywki, wiek linii liczony w liczbie pasaży
oraz dbałość o utrzymanie odpowiedniej gęstości komórek
w naczyniu hodowlanym. Komórki iPS, podobnie jak inne
komórki pluripotencjalne mają skłonność do spontanicznego
różnicowania. Dlatego w ich hodowli stosuje się specjalne
zabiegi mające na celu utrzymanie prawidłowego fenotypu. Oprócz niestandardowego składu pożywki hodowlanej,
stosuje się tzw. warstwy odżywcze, które są przyrządzane z żywych komórek [3]. Komórki podścieliska ułatwiają
także przyczepianie się kolonii komórek macierzystych do
powierzchni naczynia hodowlanego poprzez wydzielanie
białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Najczęściej stosowanymi komórkami warstwy odżywczej są mysie embrionalne fibroblasty (MEF - te same komórki, które posłużyły do
wytworzenia pierwszych komórek iPS). Stosowane są one
z powodzeniem dla hodowli ludzkich i zwierzęcych komórek
pluripotencjalnych. Izolowane z embrionów mysich stanowią
łatwy do uzyskania materiał warstwy odżywczej. Komórki te
M. Żurawski i M. Majka
przed wysianiem w roli podścieliska inaktywuje się promieniowaniem gamma albo mitomycyną C, aby powstrzymać
ich rozrost mogący zagrozić wolniej rosnącym koloniom komórek pluripotencjalnych. Inaktywacja nie powoduje jednak
zaniku metabolizmu komórek, przez co mogą utrzymać się
przy życiu i wytwarzać pożądane substancje [3]. Komórki
MEF posiadają jednak swoje wady. Przede wszystkim jest
to trudny do precyzyjnego zdefiniowania skład wydzielanych
substancji odżywczych, który może być zależny np. od wieku komórek liczonego w pasażach. Takie niezdefiniowane
warunki wpływają na powtarzalność warunków hodowli komórek, a co za tym idzie na warunki eksperymentów przeprowadzanych na tych komórkach. Ponadto, podścielisko
oparte na mysich embrionalnych fibroblastach nie może być
wykorzystywane do hodowli komórek iPS/hESC przy potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Mówiąc innymi
słowy, żadne komórki macierzyste hodowane na podłożach
z komórek pochodzących od innego gatunku, nie zostaną
dopuszczone do zastosowania u ludzi [22]. W takiej sytuacji, substytutem komórek MEF mogą być trudniej dostępne
ludzkie fibroblasty izolowane ze skóry, aczkolwiek wciąż posiadają one wadę polegającą na trudnym do precyzyjnego
określenia składzie wydzielanych białek [3].
Alternatywą dla komórek podścieliska są podłoża przygotowywane na bazie białek macierzy zewnątrzkomórkowej,
tzw. matriżel. Złożone głównie z lamininy, kolagenu typu
IV, entaktyny i kompleksów białek z siarczanem heparanu,
spełniają funkcję identyczną do macierzy zewnątrzkomórkowej wydzielanej przez komórki odżywcze. Media komórkowe
w hodowlach bez warstwy odżywczej są uzupełniane czynnikami wzrostowymi, które zidentyfikowano jako wydzielane
przez komórki podścieliska. Podstawową zaletą tej metody
jest ściśle określony skład podłoża i pożywki hodowlanej dla
komórek [26]. Rutynowo stosuję się matriżele oparte na białkach uzyskiwanych z komórek zwierzęcych, niemniej jednak
istnieje możliwość użycia pożywki i matriżelu całkowicie wolnych od składników pochodzenia zwierzęcego. Otrzymano
już ludzkie komórki iPS prowadząc reprogramowanie na
podłożu matriżelowym [26], a także w hodowli pozbawionej
składników ksenogenicznych [22].
Potencjał zastosowania klinicznego komórek iPS
Indukowane komórki pluripotencjalne mogą znaleźć zastosowanie w medycynie regeneracyjnej jako źródło nowych
komórek, tkanek lub nawet organów. Do tej pory z ludzkich komórek iPS udało się za pomocą ukierunkowanego
różnicowania uzyskać m.in. komórki wykazujące cechy komórek wątroby [24] oraz komórki produkujące insulinę [35].
W grudniu 2010 r. Wells i wsp. donieśli o wytworzeniu ludzkiej tkanki jelita zarówno z ESC jak i iPS [25]. Jednym z zastosowań indukowanych komórek pluripotencjalnych może
być także leczenie defektów genetycznych. Komórki somatyczne pobierane są od osób chorych, a następnie reprogramowane. Tak uzyskane komórki iPS poddawane są modyfikacji genetycznej, w celu wprowadzenia prawidłowej wersji
genu. Wyselekcjonowane komórki z prawidłową wersją genu
są później różnicowane w komórki docelowe, co umożliwia
ich wszczepienie do organizmu pacjenta bez ryzyka odrzucenia. Po przeszczepieniu komórki zaczynają produkować
właściwy produkt genu i przyczyniają się do zmniejszenia
objawów chorobowych. Stosując tę metodę, wyleczono anemię sierpowatą wprowadzając właściwą wersję genu hemoglobiny do komórek iPS, które zostały otrzymane z komórek
somatycznych cierpiących na tę chorobę myszy [6].
Podsumowanie
Indukowane komórki pluripotencjalne są z pewnością wielką nadzieją na przyszłość medycyny regeneracyjnej i terapii
genowej. Posiadają one zalety embrionalnych komórek macierzystych takie jak zdolność do wielokrotnych podziałów
i możliwość różnicowania w komórki dowolnej tkanki. Potencjał proliferacyjny indukowanych komórek pluripotencjalnych sprawia, że pomimo konieczności zachowania ściśle
określonych warunków hodowli można stosunkowo łatwo
uzyskać znaczną ich ilość. Są dzięki temu doskonałym celem dla terapii genowych, jako że niewielka ilość poddanych
terapii komórek może zostać wydajnie namnożona, a ich
całkowita zgodność z komórkami pacjenta eliminuje ryzyko
odrzucenia przeszczepu. Dostępność indukowanych komórek pluripotencjalnych ograniczona jest tylko przez koszty
metody reprogramowania i nie budzą one zastrzeżeń etycznych. Zanim jednak powstaną pierwsze terapie oparte na
tej metodzie, należy przezwyciężyć trudności związane ze
sposobem otrzymywania komórek iPS. Mowa tu nie tylko
o uzyskaniu wydajnej i bezpiecznej metody reprogramowania. Istotne jest także wprowadzenie rutynowych badań
określających bezpieczeństwo każdej nowo otrzymanej
tkanki. Czas pokaże, czy indukowane komórki pluripotencjalne staną się łatwo dostępnym i bezpiecznym źródłem
deficytowych komórek, tkanek i organów.
Piśmiennictwo
1. Bajek A, Olkowska J, Drewa T. Mezenchymalne komórki macierzyste narzędziem terapeutycznym w regeneracji tkanek i narządów. Postepy Hig Med Dosw (Online) 2011; 65:124-132.
2. Carey BW, Markoulaki S, Hanna J i wsp. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector.
Proc Natl Acad Sci U S A 2009; 106 (1):157-162.
3. Eiselleova L, Peterkova I, Neradil J i wsp. Comparative study of
mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.
Int J Dev Biol 2008; 52 (4):353-363.
4. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 1981; 292 (5819):154156.
5. French AJ, Wood SH, Trounson AO. Human therapeutic cloning
(NTSC): applying research from mammalian reproductive cloning. Stem Cell Rev 2006; 2 (4):265-276.
6. Hanna J, Wernig M, Markoulaki S i wsp. Treatment of sickle cell
anemia mouse model with iPS cells generated from autologous
skin. Science 2007; 318 (5858):1920-1923.
7. Holowiecki J. Bone marrow and haematopoietic stem cell transplantation in Poland. Przegl Lek 2000; 57 Suppl 1:17-23.
8. Holowiecki J, Holowiecka-Goral A. Przeszczep allogeniczny komórek krwiotwórczych ze zredukowanym kondycjonowaniem.
Acta Haematol Pol 2008; 39 (4):697–706.
191
Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste – nowe rozwiązanie w medycynie regeneracyjnej
9. Huangfu D, Osafune K, Maehr R i wsp. Induction of pluripotent
stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and
Sox2. Nat Biotechnol 2008; 26 (11):1269-1275.
10. Kim D, Kim CH, Moon JI i wsp. Generation of human induced
pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell 2009; 4 (6):472-476.
11. Kucia M, Reca R, Campbell FR i wsp. A population of very small
embryonic-like (VSEL) CXCR4(+)SSEA-1(+)Oct-4+ stem cells
identified in adult bone marrow. Leukemia 2006; 20 (5):857-869.
12. Lange A, Dera-Joachimiak D, Madej S i wsp. Activity of the
National Polish Bone Marrow Donor Registry--analysis of the
matching process successfully completed with hematopoietic
stem cell transplantation. Transplant Proc 2010; 42 (8):33163318.
13. Lange A, Marcinek I, Pacuszko T. Hematopoetic progenitor cells
transplantation in Poland: structure and clinical practice. Ann
Transplant 1996; 1 (1):63-66.
14. Maherali N, Hochedlinger K. Guidelines and techniques for the
generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell
2008; 3 (6):595-605.
15. Martin I, Baldomero H, Tyndall A i wsp. A survey on cellular and
engineered tissue therapies in europe in 2008. Tissue Eng Part
A 2008; 16 (8):2419-2427.
16. Metcalfe AD, Ferguson MW. Tissue engineering of replacement
skin: the crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic
development, stem cells and regeneration. J R Soc Interface
2007; 4 (14):413-437.
17. Mikkelsen TS, Hanna J, Zhang X i wsp. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature 2008;
454 (7200):49-55.
18. Regenerative Medicine 2006 (praca zbiorowa), National Institutes of Health, 2006, 1-8, 14. http://stemcells.nih.gov/staticresources/info/scireport/PDFs/Regenerative_Medicine_2006.pdf
(dostęp: 15.02.2011)
19. Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germlinecompetent induced pluripotent stem cells. Nature 2007; 448
(7151):313-317.
20. Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H i wsp. Generation of mouse
induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science
2008; 322 (5903):949-953.
21. Ratajczak J, Zuba-Surma E, Klich I i wsp. Hematopoietic differentiation of umbilical cord blood-derived very small embryonic/
epiblast-like stem cells. Leukemia 2011.
22. Rodriguez-Piza I, Richaud-Patin Y, Vassena R i wsp. Reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells
under xeno-free conditions. Stem Cells 2010; 28 (1):36-44.
23. Soldner F, Hockemeyer D, Beard C i wsp. Parkinson’s disease
patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell 2009; 136 (5):964-977.
24. Song Z, Cai J, Liu Y i wsp. Efficient generation of hepatocytelike cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res
2009; 19 (11):1233-1242.
25. Spence JR, Mayhew CN, Rankin SA i wsp. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.
Nature 2010.
26. Sun N, Panetta NJ, Gupta DM i wsp. Feeder-free derivation of
induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem
cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2009; 106 (37):15720-15725.
27. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M i wsp. Induction of pluripotent
stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell
2007; 131 (5):861-872.
28. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells
from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined
factors. Cell 2006; 126 (4):663-676.
29. Tendera M, Wojakowski W, Ruzyllo W i wsp. Intracoronary infusion of bone marrow-derived selected CD34+CXCR4+ cells and
non-selected mononuclear cells in patients with acute STEMI
192
and reduced left ventricular ejection fraction: results of randomized, multicentre Myocardial Regeneration by Intracoronary
Infusion of Selected Population of Stem Cells in Acute Myocardial Infarction (REGENT) Trial. Eur Heart J 2009; 30 (11):13131321.
30. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS i wsp. Embryonic
stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998;
282 (5391):1145-1147.
31. Weissman IL. Medicine: politic stem cells. Nature 2006; 439
(7073):145-147.
32. Wiktor-Jedrzejczak W. History of bone marrow transplantation
in Poland. Ann Transplant 1996; 1 (1):15-17.
33. Wojakowski W, Tendera M, Kucia M i wsp. Cardiomyocyte differentiation of bone marrow-derived Oct-4+CXCR4+SSEA-1+ very
small embryonic-like stem cells. Int J Oncol 2010; 37 (2):237247.
34. Wojakowski W, Tendera M, Kucia M i wsp. Mobilization of bone
marrow-derived Oct-4+ SSEA-4+ very small embryonic-like
stem cells in patients with acute myocardial infarction. J Am Coll
Cardiol 2009; 53 (1):1-9.
35. Zhang D, Jiang W, Liu M i wsp. Highly efficient differentiation
of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulinproducing cells. Cell Res 2009; 19 (4):429-438.
Adres do korespondencji:
Zakład Transplantologii
P-A Instytut Pediatrii UJ CM
30-663 Kraków, ul. Wielicka 265
e-mail: [email protected]
Zaakceptowano do publikacji: 12.04.2011