Badanie aktywności enzymów z klasy oksydoreduktaz. Oznaczenie

1|Strona
UWAGA!!!!!!
WSZYSTKIE ROZTWORY WYLEWAĆ
TYLKO DO SPECJALNYCH POJEMNIKÓW!!!
Badanie aktywności enzymów z klasy oksydoreduktaz.
Oznaczenie witaminy C
A. Badanie aktywności enzymów z klasy oksydoreduktaz.
Odczynniki :
- 3% roztwór H2O2,
- roztwór KCN,
- roztwór benzydyny w kwasie octowym,
- roztwór fenolu
- roztwór pirogallolu
- odczynnik NADI (przygotować bezpośrednio przed Użyciem, mieszając p-fenyleno-diaminę
z -naftolem w stosunku 1 : 1 (1 ml + 1 ml),
- bufor fosforanowy o pH 7,4,
- roztwór pirokatechiny
UWAGA!!! KCN jest silna trucizną !!!
!!!Wylewać tylko do specjalnie oznaczonego pojemnika !!!
SPORZĄDZANIE WYCIĄGU ZIEMNIACZANEGO
Umyty i obrany ziemniak utrzeć na tarce. Miazgę włożyć do złożonej potrójnie gazy i zanurzyć w zlewce
zawierającej 200 cm3 wody destylowanej. Zawartość zlewki łagodnie mieszać przez kilka minut. Otrzymuje
się wodny wyciąg z ziemniaka, zawierający enzymy oraz wypłukana skrobię. Część wyciągu zagotować.
1. WYKRYWANIE AKTYWNOŚCI KATALAZY
Katalazy, obecne we wszystkich organizmach tlenowych, są metaloproteinami zawierającymi w swojej
cząsteczce żelazo. Katalizują rozkład H2O2 do wody i tlenu cząsteczkowego. Jest to szczególny przypadek
reakcji hydroperoksydazowej, w której H2O2 jest jednocześnie donorem i akceptorem wodoru.
2H2O2 → 2H2O + O2
Zasada wykrywania katalazy
Tlen uwolniony w reakcji dysproporcjowania H2O2 katalizowanej przez katalazę wydzielając się z
roztworu powoduje jego silne pienienie.
Wykonanie
Do trzech probówek napipetować po około 2 ml :
a - ekstraktu z ziemniaka ,
b - zagotowanego ekstraktu z ziemniaka
c - ekstraktu z ziemniaka z dwoma kroplami roztworu KCN.
Do każdej z prób dodać 5 kropli 3% nadtlenku wodoru. Gwałtownie wydzielające się
pęcherzyki tlenu są świadectwem prawidłowo przebiegającej reakcji.
2|Strona
UWAGA!!!!!!
WSZYSTKIE ROZTWORY WYLEWAĆ
TYLKO DO SPECJALNYCH POJEMNIKÓW!!!
2. WYKRYWANIE AKTYWNOŚCI PEROKSYDAZ
Peroksydazy katalizują reakcję utleniania niektórych związków organicznych np. fenoli z równoczesną
redukcją nadtlenku wodoru
H2O2 + fenole → 2H2O + chinony
Enzymy tej grupy są odporne na temperaturę. Nie denaturują w temperaturze 70°C,
inaktywują się dopiero po ogrzaniu we wrzącej łaźni wodnej. Bogatym ich źródłem jest sok
chrzanowy, a w tkankach zwierzęcych wątroba i leukocyty.
Zasada wykrywania peroksydazy
Benzydyna w obecności H2O2 ulega utlenieniu przez peroksydazę do błękitu benzydynowego,
zgodnie z poniższym równaniem reakcji
Wykonanie
Do 5 probówek odmierzyć podaną w tabeli objętość ekstraktu z ziemniaka, benzydyny, H2O2, KCN i H2O. Do
probówki nr 4 dodać zagotowany ekstrakt. Zawartość probówek wymieszać i postawić na 20 min w
temperaturze pokojowej. Obserwować zachodzące zmiany i zanotować wyniki.
Próba
nr
1
2
3
4
5
Wyciąg
(ml)
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
Woda
(ml)
0
0,1
0
0
0,1
Benzydyna
(ml)
0,1
0
0,1
0,1
0,1
KCN
0
0
2 krople
0
0
H2O2
(ml)
0,1
0,1
0,1
0,1
0
3. WYKRYWANIE AKTYWNOŚCI OKSYDAZY CYTOCHROMOWEJ
Oksydaza cytochromowa jest enzymem występującym w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, stanowi
końcowy element łańcucha oddechowego w komórce. Jej podstawowym zadaniem jest przeniesienie
elektronów na tlen w celu jego aktywacji. Enzym ten jest hemoproteiną zawierającą również atomy miedzi.
3|Strona
UWAGA!!!!!!
WSZYSTKIE ROZTWORY WYLEWAĆ
TYLKO DO SPECJALNYCH POJEMNIKÓW!!!
Zasada wykrywania aktywności oksydazy cytochromowej
Obecność oksydazy cytochromowej w ekstrakcie tkankowym można wykazać w reakcji, w której
wykorzystywany jest odczynnik NADI. W skład odczynnika wchodzą: -naftol i p-fenylenodiamina
zmieszane w stosunku 1:1. W wyniku nieenzymatycznej redukcji zawartego w mitochondriach cytochromu c
przez p-fenylenodiaminę powstaje p-fenylenodiimina, która w obecności  -naftolu przechodzi w barwny,
niebieski kompleks.
Wykonanie
Do 4 probówek odmierzyć podane w tabeli objętości poszczególnych roztworów; do probówki nr 4 dodać
zagotowany wyciąg. Próby starannie wymieszać i pozostawić na 30 min w temperaturze pokojowej.
Obserwować powstanie niebieskiej barwy. Wyniki zapisać w tabeli.
Próba
nr
1
2
3
4
Wyciąg
(ml)
1
1
1
1
Woda
(ml)
0
0
0,1
0
Bufor pH 7,4
(ml)
1
1
1
1
KCN
0
1 kropla
0
0
NADI
(ml)
0,1
0,1
0
0,1
4. WYKRYWANIE AKTYWNOŚCI OKSYDAZY POLIFENOLOWEJ
Oksydazy katalizują odrywanie się elektronów od utlenianego substratu i dwu- lub czteroelektronową
redukcję cząsteczki tlenu. Produktami reakcji katalizowanych przez te enzymy jest woda lub nadtlenek
wodoru. Substratem w reakcjach utleniania mogą być m.in. o- i p-difenole. Powstają chinony, a w wyniku ich
kondensacji tworzą się barwne pochodne. Oksydaza fenolowa, zwana również oksydazą polifenolową,
tyrozynazą lub katecholazą, jest metaloproteiną i zawiera miedź, która przyjmuje elektrony od difenoli
i przekazuje na tlen cząsteczkowy.
Zasada wykrywania oksydazy polifenolowej
Oksydaza polifenolowa utlenia pirokatechinę do chinonów, które kondensując dają ciemnobrunatne
zabarwienie.
4|Strona
UWAGA!!!!!!
WSZYSTKIE ROZTWORY WYLEWAĆ
TYLKO DO SPECJALNYCH POJEMNIKÓW!!!
Wykonanie
Do 5 probówek odmierzyć podane w tabeli objętości ekstraktu z ziemniaka, wody, buforu, pirokatechiny
i 4% roztworu KCN. Do probówki nr 4 dodać ekstrakt zawierający termicznie zdenaturowane białka.
Zawartość wszystkich probówek starannie wymieszać, zanotować czas i pozostawić w temperaturze
pokojowej. W celu lepszego dostępu tlenu, próby od 1-4 co pewien czas wstrząsnąć. Po 20 min zanotować
wyniki reakcji.
Próba
nr
1
2
3
4
5
Wyciąg
(ml)
1
1
1
1
1
Woda
(ml)
0
0,1
0
0
0
Bufor pH 7,4
(ml)
1
1
1
1
1
KCN
0
0
2 krople
0
0
Pirokatechina
(ml)
0,1
0
0,1
0,1
0,1
Do 4 probówek wlać po 5 cm3 wyciągu ziemniaczanego (do 2 zagotowany, do 2 niezagotowany). Następnie
do probówek wprowadzić kolejno:
 10 kropli 1% roztworu fenolu,
 10 kropli 1% roztworu pirogallolu.
Zawartość probówek zmieszać i obserwować zmianę zabarwienia.
UWAGA: Podobny efekt obserwuje się bez powyższych odczynników, np. na obranym ziemniaku, który po
pewnym czasie sinieje, ponieważ obecne w nim związki typu o-difenoli ulegają utlenieniu.
B. Oznaczanie witaminy C
1. Utlenianie witaminy C za pomocą heksacyjanożelazianu potasu
Zasada oznaczenia
W środowisku zasadowym kwas askorbinowy redukuje heksacyjanożelazian III potasu do
heksacyjanożelazianu II potasu. Ten ostatni wykrywa się dodając HCl i FeCl3 – w środowisku
kwaśnym powstaje błękit pruski.
Wykonanie
Przygotować dwie próbówki. Do pierwszej dodać 5 kropli 1% r-ru witaminy C, a do drugiej 5
kropli wody. Następnie do obydwu próbówek dodać 1 kroplę 10% NaOH i 1 kroplę 1%
żelazicyjanku potasu. Zawartość probówki wymieszać, a następnie dodać 3 krople 10% HCl i 1
kroplę 1% FeCl3. Obserwacje zanotować w zeszycie.
5|Strona
UWAGA!!!!!!
WSZYSTKIE ROZTWORY WYLEWAĆ
TYLKO DO SPECJALNYCH POJEMNIKÓW!!!
2. Oznaczanie witaminy C metodą Folina
Zasada oznaczenia
W obecności kwasu askorbinowego kwas fosfomolibdenowy (VII) ulega redukcji do
mieszaniny niższych tlenków molibdenu – błękitu molibdenowego. Odczynnik ten jest również
specyficznie redukowany przez kwas askorbinowy w pH 1-7. W tym zakresie pH poza witaminą C
inne reduktory obecne w płynach ustrojowych i tkankach nie redukują tego odczynnika.
Wykonanie
Ćwiczenie wykonuje się w suchych próbówkach jednocześnie wykonując krzywą wzorcową
oraz roztwory badane: sok z cytyny stojący na powietrzu i w świetle [1] oraz z lodówki [2], sok z
................... [3], sok z .......................... [4] oraz roztwory A [5] i B [6].
-Do próbówek wprowadzić kwas trichlorooctowy wg tabeli poniżej.
-Następnie należy odwirować po 1 ml soków w próbówkach o pojemności 1,5 ml (10000G, 5 min,
temp. pokojowa).
-Do krzywej wzorcowej wprowadzić roztwór kwasu askorbinowego o stężeniu 0,1 mg/ml, natomiast
do pozostałych próbówek po 0,5 ml soków oraz roztworów A i B.
Próby
Stężenie kwasu
0 g/ml
2,5 g/ml
5 g/ml
12,5 g/ml
25 g/ml
35 g/ml
askorbinowego
R-r wzorcowy
[ml]
R-r badany
10% TCA [ml]
badane
(od 1 do 6
0
0,05
0,1
0,25
0,5
0,7
0
0
2,0
0
1,95
0
1,9
0
1,75
0
1,5
0
1,3
0,5
1,5
-Do przygotowanych prób dodać po 0,2 ml odczynnika Folina i natychmiast po dodaniu
energicznie zamieszać. Po 10 min mierzyć absorbancję przy długości fali 750 nm względem
próby zerowej.
-Następnie należy wykreślić krzywą wzorcową na papierze milimetrowym i odczytać stężenia
badanych w badanych roztworach i sokach uwzględniając rozcieńczenia. Porównać stężenia
witaminy C w poszczególnych owocach i wpływ na jej zawartość warunków przechowywania.
Zagadnienia do ćwiczeń
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Podstawowe wiadomości o enzymach.
Klasyfikacja enzymów.
Charakterystyka i podział oksydoreduktaz.
Mechanizm ciemnienia enzymatycznego.
Kwas askorbinowy – budowa i funkcje w organizmie człowieka.
Źródła występowania kwasu askorbinowego.
Objawy nadmiaru i niedoboru witaminy C.
Rola kwasu askorbinowego jako kofaktora reakcji enzymatycznych wraz z przykładami.