Ćwiczenie 9 - oksydoreduktazy

Ćwiczenie 9
OKSYDOREDUKTAZY
Część doświadczalna obejmuje:
- wykrywanie aktywności katalazy, peroksydazy, oksydazy polifenolowej i oksydazy cytochromowej w ekstrakcie z bulwy ziemniaka
- oznaczanie aktywności fotochemicznej fotosystemu II w chloroplastach izolowanych z liści sałaty
(reakcja Hilla)
WPROWADZENIE
Oksydoreduktazy katalizują przeniesienie równowaŜników redukcyjnych między dwoma
układami redoks. Termin równowaŜnik redukcyjny określa kombinację elektronów i protonów,
które pojawiają się w procesach redoks (Ryc. 1).
Ryc. 1. RównowaŜniki redukcyjne w biologicznych układach redoks
Procesy oksydacyjno-redukcyjne w komórkach zachodzą we wszystkich przedziałach subkomórkowych (cytozolu, wewnętrznej błonie mitochondriów, w błonie tylakoidów, błonach siateczki
śródplazmatycznej, błonie jądrowej, a takŜe w przestrzeni międzykomórkowej). Procesy te są katalizowane przez enzymy współdziałające z rozpuszczalnymi (koenzymy) lub związanymi z białkiem
enzymatycznym (grupy prostetyczne) kofaktorami. NajwaŜniejszymi kofaktorami oksydoreduktaz
są: NAD+, NADP+, FMN, FAD, ubichinon (koenzym Q), plastochinon, plastocyjanina, lipoamid,
hem oraz kilka rodzajów centrów Ŝelazowo-siarkowych. Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy
(NAD+) oraz jego forma ufosforylowana – fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego
(NADP+), koenzymy przenoszące jony wodorkowe (2e- i 1H+) (Ryc. 2A), wykorzystywane są przez
ponad 200 oksydoreduktaz. W utlenionej formie tych koenzymów w pierścieniu aromatycznym amidu kwasu nikotynowego dodatnie ładunki są zdelokalizowane (Ryc. 2B). Jedna z dwóch przechodzących w siebie struktur ma w połoŜeniu para do atomu azotu ubogi w elektrony, dodatnio naładowany atom węgla. W to miejsce zostaje wprowadzony jon wodorkowy, tworząc zredukowane
formy NADH-H+ i NADPH-H+. Poprawny zapis zredukowanych koenzymów pokazuje, Ŝe przyjęciu jonu wodorkowego przez koenzym towarzyszy uwolnienie protonu.
1
A,
B,
Ryc. 2. Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy. A – ogólny wzór NADH.H+; B - przyłączenie jonu
wodorkowego do węgla w pierścieniu kwasu nikotynowego (Koolman, Röhm, 2005)
Powstawanie w komórce nadtlenku wodoru (H2O2)
W komórce nadtlenek wodoru powstaje w wielu róŜnych reakcjach. Jednym z jego źródeł jest
reakcja katalizowana przez dysmutazę ponadtlenkową – enzym usuwający aniony ponadtlenkowe
zgodnie z reakcją:
O-2 + O-2 + 2H+ ⇒ H2O2 + O2
Anion ponadtlenkowy (O-2) jest produktem ubocznym wielu reakcji redoks powstającym w wyniku
częściowej redukcji tlenu cząsteczkowego (przyjęcie jednego elektronu). Aniony ponadtlenkowe
powstają np. jako produkty uboczne przepływu elektronów przez centra Ŝelazowo-siarkowe (reakcja Mehlera) w obrębie fotosystemu I, czy w reakcji katalizowanej przez oksydazę NADPH.H+
zlokalizowaną w błonie komórkowej, gdzie aktywne formy tlenu słuŜą do obrony przed patogennymi drobnoustrojami.
WaŜnymi enzymami wytwarzającymi H2O2 są takŜe oksydazy flawoproteinowe, do których naleŜą m. in. oksydazy L-aminokwasowe i D-aminokwasowe. Utlenianie aminokwasu przebiega zgodnie z reakcją:
aminokwas + O2 + H2O ⇒ ketokwas + H2O2 + NH3
2
W komórkach zwierząt H2O2 powstaje takŜe w peroksysomach w reakcji utleniania kwasów
tłuszczowych o dłuŜszym niŜ 18C łańcuchu węglowodorowym. W tym wypadku szlak β-oksydacji,
podobnie jak utlenianie kwasów tłuszczowych u roślin, rozpoczyna się od reakcji katalizowanej
przez oksydazę acylo-CoA zgodnie z równaniem:
acylo-CoA + O2 ⇒ Δ2 –enoilo-CoA + H2O2
Bogatym źródłem H2O2 w komórkach roślin jest szlak przemian określany jako fotooddychanie. Enzym „rubisco” (karboksylaza/oksygenaza rybulozo-1,5-bisfosforanu) moŜe do rybulozo1,5-bisfosforanu przyłączać CO2 lub O2. W pierwszym wypadku powstają 2 cząsteczki kwasu 3fosfoglicerynowego, natomiast w reakcji, w której zamiast CO2 uczestniczy O2 powstaje 1 cząsteczka kwasu fosfoglicerynowego i 1 cząsteczka kwasu 2-fosfoglikolanowego. Powstający w chloroplastach 2-fosfoglikolan jest najpierw defosforylowany, a następnie powstający glikolan w peroksysomach zostaje utleniony przez oksydazę glikolanową do glioksalanu zgodnie z reakcją:
glikolan + O2 ⇒ glioksalan + H2O2
Nadtlenek wodoru jest związkiem szkodliwym, głównie ze względu na moŜliwość powstawania w
.
obecności Fe2+ rodników hydroksylowych OH, a takŜe tlenu singletowego 1O2.
Enzymatyczne usuwanie H2O2
Enzymami funkcjonującymi w usuwaniu H2O2 są: katalaza i peroksydaza.
Katalaza, enzym zawierający hem, dysproporcjonuje dwie cząsteczki H2O2 do H2O i O2 zgodnie z równaniem:
2 H2O2 ⇒ 2H2O + O2
Katalazy mogą takŜe wykazywać aktywność peroksydacyjną, w której H2O2 jest wykorzystywany do
utleniania alkoholi, aldehydów, fenoli czy azotynów.
Peroksydazy redukują nadtlenek wodoru równocześnie utleniając (odwodorowując) róŜne substraty. Reakcję katalizowaną przez peroksydazy moŜna zapisać:
SH2 + H2O2 ⇒ S + 2H2O
SH2 i S to odpowiednio substrat w stanie zredukowanym i utlenionym. Grupą prostetyczną peroksydaz roślinnych jest Ŝelazoprotoporfiryna (hemina), natomiast enzymy zwierzęce zawierają inny
typ heminy. WaŜną funkcję ochronną w komórkach zwierząt i roślin spełnia peroksydaza glutationowa współdziałająca z glutationem w usuwaniu nadtlenku wodoru i szkodliwych nadtlenków organicznych. W centrum aktywnym tego enzymu występuje analog cysteiny (selenocysteina), w którym
siarka została zastąpiona selenem.
3
Oksydazy fenolowe – przenoszą elektrony i protony z orto- lub para-dwufenoli na tlen. Oksydaza o-dwufenolwa poza utlenianiem o-dwufenolu katalizuje takŜe reakcję hydroksylacji
Oksydaza cytochromowa (EC 1.9.3.1) – końcowe ogniwo łańcucha transportu elektronów zlokalizowanego w wewnętrznej błonie mitochondriów
Łańcuch oddechowy katalizuje transport elektronów z NADH-H+ lub zredukowanego ubichinonu na tlen cząsteczkowy. Ubichinon moŜe być redukowany enzymatycznie w reakcjach, w których np. utleniany jest bursztynian bądź flawoproteina (ETF) redukowana przez dehydrogenazę acylo-CoA, dehydrogenazę 3-fosfoglicerynianu lub dehydrogenazy utleniające cholinę czy dihydroorotan. Większa część energii towarzysząca reakcjom redoks wykorzystywana jest do formowania w
poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej gradientu protonowego, który z kolei napędza
syntezę ATP katalizowaną przez syntazę ATP. Łańcuch oddechowy obejmuje 3 białkowe kompleksy (kompleks I, III i IV) oraz dwie cząsteczki przenośnikowe: ubichinon (Q) i cytochrom c
(Ryc. 3). Poza tym, z błoną wewnętrzną związana jest dehydrogenaza bursztynianowa (kompleks
II) oraz inne dehydrogenazy przekazujące elektrony na ubichinon (Q) (nie pokazano na Ryc. 3 ).
Ryc. 3. Transport elektronów w łańcuchu oddechowym utworzonym przez trzy kompleksy białkowe
i dwa ruchome nośniki (ubichinon i cytochrom c) przenoszące elektrony z utlenianego substratu na
tlen. Transportowi elektronów wzdłuŜ łańcucha oddechowego towarzyszy wektorowe pompowanie
protonów z matriks do przestrzeni międzybłonowej (Alberts i wsp. 1999)
Oksydaza cytochromowa przejmuje elektrony z małego białka - cytochromu c - zawierającego
Ŝelazo w układzie hemowym i przekazuje je na tlen cząsteczkowy (Ryc. 3). Do redukcji cząsteczki
tlenu (O2) do dwóch cząsteczek wody potrzebne są 4 elektrony (4 cząsteczki zredukowanego
cytochromu c). Przeniesieniu dwóch elektronów przez związane z enzymem kofaktory (dwa jony
4
miedzi (CuA i CuB), jony Ŝelaza w dwóch układach hemowych – hem a i hem a3) towarzyszy wypompowanie z matriks do przestrzeni międzybłonowej 4 H+.
Fotosystem II – kompleks białkowy zawierający chlorofil a, utleniający na świetle wodę i redukujący plastochinon (PQ)
Redukcja NADP+ oraz synteza ATP w chloroplastach zaleŜna jest od ciągu reakcji oksydacyjnoredukcyjnych zapoczątkowanych pochłonięciem kwantów światła przez dwa układy barwników fotosystem II i I. Efektem fotochemicznego wzbudzenia układu barwników jest transport elektronów przez kolejne przenośniki chloroplastowego łańcucha transportu elektronów. Układy barwników fotosystemu II (PS II) i fotosystemu I (PS I) są zbudowane z centrów reakcji i barwników
towarzyszących. W skład centrum reakcji fotosystemu II wchodzą dwie cząsteczki chlorofilu a –
oznaczonego na schemacie jako P-680, a fotosystemu I dwie cząsteczki chlorofilu P-700. Zaabsorbowane kwanty światła wybijają elektrony z PS II, które są dostarczane przez szereg przenośników
do PS I, a stamtąd do NADP+. Ciągłym źródłem elektronów dopływających do PS II, a następnie
do PS I i ostatecznie redukujących NADP+ jest woda utleniana przez PS II (Ryc.4).
K4[Fe(CN)6]
K3[Fe(CN)6]
Ryc. 4. Schemat fotosyntetycznego łańcucha transportu elektronów. Na schemacie górnym zaznaczono miejsce, w którym Ŝelazicyjanek potasu przejmuje elektrony z plastochinolu (PQ) pełniąc w ten sposób funkcję
sztucznego akceptora elektronów (Buchanan BB, Gruissem W, Jones RL 2000,)
5
Stosowanie odpowiednich sztucznych akceptorów lub donorów elektronów wraz z odpowiednimi
inhibitorami transportu elektronów pozwala na niezaleŜne badanie aktywności obydwu fotosystemów. Sztucznym akceptorem elektronów z PS II moŜe być Ŝelazicyjanek potasu (K3[Fe(CN)6]),
który jest redukowany do Ŝelazocyjanku (K43[Fe(CN)6]). Wartość potencjału oksydacyjnoredukcyjnego tej pary redoks określa zaznaczone na schemacie miejsce pobierania elektronów przez
K3[Fe(CN)6]).
WYKONANIE
Odczynniki:
A, Wykrywanie aktywności katalazy, peroksydazy, oksydazy polifenolowej i oksydazy
cytochromowej
- 3% roztwór H2O2,
- roztwór KCN, UWAGA! KCN jest silną trucizną !
- roztwór benzydyny w kwasie octowym,
- odczynnik NADI (przygotować bezpośrednio przed uŜyciem, mieszając p-fenyleno-dwuaminę
z α-naftolem w stosunku 1 : 1 (1 ml + 1 ml),
- 0,1M bufor fosforanowy o pH 7,4.
- bufor fosforanowy o pH 7,4,
- roztwór pirokatechiny
Ekstrakt z ziemniaka. Umyty i obrany ziemniak utrzeć na tarce. Miazgę włoŜyć do woreczka z
gazy i zanurzyć w zlewce zawierającej około 200 ml wody, a następnie lekko wycisnąć zawartość.
Roztwór łagodnie wymieszać. Po opadnięciu skrobi na dno zlewki, płyn ostroŜnie zlać znad osadu.
Uzyskujemy w ten sposób wodny ekstrakt enzymu. Część nadsączu (około 50 ml) przelać do zlewki
i zagotować, a następnie zdenaturowany termicznie ekstrakt ostudzić wkładając zlewkę do zimnej
wody.
B, Izolowanie chloroplastów i oznaczanie aktywności fotochemicznej fotosystemu II
- 0.3 M sacharoza w 50 mM buforze (K) fosforanowym, pH 7.4
- 6 mM K3[Fe(CN)6] w wodzie
- 0.2 M sacharoza w 50 mM buforze (K) fosforanowym, pH 7.4 zawierającym 10 mM KCl
- 10% (w/v) TCA
Liście sałaty pozostawione przed ćwiczeniem na 24 godz. w ciemności
6
Wykrywanie aktywności katalazy i peroksydazy
Zasada wykrywania katalazy:
Tlen uwolniony w reakcji dysproporcjowania H2O2 katalizowanej przez katalazę wydzielając się z
roztworu powoduje jego silne pienienie.
2 H2 O2
2 H2O + O2
Wykonanie:
Do trzech probówek napipetować po około 2 ml : a - ekstraktu z ziemniaka , b - zagotowanego
ekstraktu z ziemniaka oraz c - ekstraktu z ziemniaka z dwoma kroplami roztworu NaCN. Do kaŜdej
z prób dodać 5 kropli 3% nadtlenku wodoru. Gwałtownie wydzielające się pęcherzyki tlenu są
świadectwem prawidłowo przebiegającej reakcji.
Zasada wykrywania peroksydazy:
Benzydyna w obecności H2O2 ulega utlenieniu przez peroksydazę do błękitu benzydynowego
Wykonanie:
7
Do 5 probówek odmierzyć podaną w tabeli I objętość ekstraktu z ziemniaka, benzydyny, H2O2,
KCN i H2O. Do probówki nr 4 dodać zagotowany ekstrakt. Zawartość probówek wymieszać i
postawić na 20 min. w temperaturze pokojowej Obserwować zachodzące zmiany i zanotować
wyniki.
Tabela I. Wykrywanie aktywności peroksydazy
Próba
Wyciąg
Woda
Benzydyna
KCN
H2O2
nr
ml
ml
ml
ml
ml
1
2,5
0
0,1
0
0,1
2
2,5
0,1
0
0
0,1
3
2,5
0
0,1
2 krople 0,1
4
2,5
0
0,1
0
0,1
5
2,5
0,1
0,1
0
0
Wykrywanie aktywności oksydazy polifenolowej (EC 1.10.3.2)
Oksydaza polifenolowa przenosi wodór bezpośrednio na tlen cząsteczkowy. Substratami w tej reakcji
są zwykłe fenole, które utleniają się do chinonów. Chinony kondensując dają barwne pochodne. Enzym jest
metaloproteiną, zawierającą miedź.
Zasada:
Oksydaza polifenolowa utlenia pirokatechinę do chinonów, które kondensując dają ciemno-
brunatne zabarwienie.
Wykonanie:
Do 5 probówek odmierzyć podane w tabeli II objętości ekstraktu z ziemniaka, wody, buforu, pirokatechiny i 4% roztworu NaCN. Do probówki nr 4 dodać ekstrakt zawierający termicznie zde-
naturowane białka. Zawartość wszystkich probówek starannie wymieszać, zanotować czas i pozo8
stawić w temperaturze pokojowej. W celu lepszego dostępu tlenu, próby od 1--4 co pewien czas
wstrząsnąć. Po 20 min zanotować wyniki reakcji.
Tabela II. Wykrywanie aktywności oksydazy polifenolowej
Próba
Wyciąg
Woda
Bufor pH 7,4 KCN
Pirokat.
nr
ml
ml
Ml
ml
1
1
0
1
0
0,1
2
1
0,1
1
0
0
3
1
0
1
2 krople 0,1
4
1
0
1
0
0,1
5
1
0
1
0
0,1
Wykrywanie aktywności oksydazy cytochromowej
Zasada:
Obecność oksydazy cytochromowej w ekstrakcie tkankowym moŜna wykazać w reakcji, w której wykorzystywany jest odczynnik NADI. W skład odczynnika wchodzą: α-naftol i p-
fenylenodwuamina zmieszane w stosunku 1:1. W wyniku nieenzymatycznej redukcji zawartego w mitochondriach cytochromu c przez p-fenylenodwuaminę powstaje p-fenylenodwuimina,
która w obecności α-naftolu przechodzi w barwny, niebieski kompleks.
Wykonanie:
Do 4 probówek odmierzyć podane w tabeli III objętości poszczególnych roztworów; do probówki nr
4 dodać zagotowany nadsącz. Próby starannie wymieszać i pozostawić na 30 min w temperaturze
pokojowej. Obserwować powstanie niebieskiej barwy. Wyniki zapisać w tabeli.
Tabela III. Wykrywanie oksydazy cytochromowej
9
Próba
nr
Wyciąg
ml
Woda
Bufor pH 7,4
ml
KCN
Ml
NADI
ml
1
1
0
1
0
0,1
2
1
0
1
1 kropla
0,1
3
1
0,1
1
0
0
4
1
0
1
0
0,1
Izolowanie chloroplastów i oznaczanie aktywności fotosystemu II
Aktywne fotochemicznie chloroplasty izoluje się w izotonicznym środowisku wodnym o pH 7.4.
W czasie homogenizacji liści otrzymuje się kilka klas chloroplastów róŜniących się stopniem zachowania integralności strukturalnej. Chloroplasty klasy A (zachowujące zdolność asymilacji CO2)
muszą posiadać nienaruszone błony – zewnętrzną i wewnętrzną. Badanie aktywności fotochemicznej oraz zdolności do fotofosforylacji moŜna wykonywać na chloroplastach, które mają częściowo
uszkodzone błony (chloroplasty klasy B).
Chloroplasty moŜna otrzymywać z liści sałaty lub 10- 12-dniowych liści pszenicy przechowywanych przed doświadczeniem przez 24 godz. w ciemności w celu usunięcia skrobi.
20 g ściętych i częściowo pociętych liści homogenizować w schłodzonym moździerzu z 50 ml
roztworu homogenizacyjnego zawierającego: 0.3 M sacharozę w 50 mM buforze (K) fosforanowym,
pH 7.4. W celu łatwiejszego roztarcia liści moździerz moŜna wyłoŜyć nylonem oraz gęstą nylonową
siatką (na tym etapie wszystkie pary pracują razem; chloroplasty uzyskane z 20 g liści wystar-
czą dla 4 par). Uzyskany homogenat przesączyć przez nylon, a następnie wirować przez 2 minuty przy 300 x g (1900 obr/min. w wirniku o promieniu 7 cm). Otrzymany nadsącz (supernantant)
zlać i poddać ponownemu wirowaniu przy 2000 x g przez 10 minut (5000 obr/min.w wirniku o
promieniu 7 cm). Uzyskany osad zawierający „surową” frakcję chloroplastów dokładnie rozpro-
wadzić pipetą pasterowską w niewielkiej objętości roztworu zawierającego: 0.2 M sacharozę, 50
mM bufor fosforanowy, 10 mM KCl, a następnie w cylindrze uzupełnić tym samym roztworem do
objętości 20 ml. Teraz kaŜda ćwiczeniowa para pobiera dla siebie po 5 ml klarownej zawiesiny
chloroplastów.
Pomiar aktywności fotochmicznej PS II metodą spektrofotometryczną (reakcja Hilla)
Zasada:
10
K3[Fe(CN)6] moŜe być uŜywany jako sztuczny akceptor elektronów pochodzących z PS II (Ryc.
4). W wyniku naświetlania wyizolowanych chloroplastów Ŝelazicyjanek ulega redukcji do Ŝelazo-
cyjanku zgodnie z reakcją:
PS II + światło
+
4 K4[Fe(CN)6] + 4 H+ + O2
4 K3[Fe(CN)6] + 4 K + 2 H2O
Redukcji Ŝelazicyjanku towarzyszy spadek absorbancji mierzonej przy 420 nm. Mierząc zmiany
absorbancji moŜna obliczyć ilość nmoli powstałego Ŝelazocyjanku w określonej jednostce czasu, w
przeliczeniu na mg chlorofilu lub mg białka chloroplastowego.
Wykonanie:
Do 3 probówek wirówkowych napipetować po 1.5 ml zawiesiny chloroplastów (kaŜda para pra-
cuje oddzielnie!). W zaciemnionym pomieszczeniu, w warunkach przyciemnionego zielonego światła, dodać do kaŜdej próby po 0.5 ml 6 mM roztworu K3[Fe(CN)6]. (UWAGA! Proszę zwrócić
uwagę na dokładność pipetowania!). Próbę kontrolną umieścić w całkowitej ciemności (6 otwór
w statywie), natomiast pozostałe 2 próby naświetlać rzutnikiem przez 2 i 4 minuty. W odpowiednim czasie reakcję hamować dodając do naświetlanych prób po 2 ml 10% roztworu TCA. Próby
natychmiast dobrze wytrząsnąć i odstawić do statywu. Po zahamowaniu reakcji w 2 próbie (4 min
naświetlania) dodać równieŜ 2 ml 10% TCA do próby kontrolnej (nienaświetlanej). Wytrącone
białka odwirować przy 3000 obr/min. przez 10 minut. W celu dokonania pomiarów, do suchych
probówek ściągnąć ostroŜnie z nad osadu po około 2 ml klarownego (!) nadsączu i zmierzyć absorbancję kaŜdej próby względem wody destylowanej. (λ = 420nm). Wykreślić na papierze milimetrowym zmiany absorbancji w zaleŜności od czasu naświetlania, a następnie zaleŜność ∆A (absorbancja próby kontrolnej minus absorbancja próby badanej) od czasu naświetlania kolejnych prób.
W obliczeniach stęŜenia powstającego w wyniku reakcji K4[Fe(CN)6] przyjąć wartość molowego
współczynnika absorpcji dla K3[Fe(CN)6] równą 1040. Obliczyć ilość K4[Fe(CN)6], wyraŜoną w
nmolach, powstającego w ciągu 60 min w warunkach wykonanego doświadczenia. W obliczeniach proszę uwzględnić objętość końcową prób wynoszącą 4 ml (2 ml mieszaniny reakcyjnej + 2
ml 10% TCA).
11
Zagadnienia do przygotowania:
- koenzymy oksydoreduktaz
- łańcuch transportu elektronów w mitochondriach (przenośniki elektronów związane z kompleksem
I, III i IV; generowanie transbłonowego gradientu protonowego)
- funkcjonowanie łańcucha transportu elektronów w błonach tylakoidów
- reakcje produkujące w komórce nadtlenek wodoru
- enzymy usuwające H2O2 (róŜnica między katalazą a peroksydazą)
Piśmiennictwo:
Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005
Ćwiczenia z biochemii - (pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz) PWN, Warszawa, 2005
Biochemistry & Molecular Biology of Plants – Buchanan BB, Gruissem W, Jones RL 2000, Rockville
Biochemia. Ilustrowany przewodnik – J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005
12