Poradnik Real-Time PCR — opis procedury i podpowiedzi ekspertów

Poradnik Real-Time PCR — opis procedury i podpowiedzi
ekspertów
Real-time PCR, czyli PCR w czasie rzeczywistym, zwany również ilościowym PCR (qPCR), stanowi
modyfikację klasycznej reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. PCR, Polymerase Chain Reaction).
Modyfikacja ta, przy zastosowaniu odpowiednich barwników i sond oraz odpowiedniej aparatury,
umożliwia monitorowanie przyrostu produktu w każdym kolejnym cyklu trwania reakcji. Technika
znalazła szerokie zastosowanie m.in. w diagnostyce medycznej, kryminalistyce, przemyśle spożywczym
oraz w badaniach naukowych. Prezentowany poradnik opisuje krok po kroku procedury wykorzystywane
przy przygotowaniu próbek oraz reakcji Real-time PCR, informacje dotyczące interpretacji wyników
wzbogacone o komentarze ekspertów z poznańskiego Centrum Edukacji Bio-Medycznej, którzy
zawodowo prowadzą szkolenia z praktycznego wykorzystania tej techniki oraz rutynowo wykorzystują ją
do celów diagnostycznych oraz badawczych.
Zawartość poradnika:










Czym charakteryzuje się Real-Time PCR i w jakich sytuacjach się go stosuje?
PCR vs. real-time PCR
Etap przedanalityczny – krytyczny dla dobrze przeprowadzonego doświadczenia
Przygotowanie matrycy
Projektowanie eksperymentu – projektowanie starterów i sondy
Skład mieszaniny reakcyjnej
Strategie monitorowania przyrostu produktu – rodzaje sond
Wybór aparatury
Analiza najczęściej popełnianych błędów podczas wykonywania reakcji Real-time
PCR
Podsumowanie
Czym charakteryzuje się Real-Time PCR i w jakich sytuacjach się go stosuje?
W odróżnieniu od klasycznej reakcji łańcuchowej polimerazy, która umożliwia nam analizę
wyłącznie etapu końcowego reakcji, po zakończonej amplifikacji (faza plateau), PCR w czasie
rzeczywistym umożliwia nam również pogląd fazy wzrostu wykładniczego, logarytmicznego, a
także poprzedzającą je fazę wstępną. W pierwszych etapach reakcji, czyli w fazie wstępnej
następuje powolne powielenie produktu. Długość tej fazy związana jest z wyjściowym stężeniem
DNA stanowiącego matrycę. W miarę przyrostu produktu, poziom fluorescencji przekracza
poziom tła. Cykl reakcji, w którym nastąpiło przekroczenie tego poziomu oraz wejście w fazę
wzrostu wykładniczego zwany jest cyklem progowym (CT, ang. threshold cycle lub CP,
ang. crossing point), produkt osiąga wartość progową fluorescencji (FT, ang. fluorescence
treshold). Im wyższe wyjściowe stężenie matrycowego DNA, tym krzywa amplifikacji szybciej
przekroczy wartość progową. Wyznaczenie punktu przecięcia linii progowej dla określonego
produktu, oraz wykreślenie krzywej standardowej dla punktów przecięcia zastosowanego szeregu
standardów umożliwia wykonanie pomiaru ilościowego oraz podanie konkretnych wartości
liczbowych dla ilości kopii określonego amplikonu w badanym materiale.
Ze względu na dużo wyższą czułość niż klasyczna PCR, Real-time, PCR umożliwia detekcję
nawet przy nie wielkim wyjściowym stężeniu matrycy. Z tego względu znalazła szerokie
zastosowanie m.in. w diagnostyce mikrobiologicznej. Umożliwia oznaczenia ilościowe oraz
jakościowe obecności materiału genetycznego określonego patogenu w materiale klinicznym. Z
powodzeniem znajduje zastosowanie w przypadku diagnostyki patogenów trudnych do
identyfikacji klasycznymi metodami. W diagnostyce stosowana jest również w identyfikacji mutacji
genetycznych związanych z określonymi procesami chorobotwórczymi czy predyspozycją do
określonych jednostek chorobowych. Szeroko stosowana jest przy ocenie ekspresji genów oraz
metabolizmu leków. W przemyśle spożywczym znalazła zastosowanie przy analizie obecności
GMO oraz jego ilości w produktach spożywczych.
PCR vs. Real-time PCR
Najistotniejszymi zaletami zastosowania techniki Real-time PCR to jej dużo wyższa czułość i
precyzja. Technika ta umożliwia nam analizę materiału nawet o niewielkim stężeniu wyjściowym
DNA. Czynnikiem przemawiającym na korzyść Real-time PCR jest również możliwość
przeprowadzania analiz ilościowych z podaniem konkretnych wartości liczbowych określających
ilość kopii określonego amplikonu w jednostkach objętości. Ze względu na fakt, iż nie wymaga
przeprowadzenia dodatkowych etapów mających na celu wizualizację uzyskanych produktów,
metoda jest znacznie mniej czaso- i pracochłonna. Pomijając etap przeniesienia próbek na żel w
celu przeprowadzenia elektroforezy zmniejszone zostało również ryzyko kontaminacji próbek
innymi produktami po reakcji PCR. Real-time PCR charakteryzuje również szeroki zakres
oznaczanych stężeń oraz wysoka powtarzalność uzyskiwanych wyników. W zasadzie jedynymi
wadami wydają się być wymagania sprzętowe oraz wyższy koszt analizy.
Etap przedanalityczny – krytyczny dla dobrze przeprowadzonego doświadczenia
Istotnym etapem jest etap przedanalityczny, związany m.in. z pobraniem materiału, jego
przechowywaniem i izolacją. Istotne jest zachowanie warunków czasowych i temperaturowych.
Niewłaściwe obchodzenie się z materiałem może wpłynąć na jego degradację lub uzyskanie
materiału złej jakości, co w konsekwencji może doprowadzić do uzyskania wyników fałszywie
negatywnych lub w przypadku oznaczeń ilościowych uzyskania wartości zaniżonych. Należy
zaznaczyć, że najwrażliwsze na proces przedanalityczny jest RNA. W przypadku analizy RNA,
punkt krytyczny stanowi również etap odwrotnej transkrypcji, czyli przepisania informacji w nim
zawartej na cDNA. Również od wydajności tego etapu zależy prawidłowość dalszych oznaczeń.
Przygotowanie matrycy
Matrycę do reakcji Real-time PCR stanowi DNA lub RNA. W przypadku analizy RNA po
zakończonej izolacji wymagane jest przeprowadzenie odwrotnej transkrypcji w celu przepisania
informacji genetycznej na cDNA. Technika uniemożliwia nam analizę bezpośrednio RNA, białek,
lipidów czy innych składników komórkowych. Izolacja kwasów nukleinowych najczęściej zachodzi
z wykorzystaniem komercyjnych zestawów wykorzystujących zdolność specyficznego wiązania
DNA lub RNA do złóż krzemionkowych, jego obmycie z zanieczyszczeń i elucję w końcowym
etapie izolacji. Podstawowym założeniem tego etapu jest uzyskanie izolatów z maksymalną
wydajnością, wysokocząsteczkowych, przy jednoczesnym oczyszczeniu preparatów z białek i
inhibitorów reakcji. W przypadku niektórych analiz, m.in. wykorzystujących topienie wysokiej
rozdzielczości (ang. HRM, High Resolution Melt) istotna jest normalizacja stężeń DNA przed
dodaniem go do reakcji. Niezrównoważone stężenia próbek analizowanych w jednej reakcji mogą
wpływać na błędną interpretację wyników. W przypadku analizy RNA po zakończonej izolacji
istotne jest przeprowadzenie – wcześniej wspominanej – odwrotnej transkrypcji.
Projektowanie eksperymentu - projektowanie starterów i sondy
W przypadku reakcji Real-time PCR istotny jest dobór optymalnych warunków reakcji PCR,
gwarantujących maksymalną wydajność oraz specyfikę zachodzącej amplifikacji. Pierwszym
etapem jestzaprojektowanie odpowiednich starterów i sondy.
W praktyce trudniej zaprojektować sondę, dlatego lepiej wcześniej wybrać potencjalne miejsce
przyłączenia sondy, zanim zaprojektuje się startery. Sondę należy dobrać tak, aby jej
temperatura topnienia była o ok. 10°C wyższa od temperatury topnienia starterów. W przeciwnym
razie, po zakończonej denaturacji, starter wydłużany przez polimerazę może zablokować miejsce
łączenia się sondy. Istotny jest również dobór odpowiednich barwników reporterowych i
wygaszaczy fluorescencji. Przy wyborze barwnika należy kierować się dostępnymi kanałami
detekcji w aparacie. Najczęściej stosowane sondy to FAM (dająca odczyt na kanale zielonym)
oraz YOE czy VIC (odczyt na kanale żółtym). Przy prowadzeniu reakcji typu "multiplex" barwniki
należy dobrać w taki sposób, aby zminimalizować ryzyko nachodzenia na siebie ich widm. W
przeciwnym razie może dojść do "przebicia" sygnału na drugi kanał detekcji. Analiza ekspresji
genów wymaga od nas wyboru odpowiedniego wewnętrznego genu referencyjnego
(ang. housekeeping gene). W praktyce nie istnieje idealny gen referencyjny, dlatego należy
wybrać taki, który charakteryzuje się względnie stałą ekspresją w różnych warunkach
eksperymentalnych. Technika HRM wymaga od nas szczególnej uwagi przy projektowaniu
warunków reakcji, ustalenia optymalnych warunków amplifikacji, użycia odpowiednich barwników
przeznaczonych do tego typu analiz (SYBR Green się nie nadaje). Od aparatu wymagany jest
precyzyjny pomiar poziomu fluorescencji towarzyszącym zmianom temperatury nawet o 0.1oC.
Zaleca się przeprowadzenie analizy w większej ilości powtórzeń dla pojedynczej próbki oraz
każdorazowo normalizacja stężeń dla próbek oznaczanych w jednej partii.
Projektowane startery powinny być wysoce specyficzne do amplifikowanej sekwencji. W
przypadku Real-time PCR stosuje się takie same zasady projektowania starterów, jak w
klasycznej PCR. Optymalna długość startera to od 18 do 22 nukleotydów. Temperatury topnienia
starterów z jednej pary nie powinny różnić się o więcej niż 5°C. Standardowa temperatura
topnienia powinna zawierać się w przedziale 52-58°C. Im wyższa temperatura topnienia tym
niższe ryzyko uzyskania niespecyficznych produktów reakcji. Dla stabilności wiązania startera z
matrycą istotne jest zachowanie zawartości par guaniny (G) i cytozyny (C) w przedziale 40-60%.
Istotny jest również zrównoważony rozkład nukleotydów GC i AT. Należy unikać starterów z
długimi powtórzeniami jednego z nukleotydów (>3,4). Dla uzyskania wysokiej wydajności reakcji
należy unikać starterów tworzących struktury drugorzędowe lub struktury typu primerdimer między oligonukleotydami z jednej pary starterów. Jest to szczególnie istotne w przypadku
stosowania w reakcji barwników interkalujących, które łączą się we wszystkie dwuniciowe
struktury w mieszaninie reakcyjnej. W takiej sytuacji możliwe jest uzyskanie sygnału nie tylko z
interesującego nas produktu, ale również z niespecyficznych produktów reakcji oraz struktur
drugorzędowych utworzonych między starterami.
Temperatura topnienia oraz powyższe parametry muszą być podobne dla obydwu starterów. Po
zaprojektowaniu pary starterów należy sprawdzić specyfikę sekwencji z sekwencją docelową. W
następnym etapie pozostaje już eksperymentalnie ustalić warunki reakcji z maksymalną
wydajnością oraz specyfiką. W kolejnych etapach pozostaje już sprawdzić warunki z dodatkiem
znacznika fluorescencyjnego oraz próby z materiałem klinicznym.
W Centrum Edukacji Bio-Medycznej prowadzone są szkolenia, poświęcone tematyce
projektowania starterów i sond oraz optymalizacji warunków do reakcji Real-time PCR. Część
wykładowa pozwala zapoznać się z warunkami projektowania oraz optymalizacji, a warsztaty
dają możliwość sprawdzenia nabytej wiedzy w praktyce.
Skład mieszaniny reakcyjnej
Skład mieszaniny reakcyjnej do Real-time PCR jest bardzo zbliżony do tego wykorzystywanego
w klasycznej PCR. Istotnymi elementami są DNA lub cDNA stanowiące matrycę dla nowo
syntetyzowanej nici. Kolejnymi istotnymi składnikami są: mieszanina czterech trifosforanów
deoksyrybonukleotydów stanowiących budulec dla nici potomnej, para starterów
komplementarnych do sekwencji docelowej, barwnik interkalujący lub sonda wyznakowana
fluorescencyjnie. Składnikiem, na który powinniśmy szczególnie zwrócić uwagę jest odpowiednia
polimeraza DNA. Wybór polimerazy determinowany jest przez zastosowaną strategię
monitorowania przebiegu reakcji (patrz poniżej). Zastosowanie sond typu TaqMan wymaga
zastosowania polimerazy z aktywnością 5’-3’ egzonukleazową, w przypadku barwników
interkalujących zaleca się stosowanie polimeraz typu Hot-start. Dla zapewnienia optymalnych
warunków dla działania polimerazy wymagane jest zastosowania buforu gwarantującego
optymalne pH oraz odpowiednie stężenie jonów magnezu. W praktyce istnieje możliwość zakupu
komercyjnych zestawów do reakcji Real-time PCR o optymalnym składzie mieszaniny reakcyjnej.
Zastosowanie tego typu zestawów wymaga od nas jedynie dodania starterów oraz matrycy.
Niektóre składniki odczynników wykorzystywanych do sporządzania mieszaniny reakcyjnej, mogą
osadzać się na dnie pojemnika przechowywanego w zamrażarce lub lodówce. Należy zatem
pamiętać o dokładnym wymieszaniu odczynników przed rozpoczęciem pipetowania.
Strategie monitorowania przyrostu produktu – rodzaje sond
Wyróżnia się dwie podstawowe strategie umożliwiające monitorowanie przyrostu produktu w
czasie rzeczywistym. Strategie przedstawione zostały poniżej.


Barwniki interkalujące – barwniki fluorescencyjne interkalujące w strukturę dwuniciowego
DNA. Początkowo wykazują emisję słabej fluorescencji, której poziom wzrasta po związaniu
się barwnika z dwuniciową strukturą DNA. Technika nie wymaga zastosowania
skomplikowanej sondy, co znacznie obniża koszty. Wadą stosowania barwników
interkalujących jest fakt, iż łączą się do każdej dwuniciowej struktury DNA. Oprócz sekwencji
docelowej możliwe jest uzyskanie wyniku dla niespecyficznych produktów reakcji, struktur
drugorzędowych tworzących się w obrębie startera lub strukturami primer-dimer. W związku z
powyższym szczególnie istotne jest zagwarantowanie specyfiki reakcji lub uzupełnienie
analizy o wygenerowanie krzywych topnienia, które umożliwiają odróżnić produkt docelowy
od afektorów. Najczęściej stosowane barwniki to SYBR Green oraz stosowane w technice
HRM EvaGreen, LCGreen i inne.
Sondy fluorescencyjne – to znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydy. Ze względu na
komplementarność do sekwencji docelowej dodatkowo zwiększają specyfikę reakcji.
Działanie sond oparte jest na zjawisku bezpromienistego transferu energii (ang. FRET,
ang. fluorescence resonance energy transfer). Poniżej wymienione zostały najczęściej
stosowane sondy:
o
Sondy TaqMan – Tzw. „sondy degradacyjne”, oligonukleotydy znakowane na
jednym końcu 5’ barwnikiem fluorescencyjnym reporterowym a na końcu 3’ barwnikiem
wygaszającym fluorescencję (ang. quencher). Barwnik reporterowy nie może emitować
fluorescencji w bezpośredniej bliskości wygaszacza. Emisja następuje po hydrolizie
sondy przez aktywność 5’->3’ egzonuklazową Taq polimerazy (bądź innej polimerazy
posiadającej taką aktywność). Następuje wówczas oddzielenie reportera od wygaszacza
i wzrost poziomu fluorescencji.
o
Sondy hybrydyzacyjne – HybProbe; strategia opiera się na wykorzystaniu dwóch
sond komplementarnych do sekwencji docelowej, jedna sonda znakowana na końcu 3’
donorem energii, druga natomiast na końcu 5’ akceptorem. Do emisji dochodzi w
przypadku przyłączenia się do matrycy obydwóch sond w odległości nie większej niż 5 nt.
Następuje wówczas transfer energii z donora na akceptor i wzrost fluorescencji. Na
etapie wydłużania DNA, obie sondy fluorescencyjne są usuwane z kompleksu i
fluorescencja zanika. Stąd natężenie fluorescencji na etapie hybrydyzacji jest
proporcjonalne do ilości kopii badanej sekwencji DNA na końcu poprzedniego cyklu PCR.
o
Molecular Beacon – sondy DNA tworzące dzięki komplementarności fragmentów
oskrzydlających strukturę spinki do włosów. Znakowane na końcach barwnikiem
reporterowym i wygaszaczem. Środkowa część sondy musi być idealnie komplementarna
do matrycy – niedopasowanie kompleksu sonda-matryca faworyzuje strukturę "spinki do
włosów" sondy. Sonda ulega rozpleceniu w przypadku napotkania sekwencji w pełni
komplementarnej do sekwencji wewnętrznej sondy. Następuje wówczas oddzielenie
reportera i wygaszacza oraz emisja fluorescencji. Sondy tego typu uznawane są za
najczulsze narzędzie służące do wykrywania mutacji typu SNP.
o
Sondy Skorpion – najbardziej skomplikowane w swej budowie. Stanowią
modyfikację sondy typu Molecular Beacon. Modyfikacja polega na dołączeniu do
struktury spinki startera dla reakcji PCR. Pomiędzy końcem 5’ startera i 3’ sondy znajduje
się element blokujący polimerazę DNA oraz wygaszacz fluorescencji, koniec 3’ sondy
wyznakowany jest fluorochromem. Wolny koniec 3’ startera umożliwia przyłączenie
polimerazy i wydłużenie komplementarnej nici. Po denaturacji struktura „spinki” zostaje
rozerwana, a sonda zgina się o 180 0 i wiąże do nowo zsyntetyzowanej nici.
Wybór aparatury
Reakcja przeprowadzana jest w termocyklerze umożliwiającym detekcję fluorescencji w trakcie
trwania reakcji. Sprzęt stosowany w Real-time PCR powinien umożliwić utrzymanie narzuconych
parametrów podczas całej reakcji, znaczną szybkość zmian temperatury, precyzję pomiaru,
dokładność oraz powtarzalność wyników reakcji. Na rynku dostępnych jest wiele aparatów
umożliwiających monitorowanie w czasie rzeczywistym. Mogą istotnie różnić się budową,
źródłem wzbudzania fluorescencji, sposobem detekcji. Przy wyborze powinniśmy kierować się
ilością kanałów detekcji (szczególnie istotne przy wykonywaniu analiz typu „multiplex”), opcją
dodatkową HRM, dostępnym oprogramowaniem umożliwiającym ustalenie warunków reakcji oraz
analizę wyników, a także w przypadku wykonywania analiz dla celów diagnostycznych
posiadanymi certyfikatami (CE, IVD).
Analiza najczęściej popełnianych błędów podczas wykonywania reakcji Real-time PCR
Częstym błędem jest nieodpowiedni wybór barwnika fluorescencyjnego. Przy jego wyborze
musimy kierować się dostępnymi kanałami detekcji w aparacie. Istotnym błędem jest brak
stosowania każdorazowo kontroli reakcji. W każdej partii powinno zastosować się kontrolę
pozytywną (lub szereg rozcieńczeń określonego standardu w przypadku analizy ilościowej), która
informuje nas o prawidłowości zachodzącej reakcji. Kolejną kontrolą jest kontrola negatywna
reakcji. W praktyce stosuje się dwie kontrole tego typu. Pierwsza z nich zamiast DNA lub cDNA
zawiera wodę. Kontrola tego typu ma na celu sprawdzić czystość odczynników i wykluczyć
ewentualną ich kontaminację obcym materiałem genetycznym. Druga kontrola negatywna
zawiera DNA negatywne pod względem badanej cechy np.: materiał od pacjenta, u którego nie
stwierdzono sekwencji docelowej analizowanego patogenu. Ostatnią kontrolą jest kontrola
wewnętrzna reakcji. Jej rolą jest wykluczenie inhibicji. Szczególnie istotna w przypadku próbek,
dla których uzyskaliśmy brak produktu amplifikacji.
Często popełnianym błędem jest nadmierne zwiększanie ilości cykli. Zwiększanie ich ilości
powyżej 45 istotnie podwyższa ryzyko uzyskania niespecyficznych produktów amplifikacji.
Problem
Prawdopodobna przyczyna błędu
Brak produktów amplifikacji lub
wysoka wartość CT
Niewydajna
amplifikacja
(degradacja
składników
mieszaniny reakcyjnej – głownie startery i sonda, źle
zaprojektowane startery i nieodpowiednie warunki reakcji,
za długie amplikony); słaba jakość matrycy lub
niewystarczająca jej ilość; za mała ilość cykli; zastosowanie
złych barwników – odczyt na złym kanale detekcji
niedokładnie wymieszane składników użytych do reakcji;
analiza poziomu fluorescencji na nieodpowiednim etapie;
barwniki fluorescencyjne nie uwolnione z sondy; inhibicja;
niewydajna odwrotna transkrypcja przy analizie RNA.
Niespecyficzne amplikony
Źle zaprojektowane startery – startery niespecyficzne, z
równą wydajnością amplifikują inne odcinki DNA; zbyt niska
temperatura annealingu; matryca cDNA skontaminowana
przez DNA genomowe.
Amplifikacja dla NTC (kontrola
czystości odczynników)
Zanieczyszczone reagenty lub zanieczyszczenie podczas
przygotowania reakcji.
Fluorescencja bez kontroli
kontaminacji DNA genomowym
Matryca cDNA skontaminowana przez DNA.
Nieliniowy rozkład wartości CT
Zbyt niska temperatura annealingu; niedokładnie
wymieszane składniki użyte do reakcji; słaba jakość
starterów; degradacja standardów wielkości.
Krzywa nie sigmoidalna – tzw.
„krzywa prosta”
Błąd w odczycie.
Krzywe amplifikacji są bardzo
postrzępione
Błąd w odczycie; niski poziom fluorescencji.
Podsumowanie
Obecnie, nie ma chyba na świecie laboratorium, które nie wykonywałoby reakcji Real-time PCR.
Metoda coraz częściej stosowana jest do ilościowego określania ekspresji specyficznych genów,
również w diagnostyce medycznej i mikrobiologicznej.
Szczegółową wiedzę o użyteczności metody w powyższych dziedzinach można zdobyć na
specjalistycznych, tematycznych kursach, poświęconych technice Real-time PCR,
organizowanych przez Centrum Edukacji Bio-Medycznej w Poznaniu. Uczestnik pozna m.in.
różne metody izolacji genomowego DNA, RNA, oraz wykorzystanie reakcji Real-time PCR w
identyfikacji infekcji wirusowych oraz zakażeń bakteryjnych i grzybiczych. Część warsztatowa
pozwoli na wspólną analizę najczęściej popełnianych błędów przy wykonywaniu reakcji, co
pozwoli uniknąć podobnych problemów we własnej praktyce laboratoryjnej. Więcej informacji na
stronie organizatora poświęconej szkoleniu: "Zastosowanie metody Real-Time PCR w
diagnostyce medycznej i mikrobiologicznej"
Opracowali:
mgr inż. Biotechnologii Joanna Odważna, Diagnosta laboratoryjny, ekspert Centrum
Edukacji Bio-Medycznej
red. Ewa Drzazga
red. Tomasz Domagała