Biofizyka z elementami biofizyki błon zadania

Ćwiczenia z biofizyki z elementami biofizyki błon 2015/2016
Przykładowe zadania
1. Przygotowano film lipidowy o składzie PC:PS 95:5 (molowo). Jakie objętości poszczególnych roztworów
odparowano w tym celu, jeżeli MPC=734 g/mol, cPC= 10 mg/ml i MPS= 385.3 g/mol i cPS= 5 mg/ml, a końcowa
ilość lipidu w liposomach miała wynosić 25 mg? (PC 2.433 ml; PS 134 l)
2. Przygotowano film lipidowy o składzie PC:Chol:PS 70:25:5 (molowo). Jakie objętości poszczególnych roztworów
odparowano w tym celu, jeżeli MPC=734 g/mol, cPC= 10 mg/ml, MChol=386.65 g/mol, cChol=10 mg/ml i MPS= 385.3
g/mol i cPS= 5 mg/ml, a końcowa ilość lipidu w liposomach miała wynosić 20 mg? (PC 1.637 ml; Chol 307 l; PS
122 l)
3. Przygotowano liposomy przez pobranie i odparowanie 970 l PC (10 mg/ml), 48 l PS (5 mg/ml) i 37 l LPC (c=1
mg/ml, MLPC= 523.68 g/mol). Oblicz proporcje molowe lipidów w powstałych liposomach. (95:4.5:0.5)
4. Przeprowadzono doświadczenie identyczne jak na ćwiczeniach: pewną porcję zawiesiny liposomów
miareczkowano w kuwecie roztworem detergentu. Oblicz, jakie było stężenie lipidu (mg/ml) w wyjściowej
zawiesinie liposomów, jeżeli 5 mol% detergentu zawarte było w 20 μl roztworu o stężeniu początkowym 6 mg/ml,
a miareczkowano 20 μl liposomów (Mlipidu=734 g/mol, Mdetergentu=670 g/mol). (125 mg/ml)
5. Przygotowano liposomy zbudowane z PC:Chol 75:25 (mol/mol). Suchy film lipidowy z 6 mg lipidów uwodniono 2
ml buforu. Próbę badaną przygotowano przez dodanie 80 l liposomów do 2.5 ml buforu. Wiedząc, że 2.5 mol%
detergentu względem lipidu w próbie zawarte było w 50 l roztworu oblicz jego procentowe stężenie (MPC=734
g.mol, MChol=386.65 g/mol, Mdetergentu= 288.38 g/mol). (5.4%)
6. Przygotowano liposomy PC:Chol 95:5 (molowo) z 20 mg lipidów i 1 ml buforu. Do 2 ml buforu w kuwecie
przeniesiono 200 l liposomów i dodano 30 l etanolowego roztworu DPH (M=336.32 g/mol, c=1 mg/ml). Jakie
było błonowe stężenie DPH w liposomach, jeżeli wszystkie jego cząsteczki wbudowały się do dwuwarstwy
liposomowej? (ok. 1.6 mol%)
7. Przygotowano liposomy PC:Chol 95:5 (molowo) z 30 mg tych dwu lipidów i 1 ml buforu. Przed odparowaniem
roztworów lipidów do postaci filmu lipidowego dodano jeszcze etanolowy roztwór NBD-PE (M=984.3 g/mol, c= 5
mg/ml) do końcowego stężenia w dwuwarstwie 1 mol%. Jakiej objętości roztworu NBD-PE użyto? Następnie do 2
ml buforu w kuwecie przeniesiono 50 l liposomów zawierających NBD-PE i dodano 10 l etanolowego roztworu
DPH (M=336.32 g/mol, c=1 mg/ml). Jakie było błonowe stężenie DPH w liposomach, jeżeli wszystkie jego
cząsteczki wbudowały się do dwuwarstwy liposomowej? (84 l; ok. 1.5 mol%)
8. W układzie eksperymentalnym badano proces przenoszenia energii pomiędzy NBD i rodaminą. W metodzie tej
wykorzystywano liposomy z wbudowanymi sondami fluorescencyjnymi, które stanowią donor i akceptor podczas
fluorescencyjnego procesu przekazywania energii. Fluorescencyjne rezonansowe przenoszenie energii jest jedną z
metod detekcji fuzji liposomów, intensywność fluorescencji rośnie podczas fuzji dwóch populacji różnie
oznakowanych liposomów (w/w znacznikami). Proces ten zależny jest od odległości pomiędzy cząsteczkami
znaczników, a więc od budowy błony, od płynności dwuwarstwy fosfolipidowej, współczynnika dyfuzji lateralnej i
in.
W kuwecie spektrofluorymetrycznej umieszczono 2 ml buforu glicynowego pH 7.0 z 0.9% NaCl. Dodano
następnie 0.75 mg lipidu w formie liposomów zbudowanych z DMPC z wbudowaną sondą NBD-PE (donorem),
która stanowiła 1 mol% względem lipidu. Następnie wstrzyknięto 0.5 ml liposomów zawierających 0.75 mg DPPC
i 0.1 ng A-23187 (białko, jonofor wapniowy). Liposomy te zawierały także N-Rh-PE (akceptor), która stanowiła 1
mol% względem lipidu. Roztwór sondy uzyskano, rozpuszczając 4.25 mg N-Rh-PE w 3.78 ml metanolu. Jaką
objętość metanolowego roztworu N-Rh-PE pobrano do sporządzenia liposomów? (ok. 12 l)
NBD-PE: M=956 g/mol, Ex=463 nm, Em=536 nmn, c=3 mg/ml
N-Rh-PE: M=1334 g/mol, Ex=560 nm, Em=581 nm
DPPC: M=752 g/mol,1, c=10 mg/ml
DMPC: M=678 g/mol, c=11,5 mg/ml
CaCl2: M=110,98 g/mol
A-23187: M=523 g/mol, c=1 ng/ml
9. Jedna z metod badania solubilizacji dwuwarstwy fosfolipidowej wykorzystuje wyciek zamkniętego w liposomach
jednowarstwowych (SUV) związku, którego fluorescencja ulega wygaszeniu stężeniowemu. Podczas częściowej,
stopniowej solubilizacji błony liposomowej dochodzi do wydostawania się takiego związku z wnętrza liposomów,
jego rozcieńczania i powrotu fluorescencji.
Badano wpływ wzrastającego stężenia kardolu na właściwości barierowe błony liposomów (M. Stasiuk, A.
Kozubek, Membrane perturbing properties of natural phenolic and resorcinolic lipids, FEBS Letters 582 (2008)
3607–3613). Do stałej ilości liposomów w kuwecie pomiarowej dodawano porcjami roztwór kardolu, po każdej
porcji sprawdzając intensywność fluorescencji próbki. Na otrzymanym w ten sposób wykresie graficznie
wyznaczono wartość IC50, która wynosiła 18.6 M. Oblicz, ile to stanowiło mol% kardolu względem lipidu w
liosomach, wiedząc, że objętość próby wynosiła 2.5 ml, znajdowało się w niej 20 l liposomów z EPC pobranych
z wyjściowej zawiesiny 25 mg lipidu/1 ml. Masa molowa EPC wynosi 734 g/mol, natomiast kardol jest mieszaniną
czterech homologów o różnej ilości wiązań podwójnych w cząsteczce, których zawartość i masy molowe
przedstawiają się następująco: 56% homologu o M=324 g/mol, 24% homologu o M= 322 g/mol, 13% homologu o
M= 320 g/mol oraz 7% homologu o M= 318 g/mol. (ok. 7 mol%)
10. Opracowana przez Hoekstra et al. (Hoekstra D., de Boer T., Klappe K., Wilschut J. Fluorescence method for
measuring the kinetics of fusion between biological membranes, Biochemistry 23 (1984) 5675-81) metoda badania
fuzji bazuje na zjawisku samowygaszania oktadecylo-rodaminy B. Sonda ulega samowygaszeniu, jeżeli występuje
w formie wbudowanej w dwuwarstwę fosfolipidową w stężeniu 1-10 mol%. Jeżeli do badanej próby dodamy inne
struktury błonowe (liposomy, erytrocyty, cienie erytrocytarne), dojdzie do fuzji, co spowoduje, że stężenie sondy
ulegnie rozcieńczeniu. Obserwujemy wówczas wzrost fluorescencji sondy (Ex 560 nm, Em 590 nm).
W układzie eksperymentalnym w 3 ml buforu znajdują się liposomy utworzone z 2.5 mg lipidu (DPPC)
zawierające 7.5 mol% oktadecylo-rodaminy B i liposomy utworzone z 5.25 mg lipidów (DMPC:DMPG 7:3, w
stosunku wagowym). Po 30 minutach inkubacji w temp. pokojowej w próbie doszło do fuzji liposomów. Jakie jest
końcowe stężenie błonowe sondy (w mol%) w nowopowstałych liposomach, przy założeniu, że wydajność fuzji
wynosiła 100%? (ok. 2.4 mol%)
MDPPC=734 g/mol, cDPPC=10 mg/ml
MDMPC=678 g/mol, cDMPC=15 mg/ml
MDMPG=667 g/mol, cDMPG=10 mg/ml
Msondy=731.5 g/mol, csondy=0.125 mM.
11. Rysunek obok przedstawia wyniki uzyskane w doświadczeniu identycznym jak przeprowadzane podczas ćwiczeń.
Z wykresu odczytaj graficznie najniższą wartość stężenia
detergentu, w którym następuje całkowita liza liposomów i
podaj dla tej wartości stosunek molowy detergent/lipid,
wiedząc, że:
Vpróby = 2.4 ml
clipidu = 0.5 mg/ml próby
Mlipidu = 734 g/mol
Mdetergentu = 650 g/mol (wynik: 25-30).
12. Badano solubilizację liposomów LUV przez detergent. W naczyniu podzielonym przegrodą na dwa kompartmenty
do jednej komory dodano zawiesinę liposomów, do drugiej identyczną objętość roztworu detergentu o stężeniu
25,6 M. Zarówno liposomy, jak i detergent znajdowały się w tym samym buforze, obojętnym dla prowadzonej
reakcji. Następnie przegrodę podniesiono, pozwalając na wymieszanie zawartości kompartmentów. Podaj stężenie
formy monomerycznej i micelarnej detergentu po podniesieniu przegrody, ale przed jego wbudowywaniem się do
błony liposomów, jeżeli jego CMC wynosiło 6,4 x10-6 M (2 pkt). (obydwie formy po 6.4 M)