Kinetyka reakcji fosfatazowej. Estry oraz bezwodniki kwasu

Marian Kuczek
Department of Experimental and Molecular Biology,
University of Opole, Kominka 4, 45-035 Opole, Poland
Kinetyka reakcji fosfatazowej.
Estry oraz bezwodniki kwasu fosforowego wchodzą w reakcje przeniesienia
acylu w obecności katalizatorów kwasowych.
Powszechnie panuje przekonanie, że w reakcji hydrolizy estrów
fosforanowych bierze udział atom wodoru kwasu fosforowego, czyli reakcja
hydrolizy jest reakcja autokatalityczną.
O
O
R
O
R
P
O
O
R'
+
O
P
O
H
O
R'
H
W wyniku takiej wewnątrzcząsteczkowej reakcji może pośrednio
powstawać ester kwasu metafosforowego lub kwas metafosforowy (gdy R' = H).
Pośrednio powstający metafosforan, w obecności katalizatora kwasowego, może
reagować z grupą zasadową (donorem pary elektronów) dając kwas ortofosforowy
lub jego ester.
O
H
P
O
O
O
''R
R'
O
P+
+
H+
''R
O
O
O
R'
H
H
H
O
O
''R
''R
O
O
P
P+
O
H
H+
+
O
R'
O
O
R'
H
Powyżej przedstawiony mechanizm reakcji wyjaśnia często spotykane,
katalizowane kwasami, reakcje transfosforylacji (przenoszenia reszt kwasu
fosforowego) oraz oporność estrów kwasu fosforowego i pirofosforowego na
hydrolizę zasadową. Równomiernie rozłożony wokół atomu fosforu ortofosforanu
ujemny ładunek atomów tlenu znacznie utrudnia zbliżenie się jonu OH- do atomu
fosforu. Ujemny jon OH może połączyć się bez przeszkód z fosforem w płaskiej
cząsteczce metafosforanu1.
Reakcję hydrolizy fosforanów katalizują kwasy w tym także sole
niektórych metali, szczególnie cynku i magnezu. Wszystkie reakcje enzymatyczne
przebiegają zgodnie z ogólnym mechanizmem katalizy kwasowo-zasadowej
i hydrolazy wymagają do reakcji obecności soli metali, zazwyczaj tych samych,
które katalizują reakcje także bez enzymów lecz znacznie wolniej niż z enzymem.
Przypuszczalnie kationy metali takich jak cynk, magnez i często potas,
w reakcjach enzymatycznych działają jak kwasy Lewisa.
Enzymy katalizujące hydrolizę estrów kwasu fosforowego nazywa się
fosfatazami i dzieli się w zależności od optimum pH na dwie grupy: fosfatazy
kwaśne optimum pH 5-6 i fosfatazy zasadowe optimum 8,5-9,5. Fosfatazy kwaśne
spotykane są jako enzymy wydzielane w płynach ustrojowych oraz enzymy
wydzielane przez mikroorganizmy. Fosfatazy zasadowe także spotykane są jako
wydzielane przez mikroorganizmy oraz występują w lizosomach. Pojawiają się
w lizatach komórkowych. W naszym doświadczeniu używać będziemy fosfatazy
zasadowej, którą udaje się wypłukać z komórek drożdży z uszkodzonymi błonami
komórkowymi. Błony i ściany komórkowe drożdży uszkadzamy zamrażając
i gwałtownie rozmrażając drożdże.
Odczynniki:
a) bufor: 0,1 M bufor TRIS-HCl pH 9,0 (0,262 g TRIS-HCl, 1,01g TRIS w 100
cm3 wody). W przypadku braku TRIS bufor (glicyna -KOH) 0.1 M. pH 9,0.
b) 1 M chlorek magnezowy
c) 0,01 M roztwór substratu 37.1 mg soli dwusodowej 4-nitrofenylofosforanu
rozpuszczamy w 10 cm3 wody.
1. Ekstrakcja enzymu:
W przeddzień doświadczenia drożdże wkładamy do zamrażarki o 195 K
(najlepiej 100 K). Bezpośrednio przed doświadczeniem drożdże wyjmujemy
z zamrażarki, wrzucamy do dwukrotnej objętości 0,1 M buforu TRIS-HCl pH 9,0.
Okazyjnie mieszamy przez godzinę i następnie odwirowujemy. Supernatant (płyn
nad osadem) zawiera wystarczającą do doświadczenia aktywność fosfatazy
zasadowej.
2. Oznaczenie szybkości reakcji początkowej:
Do termostatowanej (298 K) kuwety spektrofotometrycznej dodajemy
kolejno odczynniki wg tabeli i po każdym mieszamy. Na końcu dodajemy roztwór
substratu, mieszamy i natychmiast mierzymy absorbancję przy 405 nm wg wody
jako próby ślepej. Pomiar absorbancji kontynuujemy przez 5 min. Zapisujemy
ekstynkcję w czasie 0 (początkową) i po 5 min. Pomiary zapisujemy dla każdej
próby.
1 Jest zaproponowany inny mechanizm hydrolizy, który zakłada że nie musi powstawać pośrednio metafosforan
a jedynie struktura przejściowa o rozciągniętych wiązaniach P-O. Ze względu jednak na zawiłą interpretację
i brak jednoznacznych dowodów mechanizmu tego nie przedstawiamy.
Nr
1.
2
3
4
5
6
bufor
[cm3]
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
MgCl2
[cm3]
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
ekstrakt
[cm3]
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
woda
[cm3]
0
0.3
0.4
0.45
0.48
0.5
substrat
[cm3]
0.5
0.2
0.1
0.05
0.02
0
stężenie [mM]
1.82
0.73
0.364
0.182
0.073
0.000
3. Obliczenia:
Celem obliczenia stałej Michaelisa (stałej równowagi reakcji dysocjacji kompleksu
enzymu z substratem) przekształcamy równanie Michaelis - Menten:
V = Vm [S]/(Km + [S])
1/V = 1/Vm + 1/[S] (Km/Vm)
równanie Michaelis-Menten
równanie Linewuawera-Burka
Objętość końcowa ( vk ):
vk = 2 cm 3 buforu + 0,05 cm 3 1 M MgCl2 + 0,2 cm 3 ekstraktu z drożdży + 0,5 cm 3
r-r substratu = 2,75 cm 3
Stężenie substratu ( [s] ):
[S] = cs vs/vk
Szybkość reakcji :
V = (A405(10)- A405(0))/(5min 18200 M-1).
Obliczamy odwrotność stężenia substratu 1/[S] i odwrotność szybkości reakcji
1/V.
Rysujemy wykres zależności 1/V od 1/[S].
Nr
[S] [mM]
1
2
3
4
5
6
1.82
0.73
0.364
0.182
0.073
0.000
1/[S] 103
A405 (0min) A405
(10min)
V
1/V
Tg kąta nachylenia prostej jest równy Km/Vm, przesunięcie prostej jest równe
1/Vm.
Silnymi inhibitorami konkurencyjnymi (kompetycyjnymi) fosfatazy są sole
kwasu ortofosforowego. Jeżeli do buforu, w którym prowadzimy reakcję dodamy
fosforan potasowy w stężeniu 10-3 M, wówczas wykres zmieni nachylenie (linia
czerwona). Szybkość początkowa reakcji jest opisywana wzorem:
v = Vm [S]/(Km ([I]/Ki + [S]))
Gdzie: [I] stężenie fosforanu, Ki stała inhibitorowa. Fizyczny sens stałej
inhibitorowej jet taki sam jak stałej Michaelisa, jest to stała równowagi reakcji
dysocjacji kompleksu EI (enzym-inhibitor). Znając stałą Michaelisa i stałą
Michaelisa w obecności inhibitora można łatwo obliczyć stała inhibitorową.
Praktycznie nigdy nie spotyka się idealnych typów inhibitorów. Fosforan
wykazuje cechy inhibitora kompetycyjnego tylko w wąskim zakresie stężenia
substratu i fosforanu, w szerszym zakresie zawsze wykazuje cechy mieszane,
inhibitora kompetycyjnego i akompetycyjnego lub niekompetycyjnego.
Wytłumaczenie tego zjawiska jest znane.
Kato, T., Shimotohno, K. Estimation of kinetic parameters for substrate and inhibitor in a
reaction with an enzyme sample containing different types of inhibitor. Biochim. Biophys. Acta
801 (1984) 157-162.
London, W.P. and Steck, T.L. Kinetics of enzyme reactions with interaction between a
substrate and a (metal) modifier. Biochemistry 8 (1969) 1767-1779.
M. Kuczek, Cell. Mol. Biol. Lett., 2003, 8, 85-95.