Prof. dr hab. Andrzej Skoczowski Kraków, dnia 21 listopada 2015 r

Prof. dr hab. Andrzej Skoczowski
Uniwersytet Pedagogiczny im. KEN w Krakowie
Instytut Biologii, Zakład Fizjologii Roślin
Ul. Podchorążych 2, 30-084 Kraków
Kraków, dnia 21 listopada 2015 r.
Ocena
rozprawy doktorskiej mgr Agnieszki Dudzik
pt. ”Biokatalityczne otrzymywanie chiralnych alkoholi z wykorzystaniem
dehydrogenazy (S)-1-fenyloetanolowej w enancjoselektywnej redukcji ketonów”
Rozprawa doktorska mgr Agnieszki Dudzik, napisana pod kierunkiem dr hab. Macieja
Szaleoca jest obszernym opracowaniem naukowym i dotyczy niezwykle ważnych problemów
związanych mi. z projektowaniem i produkcją leków. Ich działanie terapeutyczne zależy
bowiem ściśle od formy chemicznej w jakiej występuje substancja czynna (np. enancjomer
czy racemat). Poznane już skutki lekkomyślnego stosowania racematów jako
medykamentów doprowadziły do zaostrzenia przepisów, które zabraniają wprowadzania do
obrotu racematu jeśli nie ma dowodu na brak toksyczności nieterapeutycznego
enancjomeru. Zagadnie na te Doktorantka omawia szczegółowo we wstępie.
Niewątpliwym atutem pracy jest połączenie badao stosowanych z podstawowymi – raczej
rzadko spotykane, a szkoda, bo jak pokazuje przedstawiona do oceny dysertacja takie
połączenie może byd bardzo cenne. Ponadto praca oparta jest o multidyscyplinarne techniki
badawcze - od biologii, poprzez chemię i biochemię, a na zaawansowanych metodach
matematycznych koocząc (mam tu na myśli zarówno modelowanie procesów jak i analizy
statystyczne). Pokazuje to już na początku ogromny potencjał naukowy Doktorantki.
Praca napisana jest, z nielicznymi wyjątkami, bardzo dobrym językiem. Jest też wzorcowo
opracowana pod względem edytorskim (poza jednym schematem zamieszczonym na str. 24,
który mówiąc kolokwialnie trochę się „rozjechał”).
W krótkim wstępie Autorka nawiązuje do historii odkrycia zjawiska chiralności przywołując
badania E-L Malusa, J-B Biota i L. Pasteura. Nawiązanie to uważam za bardzo cenne
z dydaktycznego punktu widzenia. Z moich obserwacji wynika bowiem, że większośd
młodych ludzi uważa, iż wszystko co istotne w nauce odkryto dopiero w XX wieku. Pokazanie
swoich eksperymentów na tle obserwacji poczynionych przez innych 200 lat wcześniej
wskazuje na ciągłośd badao naukowych, których dogłębnośd jedynie zmienia się na skutek
coraz to lepszych narzędzi badawczych.
1
Rozdział „Cele i zakres pracy” podzielony został na kilka części, w których omówiono tzw.
cele szczegółowe. W tej części Doktorantka nie ustrzegła się kilku niezręczności przy
formułowaniu myśli. I tak napisała, cytuję, „Mając na uwadze steroeselektywne zdolności
enzymu” (wolałbym - właściwości); „Dlatego wyznaczono najlepsze warunki pH
i temperatury” (wolałbym - optymalne) i wreszcie sformułowania „badania nad parametrami
reaktorowymi” czy też „… szybkośd syntezy w warunkach reaktorowych” (czemu nie
w reaktorze czy też bioreaktorze?). W tym miejscu muszę przyznad, że przez długi czas, bo aż
do strony 143, nie bardzo wiedziałem jakie warunki badawcze przeciwstawia Autorka
„testom reaktorowym”. Rozpoczynając lekturę rozdziału 5.4.1.2 pojąłem wreszcie, że
Doktorantce chodzi o porównanie badao przeprowadzonych w kuwecie
spektrofotometrycznej z tymi wykonanymi w bioreaktorze. Innymi słowy o porównanie skali
mikro i makro. Albo ja tego wcześniej nie doczytałem, albo Doktorantka uznała, że jest to tak
oczywiste, że nie trzeba wyjaśniad. Nie mam żalu. W koocu się dowiedziałem.
W części „Wprowadzenie do tematu” zręczniej, moim zdaniem, byłoby połączyd w całośd
podrozdziały 3.2 i 3.5. Czyli najpierw należało wyjaśnid czym są enzymy (3.2) i jak się je dzieli
(3.5), a potem zamieścid informacje o alkoholach chiralnych i metodach ich syntezy
w oparciu o katalizę enzymatyczną. Ta uwaga nie ma jednak żadnego merytorycznego
znaczenia.
Na stronie 53 Doktorantka pisze o „dzikim typie” i mutantach PEDH. Co prawda określenie
„dziki typ” ujmuje w cudzysłów, ale zdaniem recenzenta i tak dokonuje dużego skrótu
myślowego. Trudno bowiem mówid o mutacjach związków chemicznych (w tym przypadku
enzymów). Są to produkty zmutowanych organizmów żywych, w których dokonano mutacji
geny kontrolującego ich syntezę. A zatem można mówid o PEDH z dzikiego typu E. coli (bez
cudzysłowu) lub o formach pozyskanych z mutantów E. coli. Jak to się robi w praktyce
opisuje przecież Doktorantka wyczerpująco 3 strony wcześniej.
Rozdział „Metodyka badao” jest bardzo „zgrabnie napisany”. Recenzent ma jedynie
wątpliwości czy Autorka musiała aż tak dokładnie wnikad w istotę stosowanych metod. I tak,
o ile wyjaśnienie zasady elektroforezy białek na żelach SDS-PAGE mogę uznad za uzasadnione
(chemicy nie do kooca muszą znad metody rutynowo stosowane w biochemii) o tyle
wyjaśnianie na czym polega zasada pomiaru spektrofotometrycznego (str. 61) trochę mnie
szokuje. Na etapie pisania pracy doktorskiej należy założyć, że jej potencjalny czytelnik
posiadł już elementarną wiedzę z tej dziedziny. Za zbędne uważam też omawianie podstaw
chemicznych oznaczania białka metodą Bradford (str. 60).
Przy okazji chciałbym zwrócid Doktorantce uwagę, że podawanie w nawiasach (w wielu
miejscach pracy) angielskich odpowiedników polskich nazw związków chemicznych czy też
metod badawczych uważam za niepotrzebne. I tak np. na str. 59 Doktorantka pisze, że: „żel
był wybarwiany błękitem kumazyny (ang. Coomassie Brilant Blue G-250)”. Cel takich
objaśnieo jest dla mnie zupełnie niejasny, nic nie wnosi, a wydłuża jedynie zdanie oddalając
2
czytelnika od meritum. Jeśli Autorka koniecznie chciała umieścid takie objaśnienia to należało
zrobid to w części „Wykaz stosowanych skrótów” na str. 11-12.
Nie mam zastrzeżeo co do rozbudowanego opisu metody miareczkowania
kalorymetrycznego i to nie dlatego, że metoda ta jest mi szczególnie bliska. Opisując
wspomnianą metodę Doktorantka zwraca bowiem uwagę na liczne niebezpieczeostwa jakie
wiążą się z interpretacją, uzyskanych podczas pomiarów kalorymetrycznych, wyników badao.
Wskazując na inne, niż wynikające z samego przebiegu badanej reakcji chemicznej, efekty
cieplne Doktorantka pokazuje, że dobrze rozumie metodę.
Rozdział „Wyniki” zawiera liczne i co gorsza, obszerne, powtórzenia informacji zawartych
w części metodycznej. Ponowne umieszczanie tych informacji było moim zdaniem
niepotrzebne, ale ponieważ rozdział ten, podobnie jak i pozostałe części pracy, czyta się
dobrze więc nie będę dalej narzekał.
Już na początku omawianej części pracy (Wyniki - str. 106) Doktorantka używa po raz
pierwszy terminu „szarża” pisząc cytuję: „Bakterie były przechowywane w postaci
zamrożonej, a do kolejnych szarż procesu były ożywiane …”. Ponieważ nie znam innego,
oprócz batalistycznego, znaczenia słowa szarża dlatego też proszę Doktorantkę o wyjaśnienie
skąd zaczerpnęła ten termin. Pewnie nie pytał bym o to gdyby termin ten nie pojawił się
w jej pracy ponownie.
Na str. 106 i później na str. 172 Doktorantka używa określenia „gen kodujący PEDH”. To jest
błędny zapis, bowiem po polsku powinno się prawidłowo powiedzied: gen kontrolujący
syntezę PEDH.
Na str. 111 (podrozdział 5.2.1) Autorka pisze: „Optymalizacja aktywności enzymu
w zależności od temperatury polegała na …”. To określenie niezręczne bo Autorka po prostu
poszukiwała optimum temperaturowego badanej reakcji enzymatycznej, a nie
dopasowywała aktywnośd enzymu do temperatury. Tytuł pod rysunkiem 63 brzmi „Zależnośd
aktywności początkowej PEDH w funkcji temperatury”. Co Autorka przyjmuje za aktywnośd
początkową? Jak do badania optimum termicznego enzymu ma się informacja (koocząca ten
podrozdział), że ze względów praktycznych w trakcie badao posługiwano się testem,
w którym temperatura była utrzymywana na poziomie 30oC. Wyniki pomiarów
przedstawione na rysunku 63 rozpoczynają się od 20 oC. Proszę o wyjaśnienie tej, jak
przypuszczam, niezręczności przekazu.
W podrozdziale 5.2.2 Autorka napisała: „Otrzymane wyniki wskazują na istotną zależnośd
aktywności enzymu od pH środowiska. Zmiana ta nie jest liniowa”. Nie bardzo rozumiem
dlaczego Doktorantka oczekiwała liniowej zależności pomiędzy pH środowiska,
a aktywnością enzymu. Zależnośd ta, jak powszechnie wiadomo, ma kształt krzywej
dzwonowej. Maksymalna aktywnośd enzymu mieści się zazwyczaj w bardzo wąskich
granicach pH i czasami nawet niewielka zmiana pH prowadzi do gwałtownego spadku
aktywności, a nawet do denaturacji enzymu. Autorka obserwuje to przecież sama na
3
załączonym rysunku nr 64, chod pokazuje jedynie prawy fragment krzywej dzwonowej.
Jestem przekonany, że Doktorantka zna opisane zależności. Zwracam zatem uwagę na te
niezręczne sformułowania z obowiązku jaki nakłada się na recenzenta.
W rozdziale 5.2.3 Doktorantka opisuje wpływ organicznych solwentów, koniecznych do
uzyskania roztworów wodnych badanych substratów na aktywnośd PEDH. Wskazuje to na
bardzo dojrzałe podejście do problemu, z którym borykają się na co dzieo biochemicy
badający wpływ na organizmy żywe aktywnie biologicznych substancji, z których znaczna
częśd jest nierozpuszczalna w wodzie. Dotyczy to każdego poziomu badao poczynając od
najbardziej złożonych organizmów roślin naczyniowych, poprzez glony i bakterie, a na
reakcjach enzymatycznych koocząc.
W podrozdziale 5.4.1 zatytułowanym „Układ homogeniczny vs heterogeniczny” Doktorantka
używa określenia , cytuję: „że w stosowanych warunkach enzym nie „wycieka” z komórek do
środowiska reakcji …”. Co prawda określenie „wycieka” jest ujęte w cudzysłów (na str. 149
nie ma już jednak cudzysłowu), ale nie zmiana to faktu, że określenie to jest kolokwialnie
mówiąc nieeleganckie. Lepiej chyba powiedzied, że enzym nie jest uwalniany do środowiska
reakcji. Jestem pewien, że Doktorantka się z tym zgodzi.
Z badao Doktorantki wynika, że z pośród testowanych buforów, najbardziej optymalny dla
aktywności PEDH jest bufor MES (oczywiście o ustalonym wcześniej pH). Czy Doktorantka ma
jakieś podejrzenia z czego może wynikad taka zależnośd?
Podpis do rysunku 80 jest niezręczny. Na rysunku (mam nadzieję) jedynie widoczne są, a nie
jak napisała Autorka, „znajdują się” bakterie E. coli.
Rysunek 87B, jeśli będzie gdzieś publikowany, musi mied poprawioną skalę X i Y. Program
graficzny zrobił bowiem Doktorantce psikusa wstawiając wartości ujemne na obu skalach
(czego nie zauważyła). Do publikacji trzeba to poprawid bo jednostki: czas „-200 min”
i stężenie „-20 mM” nie mają sensu.
Omawiając wyniki uzyskane metodą kalorymetrii izotermicznej (konkretnie wyznaczanie
ciepła reakcji) Doktorantka napisała, że „Dla wszystkich badanych związków otrzymano
negatywne wartości entalpii…”. Ja rozumiem, że Doktorantce chodzi o wartości ujemne (co
zresztą widad w tabeli 24). Określenie „negatywne” istotnie kojarzy się ze znakiem minus.
Uważam jednak, że lepiej pisad wartości ujemne, a nie „negatywne” bo to można kojarzyd
z brakiem wartości pozytywnych (których Doktorantka np. oczekiwała). W dyskusji, na str.
184 jest już jak chciałem - ujemne wartości entalpii.
Z obowiązku recenzenta muszę też, z uznaniem, odnieśd się do zamieszczonej w pracy
bibliografii, a nie jak napisała Doktorantka „Literatury”. Termin literatura znaczy coś zupełnie
innego. Niemniej, na 163 zamieszczone w pracy pozycje większośd, to prace absolutnie
najnowsze (wiele pozycji nawet z ubiegłego, 2014 roku).
4
Wniosek koocowy
Niezależnie od zawartych w recenzji uwag krytycznych, nie mających znaczenia dla wartości
merytorycznej pracy, stwierdzam, że treśd i forma przedstawionej rozprawy pt.
„Biokatalityczne otrzymywanie chiralnych alkoholi z wykorzystaniem dehydrogenazy (S)-1fenyloetanolowej w enancjoselektywnej redukcji ketonów”, spełnia wszystkie warunki
stawiane rozprawom doktorskim zgodnie z ustawą z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach
naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki.
Jednocześnie stwierdzam, że miałem przyjemnośd recenzowania pracy, którą uznaję za
ponad przeciętną. Jest ona bardzo dobrym, interdyscyplinarnym, opracowaniem naukowym.
Autorka nie tylko musiała zmierzyd się z nową dla siebie, jak sądzę, problematyką
biologiczną. Przed Doktorantką już na początku stanęły poważne wyzwania związane z wcale
niełatwymi do prowadzenia kulturami bakteryjnymi. Doktorantka musiała bowiem najpierw
„wyprodukowad” przedmiot swoich badao. W tym zakresie całkowicie się sprawdziła. Ilośd
i różnorodnośd zastosowanych technik analitycznych jest imponująca (metody elektroforezy
żelowej,
chiralna
chromatografia
cieczowa,
inne
techniki
chromatograficzne,
miareczkowanie kalorymetryczne i wreszcie zaawansowane metody matematyczne
i statystyczne takie jak modelowanie kompleksów enzym-substrat metodą dokowania
substratu do centrum aktywnego, modelowanie z udziałem sieci neuronowych). W efekcie
uzyskane w pracy wyniki mają istotną wartośd naukową i poznawczą.
Reasumując uważam, że mgr Agnieszka Dudzik jest już naukowcem „kompletnym”,
a przeprowadzone przez nią badania zasługują na duże uznanie. W związku z tym wnioskuję
do Rady Naukowej Instytuty Katalizy i Fizykochemii Powierzchni Polskiej Akademii Nauk
im. Jerzego Habera o dopuszczenie mgr Agnieszki Dudzik do dalszych etapów przewodu
doktorskiego i równocześnie stawiam wniosek o wyróżnienie jej pracy stosowną nagrodą
przyjętą w Paostwa Instytucie.
Prof. dr hab. Andrzej Skoczowski
5