Ekspresja wybranych białek jąderkowych w limfocytach przewlekłej

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2012 • Volume 48 • Number 1 • 63-70
Praca poglądowa • Review Article
Ekspresja wybranych białek jąderkowych w limfocytach
przewlekłej białaczki limfocytowej
Expression of selected nuclear proteins in the lymphocytes of
Chronic Lymphocytic Leukemia
Iwona Urbanowicz
Zakład Hematologii Laboratoryjnej, Katedra Analityki Medycznej, Akademia Medyczna we Wrocławiu
Streszczenie
Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) to najczęściej rozpoznawany typ białaczki u dorosłych. Charakteryzuje się bardzo
zróżnicowanym przebiegiem klinicznym. U części pacjentów występuje w postaci indolentnej asymptomatycznej, nie wymagającej leczenia, która może ulec progresji lub nie. W drugiej grupie chorych występuje tak agresywny przebieg CLL, iż konieczne jest leczenie natychmiastowe. Badania ostatnich lat koncentrują się na opracowaniu nowych czynników prognostycznych
i predykcyjnych w oparciu o poznanie molekularnego podłoża tego schorzenia wraz z analizą jego obrazu klinicznego. W pracy podjęto próbę przedstawienia roli wybranych białek jąderkowych, zaangażowanych w biosyntezę rybosomów: nukleoliny,
nukleofosminy oraz fibrylaryny w rozwoju przewlekłej białaczki limfocytowej.
Summary
Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is the most common type of leukemia among adult. CLL is an heterogeneous disease
with a variable clinical course. Same patients start with an asymptomatic indolent disease that may or may not progress over
their lifetime. Others present with an aggressive disease, requiring therapy soon after diagnosis. Consequently, considerable
effort has focused on understanding of molecular and clinical characteristics that are likely to predict the course of CLL. This
paper attempts to present the role of selected nuclear proteins: nucleolin, nucleophosmin and fibrillarin, which play essential
role in ribosome biogenesis in Chronic Lymphocytic Leukemia.
Słowa kluczowe:przewlekła białaczka limfocytowa, białka jąderkowe
Key words:Chronic Lymphocytic Leukemia, nuclear proteins
Przewlekła białaczka limfocytowa (Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL) należy do nowotworów limfoproliferacyjnych,
CLL. Dotychczas nie stwierdzono ścisłego wpływu kancerogennych czynników środowiskowych takich jak np. promie-
których istotą jest klonalna ekspansja zmienionych nowotworowo dojrzałych limfocytów oraz ich akumulacja we krwi
obwodowej, węzłach chłonnych, śledzionie, wątrobie wraz
z naciekaniem szpiku kostnego. W 90% przypadków wywodzi się z limfocytów B, przypadki pochodzące z linii limfocytów T i NK (Natural Killers) są rzadkie [1].
Przewlekła białaczka limfocytowa jest najczęstszą białaczką wśród osób dorosłych w Europie i Stanach Zjednoczonych. Na podstawie danych statystycznych opracowanych
dla Stanów Zjednoczonych na lata 2007- 2010 szacuje się,
że w ciągu roku przybywa ok.15 000 nowych zachorowań
na CLL, w tym samym czasie odnotowuje się ponad 4 000
zgonów z powodu tej choroby [2].
Etiopatogeneza przewlekłej białaczki limfocytowej stanowi
nadal przedmiot badań, brak jest wciąż jednoznacznych
ustaleń odnośnie czynników odpowiedzialnych za rozwój
niowanie jonizujące czy kancerogeny chemiczne na wzrost
ryzyka zachorowania na CLL. Prawdopodobnym czynnikiem
etiologicznym są predyspozycje genetyczne, gdyż odnotowano przypadki rodzinnego występowania tego schorzenia.
U jego podłoża jak w przypadku wielu nowotworów, leżą
mutacje genetyczne, wykrywane u ponad 80% pacjentów
dotkniętych CLL. Istnieje obecnie tendencja do wyróżnienia
mutacji chromosomalnych pierwotnych, kluczowych w zaistnieniu choroby oraz mutacji wtórnych, przyczyniających się
do progresji choroby i akumulowanych w czasie jej rozwoju.
Do mutacji wtórnych zwykło zaliczać się aberracje wpływające na szlaki apoptozy. Do tej pory nie udało się ustalić mutacji patognomicznych dla tej konkretnej jednostki chorobowej
[1, 3].
Przewlekła białaczka limfocytowa charakteryzuje się bardzo zróżnicowanym przebiegiem klinicznym, rokowaniem
63
Ekspresja wybranych białek jąderkowych w limfocytach przewlekłej białaczki limfocytowej
i wrażliwością na leczenie. Rozpoznanie opiera się na stwierdzeniu utrzymującej się powyżej trzech miesięcy klonalnej
limfocytozy krwi obwodowej powyżej 5x109/l, której nie da
się wyjaśnić innymi stanami chorobowymi [3, 4, 5]. Klonalność limfocytozy należy potwierdzić za pomocą cytometrii
przepływowej poprzez wykazanie obecności na powierzchni komórek białaczkowych antygenów CD19, CD20, CD5,
CD23 i łańcuchów lekkich λ lub κ [3, 4].
Przypadki przewlekłej białaczki limfocytowej są niezwykle
heterogenne pod względem szybkości progresji, a moment,
w którym konieczne jest wdrożenie leczenia jest indywidualny dla każdego pacjenta. U ⅓ ogółu pacjentów choroba
zostaje zdiagnozowana we wczesnym stadium, postępuje
na tyle wolno, że nie podejmuje się terapii, a zgon następuje
z przyczyn naturalnych dla zdrowej populacji – jest to tzw.
smouldering CLL. U kolejnej ⅓ części chorych zdiagnozowana CLL we wczesnych stadiach jest pozostawiana do obserwacji, a leczenie wdraża się w momencie progresji choroby. Następna ⅓ populacji pacjentów jest diagnozowana
w późnych stadiach lub występuje tak agresywny przebieg
choroby, iż konieczne jest leczenie natychmiastowe. Wskazaniami do podjęcia leczenia przewlekłej białaczki limfocytowej wg NCI (National Cancer Institute) są: zaawansowany
stan kliniczny, obecność ogólnych objawów choroby – gorączka, poty i chudnięcie, cytopenie wtórne do nacieczenia
szpiku, anemia i trombocytopenia o podłożu autoimmunologicznym oporne na kortykosteroidy, narastająca splenomegalia i limfadenopatia, czas podwojenia limfocytozy krótszy
od 6 miesięcy (lub zwiększenie limfocytozy o 50% w ciągu
2 miesięcy). Leczenie ustala się indywidualnie dla każdego
pacjenta, a jego celem jest całkowita remisja, wydłużenie
czasu jej trwania i czasu przeżycia. Najbardziej pożądana,
a zarazem najtrudniejsza do uzyskania jest remisja molekularna [3, 6].
Czynniki prognostyczne
Klasyfikacje wg Rai i Bineta (tabele I i II), mimo, że nadal
są najbardziej istotne w ocenie stanu klinicznego pacjenta,
nie pozwalają jednak na pełną ocenę prognostyczną indywidualnego ryzyka i tempa progresji choroby oraz odpowiedzi
na leczenie. Częstym problemem przy wykorzystaniu już
zbadanych i przydatnych klinicznie czynników prognostycznych jest trudność i koszt ich oznaczania oraz brak standaryzacji. Dlatego też wiele z poniżej wymienionych badań
jest wykonywanych tylko w przypadku pacjentów młodych,
kwalifikowanych do allogenicznego przeszczepienia komórek krwiotwórczych [6]. Do klasycznych czynników rokowniczych zalicza się: czas podwojenia limfocytozy, ogólną liczbę krwinek białych, rodzaj naciekania szpiku. Ponadto źle
rokuje płeć męska i podeszły wiek. Do uznanych już czynników rokowniczych zalicza się aktywność dehydrogenazy
mleczanowej (LDH), kinazy tymidylowej (TK), surowicze
stężenie β2-mikroglobuliny, rozpuszczalne antygeny CD23
i CD44, aberracje genetyczne dotyczące regionów 11q, 13q,
17p oraz stan mutacyjny genu dla łańcucha ciężkiego immunoglobuliny (IgVH) oraz związana z nim ekspresja antygenów CD38 i ZAP-70 (tabela III) [3, 6].
W ostatnich latach uwaga badaczy została skierowana na
rolę prognostyczną ultrastruktur jądra komórkowego w patogenezie i przebiegu CLL.
Tabela I.
Klasyfikacja przewlekłej białaczki limfocytowej wg Rai (źródło [6]).
Okres kliniczny
Charakterystyka
Średnie przeżycie w latach
0
limfocytoza krwi obwodowej (>5x109/l) i szpiku (>40%)
powyżej 12
I
limfocytoza jak wyżej i powiększenie węzłów chłonnych
8
II
limfocytoza jak wyżej, powiększenie śledziony i/lub wątroby i/lub węzłów chłonnych
6
III
limfocytoza jak wyżej i stężenie hemoglobiny <11g/dl
1,5
IV
limfocytoza jak wyżej i małopłytkowość (PLT<100x109/l)
1,5
PLT - płytki krwi
Tabela II.
Klasyfikacja przewlekłej białaczki limfocytowej wg Bineta (źródło [6]).
Okres
kliniczny
Średnie przeżycie
w latach
A
<3 grupy węzłowe zajęte przez proces nowotworowy, bez niedokrwistości i małopłytkowości
powyżej 10
B
>3 grupy węzłowe zajęte przez proces nowotworowy, bez niedokrwistości i małopłytkowości
5
C
stężenie hemoglobiny<10g/dl i /lub małopłytkowość (PLT<100x109/l)
2
PLT - płytki krwi
64
Charakterystyka
Tabela III.
Najważniejsze czynniki prognostyczne w przewlekłej białaczce limfocytowej (źródło [ 3, 6]).
Czynnik rokowniczy
Rokowanie korzystne
Rokowanie niekorzystne
rodzaj naciekania szpiku
niedyfuzyjny
dyfuzyjny
odsetkowy naciek szpiku
<80% limfocytów
>80% limfocytów
leukocytoza
<50x109/l
>50x109/l
czas zdwojenia limfocytozy
<12 miesięcy
>12 miesięcy
aktywność LDH i KT
prawidłowe
podwyższone
stężenie β2-mikroglobuliny
prawidłowe
podwyższone
aberracje genetyczne
kariotyp prawidłowy, izolowana del(13q)
del(11q)
del(17p)
ekspresja CD23
prawidłowa
podwyższona
ekspresja CD38
<30% limfocytów
>30% limfocytów
mutacja IgVH
obecna
brak
ekspresja białka ZAP-70
>20% limfocytów
<20% limfocytów
LDH – dehydrogenaza mleczanowa, IgVH- geny regionu zmiennego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, KT – kinaza tymidylowa
Prognostyczny aspekt organizatorów jąderkowych.
Jąderko to element jądra komórkowego, w którym zachodzi transkrypcja genów do matryc rybosomalnego RNA
i organizacja cząstek prerybosomowych. Jest to struktura
bardzo dynamiczna, która zależy od fazy cyklu komórkowego. Strukturalnie jąderko składa się z centrów fibrylarnych,
gęstego składnika fibrylarnego, składnika granularnego,
wakuoli jąderkowych, chromatyny zasocjowanej i macierzy
jąderkowej. Jąderko jest tworzone z regionów organizatorów
jąderkotwórczych NOR (Nucleolus Organizer Region). NOR
składają się z genów kodujących głównie rybosomalne RNA
oraz z srebrnochłonnych niehistonowych kompleksów białkowych. Do białek AgNOR należą m.in. nukleolina, białko
B23, fibrylaryna, duża podjednostka polimerazy pierwszej
RNA. Białka te wykazują powinowactwo do metali ciężkich
stąd też upowszechniła się metoda srebrzenia koloidowego, co „zaowocowało” nazwą AgNOR. Strefy organizatorów
jąderkowych widoczne są jako czarne lub ciemnobrązowe
ziarnistości w obrębie jądra komórkowego [7, 8, 9].
Jąderko cechuje się dużą dynamiką morfologii w czasie cyklu
komórkowego. Podczas mitozy jąderko zanika, a tworząca je
chromatyna organizatorów jąderkotwórczych uwidacznia się
w metafazie jako wtórne przewężenie na ramieniu chromosomu metafazalnego. W ludzkim genomie znajduje się 10 obszarów jąderkotwórczych na ramionach chromosomów akrocentrycznych: 13, 14, 15, 21 i 22. W interfazie chromatyna
NOR pozostaje rozproszona jako gęsty składnik fibrylarny ją-
derka, przy czym jej stan tzn. ilość i wielkość, uwarunkowane
są potencjałem podziałowym i dojrzałością komórki. Młodsze
i intensywnie dzielące się komórki posiadają więcej mniejszych obszarów interfazalnego NOR, co spowodowane jest
wzrostem syntezy rRNA przed podziałem komórkowym [7,
8, 10].
AgNOR w CLL
Istnieją udokumentowane badania związku AgNOR ze stopniem złośliwości nowotworu oraz jego lekowrażliwością.
W przewlekłej białaczce limfocytowej stwierdzono, że struktura AgNOR wykazuje związek z czasem podwojenia limfocytozy. U pacjentów chorujących na CLL zaobserwowano
AgNOR występujące w skupiskach lub pojedyncze i rozproszone. Pojedyncze AgNOR wykazują komórki pozostające
w stanie spoczynku, natomiast skupiska AgNOR odpowiadają komórkom proliferującym, zazwyczaj wykazującym istotne mutacje w DNA. Skupiska AgNOR, a właściwie komórki
z jednym takim skupiskiem, najlepiej korelują z czasem
podwojenia limfocytozy, odpowiadają frakcji limfocytów ze
zwiększonym potencjałem proliferacyjnym i większą opornością na apoptozę. Ilość takich komórek może być parametrem prognostycznym korelującym z agresywnością choroby i długością trwania stabilnej fazy choroby. Wykazano, że
wzrost odsetka limfocytów ze skupiskami AgNOR powyżej
13% wskazuje na progresję choroby, natomiast jego zmniejszenie świadczy o skuteczności leczenia. Poza potwierdzo65
Ekspresja wybranych białek jąderkowych w limfocytach przewlekłej białaczki limfocytowej
ną przydatnością kliniczną dużą zaletą powyższego badania
jest jego prostota i stosunkowo niewielki koszt, natomiast
problemem pozostaje mała powtarzalność uzyskiwanych
wyników [8, 9, 11].
Białka jąderkowe
Analiza proteomiczna jąderka pozwoliła na zidentyfikowanie
około 700 białek w nim zawartych. Wykorzystując narzędzia bioinformatyki w poszukiwaniu homologii strukturalnej
i funkcjonalnej białek jąderkowych sklasyfikowano je w wielu
grupach co prezentuje rycina 1. W przeważającej części są
to wielofunkcyjne fosfoproteidy. Główną funkcją dużego odsetka białek jąderkowych jest zaangażowanie w cały proces
biosyntezy rybosomów komórki, począwszy od transkrypcji
i translacji genów dla rybosomalnego RNA, przez modyfikacje posttranskrypcyjne i posttranslacyjne, aż do tworzenia
prawidłowych podjednostek rybosomów i ich eksportu do
cytoplazmy. Z tego powodu białka jąderkowe są często zaliczane do białek „opiekuńczych”. Ich aktywność jest związana z potencjałem proliferacyjnym komórki [10, 12].
Nukleolina
Nukleolina została odkryta w 1973 roku. Jest to główne wielofunkcyjne białko jąderkowe stanowiące 10% wszystkich
komponentów białkowych jąderka. Gen dla nukleoliny znajduje się na ramieniu długim chromosomu drugiego. Białko
to zlokalizowane jest głównie w jąderku, w obrębie centrów
fibrylarnych i gęstego składnika fibrylarnego. Niewielka ilość
nukleoliny znajduje się również w nukleoplazmie, cytoplazmie i w błonie komórkowej, jako że białko to ma zdolność
migracji z jądra. Nukleolina nie występuje w dojrzałych rybosomach. Zaliczana jest do rodziny białek wiążących RNA
[10, 13].
Nukleolina posiada masę ok. 100 – 110 kDa. Charakteryzuje się złożoną budową i występowaniem odmiennych
strukturalnie i funkcjonalnie domen. Ujemnie naładowana
Rycina 1.
Klasyfikacja funkcjonalna białek jąderkowych (źródło [2]).
66
domena znajdująca się na aminowym końcu białka odpowiedzialna jest za wiązanie i transport cząsteczek białkowych oraz za interakcję z histonami i dekondensację chromatyny. Jest to również miejsce, gdzie zachodzi kluczowa
dla funkcjonalności białka enzymatyczna fosforylacja nukleoliny. Nukleolina może być fosforylowana przez kinazę
kazeinową II (CKII, Casein Kinase II), kinazę cyklinozależną I oraz przez kinazę białkową C (PKC-ξ, Protein Kinase C). Centralna część nukleoliny zawiera cztery domeny
wiążące RNA (RBD, RNA Binding Domain), następuje tu
wiązanie i zachowanie prawidłowego zwijania się rRNA.
C-końcowa część nukleoliny ma strukturę globularną, zdolność do wiązania kwasów nukleinowych, odpowiada za lokalizację białka w jąderku oraz wykazuje aktywność helikazy
DNA. Jej aktywność w komórce jest uzależniona od fazy
cyklu komórkowego: wysoka ekspresja nukleoliny występuje w komórkach o dużym potencjale proliferacyjnym (w tym
w komórkach nowotworowych), natomiast jest bardzo niska
w komórkach spoczynkowych (z powodu autodegradacji)
[10, 13].
Ekspresja nukleoliny jest regulowana na poziomie transkrypcji i translacji genu, a także za pomocą takich kowalencyjnych
modyfikacji jak fosforylacja, ADP-rybozylacja, metylacja,
oraz glikozylacja. Nukleolina pozajądrowa jest glikozylowana co powoduje lekkie przesunięcie w wartościach punktu
izoelektrycznego w stosunku do nukleoliny jąderkowej i jest
istotne w rozróżnianiu obu form białka. Ponadto ekspresja
nukleoliny może się zwiększać pod wpływem czynników
stresowych grożących degeneracją DNA takich jak np. promieniowanie jonizujące czy stres oksydacyjny [10].
Funkcje nukleoliny
Nukleolina jest białkiem wielofunkcyjnym. Bierze udział
w organizacji i dojrzewaniu prerybosomów od momentu
transkrypcji rDNA. Poprzez oddziaływanie z histonami doprowadza do dekondensacji chromatyny i wspomaga wią-
zanie i działanie kompleksu polimerazy I RNA, co ułatwia
transkrypcję. Nukleolina wiąże pre-rRNA na czas dojrzewania transkryptu co pozwala na utrzymanie jego struktury drugorzędowej. Te funkcje pozwalają na zaliczenie nukleoliny
do białek opiekuńczych procesu biosyntezy rybosomów. Ponadto stabilizuje koniec 3’ mRNA, m.in. mRNA antyapoptotycznego białka Bcl-2. Nukleolina odpowiada także za utrzymanie sferycznego kształtu i prawidłowej struktury jąderek.
Poza tym może stanowić cząsteczkę transportową przenoszącą m.in. białka i podjednostki rybosomów z jądra do cytoplazmy. Pełni również funkcje receptorowe dla czynników
wzrostu i mitogenów np. midkiny, plejotropiny, laktoferyny,
lamininy-1, czynnika wzrostu hepatocytów oraz dla lipoprotein. Sugeruje się także, że pełni rolę w procesach apoptozy, embriogenezy, angiogenezy i karcinogenezy. Nadmierna
ekspresja nukleoliny chroni prawdopodobnie komórkę przed
apoptozą. Wykazano związek nukleoliny z polimerazą poli(ADP-rybozy) PARP-1 (Poly ADP-Ribose Polymerase 1),
która jest ważnym białkiem naprawczym w przypadkach
uszkodzeń DNA. Udowodniono współdziałanie nukleoliny
z białkiem szoku termicznego Hsp70 w procesach naprawy
DNA po zadziałaniu czynników stresowych, oraz zapobieganiu apoptozy wywoływanej temperaturą, promieniowaniem,
stresem oksydacyjnym. Hsp70 reguluje sygnały i aktywację
cząsteczek na szlaku apoptozy oraz wspomaga i stabilizuje
nukleolinę. Ponadto nukleolina pełni ważną rolę w apoptozie
indukowanej działaniem cytotoksycznych limfocytów T: pod
wpływem granzymu A nukleolina aktywuje endonukleazy
DNA. Udowodniono także udział nukleoliny w zakażeniach
wirusowych (m.in. HIV, Human Immunodeficiency Virus)
i karcinogenezie indukowanej przez wirusy, np. HPV (Human
Papilloma Virus). Współuczestniczy ona wówczas w łączeniu się wirusa z komórką, pośredniczy w jego internalizacji,
a także bierze udział w kontroli replikacji wirusa i podtrzymaniu działania onkogenów wirusowych [10, 13, 14, 15].
Brak nukleoliny w komórce powoduje zatrzymanie jej wzrostu, zatrzymanie podziałów komórkowych i apoptozę. Ponadto dają się zaobserwować zaburzenia budowy jądra,
np. pojawia się kilka jąder lub nieprawidłowa wielkość jądra.
W badaniach nad hamowaniem ekspresji nukleoliny przez
interferujący RNA stwierdzono wzmożoną apoptozę, delokalizację struktur jądra, jąderka i centrosomu, wzrost ekspresji białka p53 i znacząco mniejszą transkrypcję rDNA, przy
zachowanej stosunkowo prawidłowej biosyntezie białka [13,
15].
Nukleolina w CLL
W badaniach nad nukleoliną w przewlekłej białaczce limfocytowej wykazano, że jej ekspresja w cytoplazmie limfocytów CLL jest ok. 26 razy wyższa w porównaniu z ekspresją
w limfocytach zdrowych, natomiast jej zawartość w jąderku
nie ulega zmianie Nie ustalono do tej pory czym jest to spowodowane. Zakłada się, że taki rozkład ekspresji następuje
już we wczesnym okresie rozwoju CLL i jest konstytutywny dla przewlekłej białaczki limfocytowej, jako że występuje
u wszystkich pacjentów niezależnie od stadium zaawansowania choroby. Nadekspresja nukleoliny wpływa na większą
stabilność mRNA Bcl-2, a co za tym idzie większą aktywność samego białka charakteryzującego się działaniem antyapoptotycznym i skutkującym zwiększoną lekoopornością.
Do tej pory nie stwierdzono charakterystycznych mutacji
genu dla Bcl-2 czy jego zwiększonej translacji, dlatego też
większą aktywność tego białka przypisuje się zwykle nadmiernej ekspresji nukleoliny i jej efektowi stabilizującemu.
Nukleolina chroni także mRNA Bcl-2 przed rybonukleazami
i deadenylacją [16, 17].
Nukleolinę można oznaczać wykorzystując przeciwciała
monoklonalne, co może stanowić alternatywę dla barwienia AgNOR w ocenie potencjału proliferacyjnego komórki.
Co więcej, otrzymane wyniki były bardziej powtarzalne niż
w przypadku barwienia AgNOR [14, 16]. Obecnie prowadzone są badania nad wybiórczym zablokowaniem konkretnych funkcji nukleoliny w danym kompartmencie komórki.
Podjęto próby nad opracowaniem metod blokowania mRNA
Bcl-2 oligonukleotydami nonsensownymi, blokowania wiązania mRNA z nukleoliną, jak dotąd bez większego powodzenia. Zaproponowano metodę hamowania nukleoliny na
powierzchni komórki przez pseudopeptyd HB-19. Nieodwracalne wiązanie pseudopeptydu do nukleoliny następuje
w miejscu domeny na C-końcu, powstały kompleks jest stabilny i zinternalizowany do cytoplazmy. Metoda ta pozwala
na ograniczenie funkcji receptorowej nukleoliny bez wpływu
na nukleolinę jąderkową, która jest niezbędna do przeżycia
komórki. W efekcie prowadzi to do zmniejszenia migracji
komórek nowotworowych i spowalnia proces angiogenezy.
W badaniach na zwierzętach zaobserwowano dużą skuteczność powyższej metody. Charakteryzuje się ona niewielką
toksycznością i dużą selektywnością, pseudopeptyd HB-19
jest wydalany przez nerki i nie jest akumulowany w organizmie. Być może metoda ta mogłaby w przyszłości znaleźć
zastosowanie w terapii nowotworów u ludzi, ograniczając
tworzenie przerzutów [10, 16, 18].
Nukleofosmina
Nukleofosmina, nazywana także numatryną czy białkiem
B23 to wysoce konserwatywna, wielofunkcyjna fosfoproteina jąderkowa należąca do rodziny białek opiekuńczych
dla histonów. Białko to występuje w 2 izoformach: B23.1
w składniku granularnym jąderka i B23.2 w nukleoplazmie. Nukleofosmina odzwierciedla potencjał proliferacyjny komórki, największą aktywność wykazując w komórkach intensywnie dzielących się, w tym nowotworowych,
oraz po zadziałaniu mitogenów. Gen dla nukleofosminy znajduje się na ramieniu długim chromosomu piątego. Nukleofosmina jest zlokalizowana głównie w jąderku,
ale stwierdza się ją także w powiązaniach z podjednostkami
rybosomów i centrosomami. Nukleofosmina charakteryzuje się złożoną budową. Hydrofobowa domena N-końcowa
odpowiada za funkcje białka opiekuńczego, wspomaga
transkrypcję i oligomeryzację z innymi cząsteczkami nu67
Ekspresja wybranych białek jąderkowych w limfocytach przewlekłej białaczki limfocytowej
kleofosminy oraz nadzoruje zmiany konformacyjne proapoptotycznego białka Bax. Ujemnie naładowana domena
centralna wykazuje aktywność rybonukleazy i odpowiada
za prawidłowe łączenie białek rybosomalnych i kwasów
nukleinowych w procesie tworzenia podjednostki rybosomów oraz za fosforylację nukleofosminy. Natomiast domena
C-końcowa odpowiada za wiązanie z kwasami nukleinowymi i lokalizację białka w jąderku. W 95% nukleofosmina występuje jako oligomer, najczęściej pentametr [19, 20, 21].
Funkcje nukleofosminy
Nukleofosmina oddziaływuje z histonami i chromatyną ułatwiając proces transkrypcji, jest zaangażowana w dojrzewanie rRNA, organizację białek rybosomalnych i kwasów
nukleinowych w funkcjonalne strukturalnie podjednostki rybosomu. W limfocytach B aktywnie uczestniczy w rearanżacji genów dla regionów zmiennych łańcucha ciężkiego
immunoglobuliny. Nukleofosmina może pełnić funkcje transportowe, jako że „krąży” między jąderkiem a nukleoplazmą
oraz jądrem i cytoplazmą. Cytoplazmatyczna nukleofosmina odpowiada także za prawidłową duplikację centrosomu poprzedzającą podział komórkowy. Ponadto pełni rolę
w utrzymaniu prawidłowego cyklu komórkowego, utrzymaniu stabilności genomu i w embriogenezie. Nukleofosmina
moduluje aktywność i stabilność białka p53. Poza tym wykazuje działanie antyapoptotyczne [20, 21, 22].
Nadekspresja nukleofosminy skutkuje zaburzonym dojrzewaniem RNA i nieprawidłowym łączeniem się kwasów nukleinowych z białkami rybosomalnymi, może także warunkować zaburzone różnicowanie się i dojrzewanie komórki.
Jednakże, jeśli nadekspresja nukleofosminy pojawia się
w odpowiedzi na czynniki stresowe jak np. promieniowanie jonizujące to wywiera efekt antyapoptotyczny i skutkuje
przedłużonym przeżyciem komórki wraz z naprawą uszkodzeń DNA, jako że nukleofosmina wpływa na wzrost ekspresji i aktywność antygenu jądrowego komórek proliferujących
(PCNA, Proliferating Cell Nuclear Antygen), jednego z ważniejszych białek naprawczych DNA [20, 23].
Nukleofosmina w nowotworach
W licznych badaniach wykazano istotną rolę nukleofosminy w patogenezie wielu rozrostów nowotworowych układu
chłonnego. Występują częste mutacje genu dla nukleofosminy, które prowadzą do powstawania białek fuzyjnych
głównie w anaplastycznym chłoniaku wielkokomórkowym
(ALCL, Anaplastic Large-Cell Lymphoma) oraz w rzadkich
typach strych białaczek szpikowych. Ponadto w ostrych
białaczkach szpikowych u około 30% pacjentów występują
dodatkowe mutacje w C-końcowej domenie nukleofosminy.
Mutacje w obszarze ramienia długiego chromosomu piątego i utrata genu nukleofosminy są częste w zespołach
mielodysplastycznych i skutkują niestabilnością genomu.
Wszelkie mutacje nukleofosminy objawiają się zaburzeniami
w przekazywaniu sygnałów wewnątrz komórki i nieprawidłową strukturą jąderka [19, 20].
68
Nukleofosmina w CLL
Stan zmutowania genu regionu zmiennego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny (IgVH) jest jednym z najważniejszych
czynników prognostycznych w przewlekłej białaczce limfocytowej. Pozwala na wyodrębnienie 2 grup chorych o różnym rokowaniu. Brak mutacji IgVH określany jest jako typ
I - przedzarodkowy, rokuje niekorzystnie szybką progresją,
krótszym czasem przeżycia, złą odpowiedzią na leczenie.
U takich pacjentów występuje często nadmierna ekspresja
CD38 i ZAP-70. Natomiast obecność mutacji w typie II tzw.
pozazarodkowym wiąże się zwykle z niską ekspresją CD38
i ZAP-70, przemawia za powolnym przebiegiem choroby
i możliwym wieloletnim przeżyciem bez progresji [3].
W ostatnich latach przeprowadzone zostały badania
w dwóch wyodrębnionych grupach pacjentów bez – i z mutacją IgVH nad transkryptomem oraz profilem białek jąderkowych wytwarzanych przez komórki nowotworowe CLL.
[24]. Pozwoliło to na wyróżnienie kilku protein wykazujących
istotne różnice ekspresji między pacjentami z występującą
mutacją IgVH a pacjentami u których taka mutacja nie występuje: Jest to m.in. białko przykrywające aktynę (F-actin
capping protein), prekursor białka wiążącego lamininę (laminin-binding protein precursor), białko 14-3-3 β oraz nukleofosmina. W badaniach Cochrana i wsp. wykazano, że
ekspresja nukleofosminy występuje tylko w limfocytach CLL
u pacjentów z mutacją genu regionu zmiennego łańcucha
ciężkiego immunoglobuliny [24]. W badaniach Rees-Unwin
i wsp. dokonano podobnej analizy skupiając się tylko na nukleofosminie, która wykazuje najbardziej istotne różnice ekspresji między grupami chorych, co mogłoby wskazywać na
jej potencjalną wartość diagnostyczną. Wyniki badan różniły
się istotnie od opisanych przez Cochrana i wsp., co mogło
wynikać, jak sugerowano, ze specyfiki metody badawczej.
U pacjentów bez mutacji genu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny (IgVH) stwierdzono znacznie większą ekspresję
nukleofosminy ze znacznym przesunięciem do cytoplazmy
natomiast u pacjentów z mutacją IgVH ekspresja nukleofosminy pozostawała na poziomie charakterystycznym dla
ludzi zdrowych. Konieczne są jednak dalsze badania, ponieważ wyniki pozostają wciąż niejednoznaczne [25].
Fibrylaryna
Fibrylaryna to wysoce konserwatywne białko jąderkowe
o masie 34kDa, zlokalizowane w centrach fibrylarnych jąderka, kodowane przez gen FBL zlokalizowany na chromosomie 19. Fibrylaryna charakteryzuje się złożoną budową.
Można w niej wyróżnić domenę N-końcową odpowiedzialną
za wiązanie cząsteczek białka i lokalizację w jąderku. Centralna domena odpowiada za wiązanie cząsteczek RNA.
Domena C-końcowa, wyróżniająca się strukturą α-helisy jest
w budowie podobna do transferaz metylowych i zakłada się,
że pełni analogiczną funkcję. Fibrylaryna może występować
w dwóch formach o zmodyfikowanej funkcjonalności. Wywołane jest to prawdopodobnie istnieniem w cząsteczce białka dwóch reszt cysteinowych Cys99 i Cys268, zdolnych do
tworzenia mostków siarczkowych. Fakt ten może wpływać
na mobilność cząsteczki, jej lokalizację w jąderku i aktywność transferazy metylowej. W komórce fizjologicznej większy odsetek puli fibrylaryny stanowi forma z zredukowanymi
resztami cysteinowymi o większej mobilności. Natomiast
w komórkach nowotworowych rozkład procentowy może
ulegać zmianie [26, 27, 28].
Funkcje fibrylaryny
Fibrylaryna jest funkcjonalnie powiązana z nukleoliną i nukleofosminą. Pełni funkcje w procesie biosyntezy rybosomów i bierze udział w modyfikacjach pre-RNA, zwłaszcza
w procesie metylacji. Ponadto stanowi element niezbędny
do prawidłowego funkcjonowania snRNAs. Wpływa także na
morfologię jądra i stabilność genomu. Potwierdzona została
rola fibrylaryny w embriogenezie. Mutacje w genie fibrylaryny skutkujące zaburzeniami w jej ytwarzaniu lub funkcji
mogą być letalne dla zarodka [26, 29, 30].
Jak dotychczas nie ukazały się publikacje dotyczące ekspresji fibrylaryny w limfocytach przewlekłej białaczki limfocytowej, ale w przedwstępnych wynikach badań własnych, można przypuszczać, że ekspresja tego białka dodatnio koreluje
ze stadium zaawansowania klinicznego CLL (rycina 2).
Rycina 2.
Ekspresja fibrylaryny we frakcjach jąderkowych w 6 przypadkach
przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL 1-6) analizowana metodą
Western Blot. CLL 1, 4, 6 – III stadium zaawansowania klinicznego
wg Rai, CLL 2 – stadium 0 wg Rai, CLL 3 i 5 – stadium I wg Rai.
Podsumowanie
Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) rozwija się głównie
u ludzi w starszym wieku, obecna mediana wieku zdiagnozowania to 66 rok życia. Ze względu na globalnie postępujący proces starzenia się społeczeństwa CLL może stanowić
narastający problem epidemiologiczny.
Najistotniejszym parametrem decydującym o rozpoczęciu
leczenia jest stopień zaawansowania klinicznego CLL oceniany według klasyfikacji Rai lub Bineta. Niedoskonałością
tych klasyfikacji w odniesieniu do prognozowania przebiegu
choroby jest fakt, że około 50% pacjentów w chwili rozpo-
znania spełnia kryteria choroby wczesnej i nie można przewidzieć, u których nastąpi szybka progresja CLL, u których
natomiast przebieg choroby będzie stabilny i przez wiele lat
nie będzie wymagał leczenia cytostatycznego. Szczególnie
istotne jest prognozowanie odpowiedzi na standardowe programy terapeutyczne, a także wyodrębnienie tych pacjentów
z małą masą nowotworu, którzy odnieśliby korzyść z wczesnego rozpoczęcia leczenia lub z jego intensyfikacji [31].
U podstaw każdego patologicznego procesu rozrostowego,
podobnie jak w przewlekłej białaczce limfocytowej istotne zmiany lokalizują się na poziomie molekularnym. Stąd
też rosnące zainteresowanie naukowców m.in. aberracjami genetycznymi i oceną ekspresji białek w nowotworowo
stransformowanej komórce jako potencjalnymi markerami
diagnostycznymi i prognostycznymi. Dotychczasowe doniesienia literaturowe dotyczą ekspresji zaledwie kilku białek
jąderkowych biorących udział w kluczowych etapach biogenezy rybosomów, których ekspresję oceniano w limfocytach
przewlekłej białaczki limfatycznej. Można przypuszczać, że
będzie to kolejny, nowy obiecujący kierunek badań nad patogenezą CLL.
Piśmiennictwo
1. Munker R, Hiller E, Glass J, et al. Modern hematology. Humana
Press Inc 2007; 253-258.
2. Jemal A, Siegel R, Xu J, et al. Cancer statistics 2010. Cancer J
Clin 2010; 60: 277-300.
3. Robak T. Czynniki prognostyczne w przewlekłej białaczce limfatycznej. Acta Haematol Pol 2003; 34: 395-405.
4. Ciesla B. Hematology in practice. Davis FA, Company. 2007;
205-207.
5. Montillo M, Hamblin T, Hallek M, et al. Chronic lymphocytic
leukemia:novel prognostic factors and their relevance for riskadapted therapeutic strategies. Haematologica 2005; 90: 391399.
6. Lewandowski K, Matuszak M. Czynniki prognostyczne w przewlekłej białaczce limfatycznej B-komórkowej. Współcz Onkol
2003; 7: 470-475.
7. Bieńkiewicz A, Korczyński J, Gottwald L, i wsp. Zastosowanie
oceny stref organizatorów jąderkowych w onkologii ginekologicznej. Prz Menopauz 2005; 1: 28-32.
8. Metze K, Chiari AC, Andrade FL, et al. Changes in AgNORs
configuration during the evolution and treatment of chronic lymphocytic leukemia. Hematol Cell Ther 1999; 41: 205-210.
9. Metze K, Lobo AM, Lorand-Metze I. Nucleolus organizer regions
and total tumor mass are independent prognostic parameters
for treatment-free period in chronic lymphocytic leukemia. Int J
Cancer 2000; 89: 440-443.
10. Masiuk M. Nukleolina – charakterystyka białka i jego rola w biologii nowotworów i infekcjach wirusowych. Post Biol Komórki
2008; 35: 207-228.
11. Oliveira GB, Pereira FG, Metze K, et al. Spontaneous apoptosis
in chronic lymphocytic leukemia and its relationship to clinical
and cell kinetic parameters. Cytometry 2001; 46: 329-335.
12. Andersen JS, Lam YW, Leung AK, et al. Nucleolar proteome
dynamics. Nature 2005; 433 77-83.
13. Srivastava M, Pollard HB. Molecular dissection of nucleolin’s
role in growth and cell proliferation: new insights. FASEB J
1999; 13: 1911-1919.
14. Hovanessian AG, Soundaramourty C, El Khoury D, et al. Surface expressed nucleolin is constantly induced in tumor cells
to mediate calcium-dependent ligand internalization. PLoS One
2010; 5: 12.
69
Ekspresja wybranych białek jąderkowych w limfocytach przewlekłej białaczki limfocytowej
15. Jiang B, Zhang B, Liang P, et al. Nucleolin/C23 mediates the
antiapoptotic effect of heat shock protein 70 during oxidative
stress. FEBS J 2010; 277: 642-652.
16. Otake Y, Soundararajan S, Sengupta TK, et al. Overexpression
of nucleolin in chronic leukemia cells induces stabilization of
bcl2 mRNA. Blood 2007; 109: 3069-3075.
17. Soundararajan S, Wang L, Sridharan V, et al. Plasma membrane nucleolin is a receptor for the anticancer aptamer AS1411
in MV4-11 leukemia cells. Mol Pharm 2009; 76: 984-991.
18. Destouches D, El Khoury D, Hamna Kourbali Y, et al. Suppression of tumor growth and angiogenesis by a specific antagonist
of the cell-surface expressed nucleolin. PLoS One 2008; 18:
2518.
19. Falini B, Nicoletti I, Bolli N, et al. Translocations and mutations
involving the nucleophosmin (NPM1) gene in lymphomas and
leukemias. Haematologica 2007; 92: 519-532.
20. Lindstrom M, Zhang Y. Ribosomal protein S9 is a novel B23/
NPM-binding protein required for normal cell proliferation. J Biol
Chem 2008; 283: 15568-15576.
21. Weng JJ, Yung BY. Nucleophosmin/B23 regulates PCNA promoter through YY1. Biochem Biophys Res Commun 2005; 335:
826-831.
22. Wu MH, Chang JH, Yung BY. Resistance to UV-induced cell-killing in nucleophosmin/B23 overexpressed NIH 3T3 fibroblasts:
enhancement of DNA repair and up-regulation of PCNA in association with nucleophosmin/B23 overexpression. Carcinogenesis 2002; 23: 93-100.
23. Lefevre F, Garnotel R, Georges N, et al. Overexpression of the
nucleolar protein nucleophosmin/B23 in collagen lattice-cultured
fibroblasts: Potential role in the control of protein synthesis. Mol
Cell Biochem 2002; 229: 45-50.
24. Cochran DA, Evans CA, Blinco D, et al. Proteomic analysis of
chronic lymphocytic leukemia subtypes with mutated or unmutated IgVH genes. Mol Cell Proteomics 2003; 2: 1331-1341.
25. Rees-Unwin KS, Faragher R, Unwin RD, et al. Ribosome-associated nucleophosmin 1: increased expression and shuttling activity distinguishes prognostic subtypes in chronic lymphocytic
leukemia. Br J Hematol 2010; 148: 534-543.
26. Amin MA, Matsunaga S, Ma N, et al. Fibrillarin, a nucleolar
protein is required for normal nuclear morphology and cellular
growth in HeLa cells. Biochem Biophys Res Commun 2007;
360: 320-326.
27. Barygina VV, Veiko VP, Zatsepina OV. Analysis of nucleolar protein fibrillarin mobility and functional state in living HeLa cells.
Biochemistry 2010; 75: 979-988.
28. Billot K, Soeur J, Chereau F, et al. Deregulation of Aiolos expression in chronic lymphocytic leukemia is associated with epigenetic modifications. Blood 2011; 117: 1917-1927.
29. Chen M, Jiang P. Altered subcellular distribution of nucleolar
protein fibrillarin by actinomycin D in HEp-2 cells. Acta Pharmacol Sin 2004; 25: 902-906.
30. Newton K, Petfalski E, Tollervey D, et al. Fibrillarin is essential for early development and required for accumulation of an
intron-encoded small nucleolar RNA in the mouse. Mol Cell Biol
2003; 23: 8519-8527.
31. Hallek M, Cheson BD, Catovsky D, et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report
from the International Workshop of Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996
guidelines. Blood 2008; 111: 5446-5456.
70
Zaakceptowano do publikacji 08.02.2012
Adres do korespondencji:
dr n. med. Iwona Urbanowicz
Zakład Hematologii Laboratoryjnej, Katedra Analityki Medycznej
50-367 Wrocław, ul. Pasteura 2
tel. (71) 7841206, faks (71) 7840054
adres email:[email protected]