pobierz

PRACA ORYGINALNA
Original Article
Acta Haematologica Polonica
2006, 37, Nr 3 str. 415–420
K. MAŚLANKA, H. MICHUR, K. MIKULSKA
Ocena przeciwciał płytkowych reagujących z mysimi
immunoglobulinami u osób z małopłytkowością
Evaluation of anti- mouse antibodies in persons with thrombocytopenia
Z Zakładu Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej IHiT w Warszawie
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Barbara Żupańska do 31.12.2005 r.,
Prof. dr hab. med. Ewa Brojer od 1.01.2006 r.
SŁOWA KLUCZOWE: Przeciwciała przeciw-mysim immunoglobulinom – Małopłytkowość immunologgiczna – Swoiste przeciwciała płytkowe
KEY WORDS:
Anti- mouse antibodies – Immune thrombocytopenia – Platelet specific antibodies
STRESZCZENIE: W pracy przeanalizowano występowanie przeciwciał skierowanych do mysich immunoglobulin (Ig), które wykrywano przy okazji badania przeciwciał przeciwpłytkowych. Badania wykonano u: 304 chorych z ITP, 247 chorych z małopłytkowoscią wtórną, 277
ciężarnych i 122 osób zdrowych.
Przeciwciała skierowane do mysich Ig były wykrywane z podobną częstością w obu grupach
chorych z małopłytkowością jak i u osób zdrowych i dlatego nie mogą być one dodatkowym
wskaźnikiem procesu autoimmunizacyjnego. Jakkolwiek częstość wykrywania tych przeciwciał
u kobiet w ciąży z małopłytkowością i bez małopłytkowości była podobna, to była ona istotnie
wyższa niż u kobiet nie będących w ciąży. Jest to zgodne z różnymi obserwacjami o możliwości
pobudzenia układu immunologicznego u kobiet w ciąży.
SUMMARY: We analized the presence of antibodies against mouse immunoglobulins (Ig),
which were detected during examination of anti-platelet antibodies. The test was done in: 304
ITP patients, 247 patients with secondary thrombocytopenia, 277 pregnant women and 122
healthy persons.
The percentage of antibodies reacting with mouse Ig in both groups of patients with thrombocytopenia was similar to that observed in healthy persons, such antibodies cannot be regarded as an
additional sign of immunological process. Although the percentage of anti-mouse Ig was also
similar in pregnant women with and without thrombocytopenia, this percentage was significantly higher than that in non pregnant women. This is in concordance with some observations
that the immunological system may be activated during pregnancy.
Małopłytkowość autoimmunologiczną (samoistną) (ITP – ang. idiopathic thrombocytopenic purpura) rozpoznaje się zazwyczaj u chorych z małopłytkowością i zwięk-
160
K. MAŚLANKA i wsp.
szoną lub prawidłową liczbą megakariocytów oraz przyspieszonym niszczeniem płytek
krwi w układzie siateczkowo-śródbłonkowym. U takich chorych nie znajduje się innej
choroby mogącej powodować niską liczbę płytek krwi. Wykrycie przeciwciał na płytkach krwi lub w surowicy chorego może być potwierdzeniem klinicznie udokumentowanej małopłytkowości autoimmunologicznej (2, 3, 13, 15, 16).
Metoda immunoenzymatyczna z użyciem odczynników monoklonalnych – MAIPA (Monoclonal Antibody-specific Immobilization of Platelet Antigens) uznana jest
za najlepszy test do wykrywania swoistych przeciwciał płytkowych (10). Przy użyciu
tej metody u 20–60% chorych z ITP wykrywa się przeciwciała przeciwpłytkowe skierowane do różnych glikoprotein błonowych płytek (GP), najczęściej GPIIb/IIIa, Ib,
Ia/IIa (2, 8, 15, 18). W początkowym okresie stosowania testu MAIPA zwrócono uwagę, że niekiedy przeciwciała wykrywane w tym teście mogą być skierowane do mysich
immunoglobulin (Ig). Możliwość wykrycia takich przeciwciał była spowodowana tym,
że stosowane w tej metodzie przeciwciała monoklonalne są pochodzenia mysiego. Dowodem na obecność w surowicach ludzkich przeciwciał skierowanych do mysich Ig
był brak reaktywności surowicy w teście MAIPA, jeżeli uprzednio surowica ta była
absorbowana mysimi Ig. Te obserwacje doprowadziły do zmodyfikowania testu MAIPA tak, aby można było wykrywać przeciwciała płytkowe skierowane jedynie do epitopów GP płytek krwi znajdujących się u ludzi (11).
Z badań Clofent-Sanchez i wsp. (4, 6) przeprowadzonych w niewielkiej grupie
osób wynikało, że przeciwciała przeciw-mysim Ig były czterokrotnie częściej wykrywane u chorych z małopłytkowością autoimmunologiczną niż u osób zdrowych. Wykonywane przez nas rutynowo badania przeciwciał przeciwpłytkowych, przy użyciu
testu MAIPA przed jego modyfikacją, również wskazywały na obecność w surowicach niektórych osób przeciwciał skierowanych do mysich Ig.
Celem obecnej pracy jest podsumowanie wykrywalności przeciwciał przeciw-mysim Ig u chorych z małopłytkowością, u kobiet ciężarnych i osób zdrowych (grupa
kontrolna).
MATERIAŁ
Surowice osób z małopłytkowością (z liczbą płytek < 100 x 10 9 /L), z klinik lub
przychodni specjalistycznej IHiT: 304 chorych z ITP, 247 chorych z małopłytkowością wtórną, 135 kobiety ciężarne z podejrzeniem ITP.
Badania kontrolne wykonano u: 122 osób zdrowych, w tym 44 kobiet (nie ciężarnych) oraz 142 kobiet ciężarnych bez małopłytkowości.
METODY BADANIA
1. Przeciwciała płytkowe w surowicach chorych z małopłytkowością i u osób zdrowych badano przy użyciu metody immunoenzymatycznej MAIPA wg Kiefel i wsp.
(10, 11). Zasada metody została opisana szczegółowo w pracy wcześniejszej (14).
2. Absorbcja surowic mysimi Ig.
Ocena przeciwciał płytkowych
161
Surowicę, w której wykrywano przeciwciała płytkowe w teście MAIPA, inkubowano przez 30 minut w temp. 37oC, z kuleczkami agarozowymi opłaszczonymi mysimi Ig klasy IgG (odczynnik Chrom Pure Mouse IgG, firmy Jackson ImmunoResearch)
w proporcji 4:1. Próbkę wirowano przy 15 500 x g, przez 10 min., i odciągniętą surowicę badano ponownie w teście MAIPA. Jeżeli w surowicy po absorbcji nie stwierdzano przeciwciał płytkowych w teście MAIPA, to uznawano, że wykryte poprzednio
przeciwciała skierowane były do mysich Ig. Natomiast, jeżeli surowica po absorbcji
nadal reagowała w teście MAIPA, to uważano, że są w niej swoiste przeciwciała płytkowe.
Analizę statystyczną wyników badań wykonano przy użyciu testu chi kwadrat,
z uwzględnieniem poprawki Yatesa, dla liczebności badań poniżej 40.
WYNIKI
Wyniki badań przeciwciał skierowanych do mysich Ig oraz swoistych przeciwciał
przeciwpłytkowych u osób z małopłytkowością i u osób zdrowych przedstawiono w
tabeli 1. Częstość wykrywania przeciwciał przeciw-mysim Ig u chorych z ITP i z
małopłytkowością wtórną nie różniły się istotnie między sobą, ani w porównaniu z
osobami zdrowymi, odpowiednio 6,6%, 8,5%, 5,7%. Natomiast u chorych z ITP swoiste przeciwciała płytkowe występowały istotnie częściej (p<0,01) niż przeciwciała
przeciw-mysim Ig (13,8% vs 6,6%). Swoistych przeciwciał płytkowych nie stwierdzano u osób zdrowych ani u kobiet w ciąży bez małopłytkowości.
Tabela 1. Częstość występowania przeciwciał skierowanych do mysich Ig w porównaniu ze swoistymi
przeciwciałami płytkowymi
Table 1. Frequency of antibodies directed against mouse Ig in comparison with specific platelet antibodies
Surowice osób badanych
Chorzy z ITP
Chorzy z małopłytkowością
wtórną
Kobiety ciężarne z małopłytkowością
Kobiety ciężarne bez małopłytkowości
Osoby zdrowe:
w tym: kobiety
ogółem
304
Liczba (%) osób
z przeciwciałami przeciw
z przeciwciałami płytkowycmi
mysim Ig
20 (6,6)
42 (13,8)
247
21 ( 8,5)
25 (10,1)
135
17 (12,6)
2 (1,5)
142
26 (18,3)
0
122
44
5
1
(5,7)
(2,3)
0
U kobiet ciężarnych częstość wykrywania przeciwciał przeciw-mysim Ig, zarówno
u kobiet z małopłytkowością jak i bez małopłytkowości nie różniła się istotnie statystycznie (12,6% vs 18,3%). Jednakże procent tych przeciwciał w obu grupach kobiet
ciężarnych był istotnie wyższy (p<0,01), niż u zdrowych osób (5,7%), w tym u kobiet
162
K. MAŚLANKA i wsp.
nie będących w ciąży (2,3%). Natomiast swoiste przeciwciała płytkowe wykryto tylko
u 2 na 135 (1,5%) ciężarnych z małopłytkowością i odsetek ten był istotnie niższy
(p<0,001) niż przeciwciał skierowanych do mysich Ig (12,6%).
DYSKUSJA
Przyczyna występowania w surowicach ludzkich przeciwciał skierowanych do
mysich Ig nie jest znana. Nie wiadomo także z jakim epitopem Ig na odczynniku
monoklonalnym, który używa się w teście MAIPA, wiążą się przeciwciała przeciw-mysim Ig.
Można wysuwać różne przypuszczenia tłumaczące występowanie takich przeciwciał u ludzi. Na przykład, w związku z obecnością różnego rodzaju przeciwciał anty-wirusowych czy anty-bakteryjnych, a także tzw. przeciwciał naturalnych biorących
udział w usuwaniu zużytych elementów morfotycznych krwi (7, 17), nie można wykluczyć, że do takich przeciwciał mogą także należeć wykrywane przez nas przeciwciała, które krzyżowo reagują z Ig mysimi.
Według Clofent –Sanchez i wsp. (4, 5, 6), przeciwciała skierowane do mysich Ig
mogą być dodatkowym wskaźnikiem procesu autoimmunizacyjnego. Wykazli oni bowiem obecność tych przeciwciał u 56,5% (13/23) chorych z podejrzeniem małopłytkowości o podłożu immunologicznym, a tylko u 10% (2/20) zdrowych osób. Nasze badania nie potwierdzają jednak tych obserwacji, ponieważ przeciwciała skierowane do
mysich Ig były wykrywane z podobną częstością u chorych z małopłytkowością jak i u
osób zdrowych. Taka rozbieżność obserwacji może wynikać z niewielkiej grupy badanych osób przez wyżej wymienionych autorów.
Według cytowanych autorów (4, 5, 6) jak i naszym zdaniem wydaje się, że prawdopodobne może być uznanie przeciwciał reagujących z mysimi Ig za przeciwciała antyidiotypowe. Jeżeli przyjmiemy taką koncepcję, to przeciwciała skierowane do mysich Ig stwierdzane u osób z małopłytkowością mogłyby być zaliczone do przeciwciał
anty-idiotypowych tzw. prywatnych, ponieważ są skierowane do tych samych GP co
swoiste przeciwciała płytkowe wykrywane u tych chorych. Natomiast wśród immunoglobulin każdego człowieka znajduje się pewien odsetek przeciwciał anty- idiotypowych, tzw. publicznych, ponieważ są skierowane do przeciwciał o różnej swoistości
znajdujących się w krążeniu każdego człowieka. Do takich przeciwciał mogłyby należeć przeciwciała przeciwmysim Ig wykrywane przez nas w surowicach osób zdrowych
(9).
Bardziej skomplikowane jest wytłumaczenie, dlaczego u kobiet ciężarnych, bez
względu na to czy mają one małopłytkowość, czy też nie, częściej występują przeciwciała skierowane do mysich Ig niż w innych analizowanych przez nas grupach osób.
W literaturze nie znaleziono podobnych doniesień. Jak wiadomo płód jest specyficznym przykładem przeszczepu allogenicznego i układ immunologiczny kobiety w ciąży
poddany jest ekspozycji na szereg obcych antygenów. Ogólnie uważa się, że w ciąży
dominuje odpowiedź humoralna na rzecz osłabienia reakcji komórkowych (12). Koncepcja występowania przeciwciał anty-idiotypowych, które krzyżowo reagują z Ig my-
Ocena przeciwciał płytkowych
163
simi, również może odnosić się do kobiet ciężarnych, a zwiększona ich częstość występowania mogłaby wskazywać na wysoką „gotowość immunologiczną organizmu” (1,
12).
Podsumowując nasze obserwacje – przeciwciała skierowane do mysich Ig były wykrywane: 1) z podobną częstością u chorych z małopłytkowością jak i u osób zdrowych i dlatego nie mogą być one dodatkowym wskaźnikiem procesu autoimmunizacyjnego, 2) wyższa częstość ich wykrywania u kobiet ciężarnych niż u osób zdrowych, może być zgodna z różnymi obserwacjami o pobudzeniu układu immunologicznego u kobiety w ciąży.
Na zakończenie należy dodać, że w chwili obecnej, do wykrywania swoistych
przeciwciał płytkowych stosujemy, podobnie jak inni badacze, zmodyfikowaną wersję
testu MAIPA (11), wobec czego nie ma już możliwości wykrywania przeciwciał skierowanych do mysich Ig.
PIŚMIENNICTWO
1. Anderson R.W. On the transmission of immunity: a „molecular attention” hypothesis. Biosystems, 1995; 34: 87–105.
2. Brighton TA, Evans S, Castaldi CN i wsp. Prospective evaluation of the clinical usefulness of an
anigens-specific assay (MAIPA) in idiopathic thrombocytopenic purpura and other immune thrombocytopeniaa. Blood 1996; 88: 194-–01
3. Cines DB, Blanchette MB. Immune thrombocytopenic purpura. N Eng J Med 2002; 13: 996–1008.
4. Clofent-Sanchez G, Laroche-Traineau J, Bermudes H i wsp. A patient with autoimmune thrombocytopenic purpura demonstrating serum antibodies reactive with mouse cross-reactive idiotypes. Clin. Immunol. Immunopathol. 1995; 77: 271–281.
5. Clofent-Sanchez G, Lucas S, Laroche-Traineau J i wsp. Autoantibodies and anti-mouse antibodies
in thtombocytopenic patients as assessed by different MAIPA assays. Brit. J. Haematol., 1996; 95:
153–160.
6. Clofent-Sanchez G, Laroche-Trainean J, Lucas S i wsp. Incidence of anti-mouse antibodies in
thrombocytopenic patients with autoimmune disorders. Hum.Antibodies., 1997; 8: 50–59.
7. Horn M.P, Lacroix-Desmazes S, Stahl D i wsp. Natural antibodies- benefits of recognizing
“self”.Mod.Asp.Immunobiol., 2001; 1: 267–270.
8. Hou M, Stockelberg D, Kutti J i wsp. Antibodies against platelet GPIb/IX, GPIIb/IIIa, and other
platelet antigens in chronic idiopathic thrombocytopenic purpura. Eur J Haematol. 1995; 55: 307–314.
9. Jakubisiak M. Naturalna regulacja odpowiedzi immunologicznej w Immunologia, Red.Gałą J, Jakubisiak M, Lasek W, wyd. PWN, Warszawa 2002, 249–258.
10. Kiefel V, Santoso S, Weisheit M, Mueller-Eckhardt C. Monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigens (MAIPA). A new tool for the identification of platelet antibodies. Blood 1987;
70: 1723–1726.
11. Kiefel V. The MAIPA assay and its applications in immunohaematology. Transf. Med. 1992; 2:
181–188.
12. Kurpisz M. Immunologia rozrodu w Immunologia, Red.Gałą J, Jakubisiak M, Lasek W, wyd.
PWN, Warszawa 2002, 314–325.
13. McMillan R. Autoantibodies and autoantigens in chronic immune thrombocytopenic purpura. Semin Thromb 2000; 37: 239–248.
14. Maślanka K, Brojer E, Gromadzka G. Żupańska B. Ocena wykrywalności przeciwciał przeciwpłytkowych przy użyciu testu enzymatycznego z wyizolowaną glikoproteiną IIb/IIIa błony krwinki płytko-
164
K. MAŚLANKA i wsp.
wej: porównanie z testem immunofluorescencyjnym oraz testem enzymatycznym z użyciem przeciwciał
monoklonalnych. Acta Haematol Pol 1993; 24: 373–378.
15. Raife TJ, Olsen JD, Lentz SR. Platelet antibody testing in idiopathic thrombocytopenic purpura.
Blood 1997; 89: 112–113.
16. Sikorska A, Maślanka K. Wykrywanie przeciwciał płytkowych u chorych z małopłytkowoscia samoistną. Acta Haematol.Pol. 2002; 33: 481–487.
17. Souberbielle B.E. Is immune thrombocytopenic purpura (ITP.) due to natural antibodies specific
to platelets?. Eur. J.Haematol. 1996; 56: 178–180.
18. Stockelberg D, Kutti D, Wadeenvik H. Antibodies against platelet GPIb/IX, GPIIb/IIIa, and other
platelet antigens in chronic idiopathic thrombocytopenic purpura. Eur J Haematol 1995; 55: 307–314.
Praca wpłynęła do Redakcji 10.11.2005 r. i została zakwalifikowana do druku 4.04.2006 r.
Adres Autorów:
Instytut Hematologii i Transfuzjologii
ul. Chocimska 5
00-957 Warszawa
tel. (022) 849 36 51
e-mail: [email protected]