Ćwiczenie 7 - Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej

Inżynieria genetyczna 2016/17
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej
Ćwiczenie 7.
Oczyszczanie plazmidu po linearyzacji
1. Do mieszaniny reakcyjnej zawierającej wektor (……. μl) dodać wody do uzyskania łącznie
100 μl (100 μl = 1 objętość), następnie dodać 1 objętość mieszaniny fenol : chloroform : alkohol
izoamylowy (50:49:1).
2. Dokładnie zamknąć probówkę i intensywnie zworteksować lub wytrząsać ręcznie (ok. 30 sek.)
aż do uzyskania mlecznobiałej zawiesiny.
3. Wirować próbkę 13.000 obr./min przez 3 min.
4. Pipetą o pojemności 100 μl ostrożnie pobrać nadsącz – górną warstwę i przenieść go do nowej
probówki.
5. Ponownie oszacować objętość i dodać 2,5 objętości zimnego etanolu 96% oraz 1/20 objętości
3M octanu sodu.
6. Wymieszać delikatnie przez odwracanie probówki i zamrażać -20ºC przez co najmniej 1 godz.
7. Próbkę wirować 13.000 obr./min przez 20 min w 4°C. DNA powinno być widoczne jako
białawy osad na dnie probówki. Ostrożnie, jednym ruchem zlać nadsącz (obserwować, czy nie
zgubiło się osadu!).
8. Osad przemyć 2 objętościami etanolu 70%, zwirować 13.000 obr./min przez 5 min. Jednym
ruchem zlać supernatant (obserwować, czy nie zgubiło się osadu!).
9. Probówki suszyć (odwrócone do góry dnem) w temp. pokojowej przez 10-15 min.
10. Rozpuścić osad w 10 μl buforu TE (Tris/EDTA) (Pełne rozpuszczenie DNA wymaga czasu,
zaleca się wykonanie pomiaru stężenia po 24h od wytrącenia DNA).
Konstrukcja T-vectora
Przygotować reakcję zgodnie z podanym niżej protokołem:
odczynnik
DNA plazmidowe
bufor polimerazy Taq [10x]
stężenie końcowe
ok. 2 µg
1x
MgCl2 [25 mM]
2,5 mM
dTTP [100 mM]
2 mM
polimeraza Taq [5 U/µl]
objętość
5U
woda
RAZEM
2. Inkubować w termocyklerze w temperaturze 72°C przez 2 godz.
3. Po zakończeniu inkubacji reakcję zamrozić w -20°C.
20 µl
Inżynieria genetyczna 2016/17
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej
Ocena stężenia DNA metodą płytek agarozowych
1. Przygotowanie płytek:
a. Odważyć 80 mg agarozy i rozpuścić w 10 ml 1 x buforze TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM
EDTA).
b. Po ochłodzeniu roztworu dodać 0,5 µl barwnika GelRed.
c. Wymieszać. Wylać na płytkę Petriego o średnicy 60 mm.
d. Pozostawić do wyschnięcia. Tak przygotowane płytki mogą być przechowywane w 4°C
przez kilka miesięcy.
2. Przygotowanie standardów:
a. Sporządzić szereg rozcieńczeń DNA faga λ (wyjściowe stężenie wynosi 300 ng/µl),
objętość standardów 20 µl:
100 ng/µl (…… wody + …… DNA faga λ);
75 ng/µl (…… wody + …… DNA faga λ);
50 ng/µl (…… wody + …… DNA faga λ);
25 ng/µl (…… wody + …… DNA faga λ);
10 ng/µl (…… wody + …… DNA faga λ);
5 ng/µl (…… wody + …… DNA faga λ).
b. Mieszaniny krótko zwortexować i zwirować.
3. Ocena stężenia DNA:
a. Na spodniej stronie płytki agarozowej zaznaczyć kropkami miejsca nanoszenia prób
(standardów i prób o nieznanym stężeniu), pamiętając o zachowaniu około
centymetrowych odległości.
b. Ostrożnie nanieść po 0,5 µl każdej z prób (standardów i badanych): wypuścić kroplę
z pipety, a następnie obniżać, by dotknęła powierzchni agarozy. Nie dotykać końcówką
powierzchni żelu!
c. Pozostawić próbki w temperaturze pokojowej na ok. 10-15 min., aby wniknęły w żel.
d. Z wykorzystaniem transiluminatora, ocenić stężenie DNA w badanych próbkach
poprzez porównanie intensywności fluorescencji z naniesionymi standardami.
Stężenie plazmidu po oczyszczeniu wynosi: ……………………
Stężenie produktu PCR po oczyszczeniu wynosi: ……………………
Zagadnienia:
1. Budowa wektorów plazmidowych.
2. Izolacja kwasów nukleinowych.
Literatura:
1. Turner P.C, McLennan A.G, Bates A.D, White M.R.H. Biologia molekularna. Krótkie wykłady.
Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2011.
2. Bednarek I.: Inżynieria genetyczna i terapia genowa. Zagadnienia podstawowe i aspekty
praktyczne.
3. Słomski R. Analiza DNA teoria i praktyka. Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego
w Poznaniu, Poznań 2008.