genetyka bakterii - Uniwersytet Warszawski

GENETYKA BAKTERII
Materiały do ćwiczeń
Przygotowane przez zespół pracowników
Zakładu Genetyki Bakterii
Zakład Genetyki Bakterii
Instytut Mikrobiologii
Wydział Biologii
Uniwersytet Warszawski
2008
1
SPIS TREŚCI
Ćwiczenie 1 Badanie własności fenotypowych różnych rodzajów mutantów
bakteryjnych
1
Ćwiczenie 2 Koniugacja
4
Ćwiczenie 3 Rola białek RecA i RecBC w rekombinacji i reperacji DNA
9
Ćwiczenie 4 Transdukacja ogólna przy użyciu faga P1
12
Ćwiczenie 5 Mutageneza transpozonowa
15
Ilustracje
18
Podłoża
22
Metody
23
Mini liza alkaliczna
23
Elektroforeza DNA w żelu agarozowym
24
Transformacja metodą rubidowo-wapniową
24
Przygotowanie zawiesiny faga P1 do transdukcji
25
Mianowanie lizatu fagowego
26
Transdukcja
26
2
Ćwiczenie 1.
Badanie własności
bakteryjnych
fenotypowych
różnych
rodzajów
mutantów
Powodzenie każdego eksperymentu genetycznego uwarunkowane jest użyciem szczepów
bakteryjnych charakteryzujących się właściwym i dokładnie określonym fenotypem.
W przypadku fenotypu mutantów polimerazowych (np. w genach polA i dnaE ) ze
względu na różne zapotrzebowanie białek polimeryzacyjnych, których te mutacje dotyczą
(funkcjonalna polimeraza III wymagana jest bezwzględnie w każdych warunkach, natomiast
funkcja polimerazy I może być przejęta przez inne białko/a), można określić, czy są to
mutanty obligatoryjne czy fakultatywne (temperaturowrażliwe), poprzez badanie ich
zdolności do wzrostu w warunkach restrykcyjnych (42oC). Polimeraza I, inaczej niż
polimeraza III, obok udziału w procesie replikacji chromosomu bakteryjnego pełni kluczową
rolę w innych procesach komórkowych, jak rekombinacja i reperacja DNA. Zdolność
szczepów bakteryjnych do naprawy uszkodzeń DNA można określić poprzez badanie wzrostu
w obecności czynnika uszkadzającego DNA (np. MMS) i to pozwala na określenie i
zróżnicowanie fenotypu mutantów polimerazowych defetywnych w genach polA i polC.
Fenotyp mutantów defektywnych w inicjacji replikacji (dnaA) i elongacji łańcucha
DNA (dnaB) określa się poprzez badanie zdolności do replikacji chromosomu, a pośrednio
zdolności do wzrostu w warunkach restrykcyjnych (42oC). Inaktywacja białek inicjacyjnych
(np. DnaA) koniecznych do wytworzenia nowych widełek replikacyjnych w miejscu origin,
hamuje replikację z opóźnieniem, natomiast inaktywacja białek elongacyjnych prowadzi do
natychmiastowego zahamowania procesu replikacji. Do drugiej grupy białek należy helikaza
DnaB, chociaż należy pamiętać, że jest ona istotna również na etapie inicjacji.
Zaobserwowanie zróżnicowania tempa zahamowania replikacji DNA w warunkach
restrykcyjnych (42oC) w obu typach mutanatów możliwe jest po wykonaniu eksperymentu
określającego włączanie radioaktywnej zasady azotowej, np. tyminy. Śledzenie wzrostu
poprzez wyznaczenie krzywej wzrostu w temperaturze permisyjnej (36oC) i restrykcyjnej
(42oC) i ich porównanie daje zróżnicowanie fenotypów mutantów w genach dnaA i dnaB, w
wyniku pochodnego efektu wpływu temperatury na replikację DNA. Określenie zdolności do
wzrostu mutantów defektywnych w genach dnaA i dnaB w temperaturze 36oC i 42oC pozwala
jedynie stwierdzić, że oba te mutanty są mutantami fakultatywnymi, gdyż funkcjonowanie
białek DnaA i DnaB jest bezwzględnie wymagane w procesie replikacji.
Istnieją pewne rodzaje mutantów szczególnie często stosowanych w badaniach
genetycznych ze względu na możliwość selekcji biorcy po zajściu transferu materiału
genetycznego. Należą do nich: mutanty żywieniowe (auksotroficzne), mutanty
opornościowe (np. na antybiotyki lub fagi) oraz mutanty kataboliczne, które utraciły
zdolność do rozkładu określonych związków organicznych. Fenotyp tych grup mutantów
sprawdza się, stosując różne typy podłoży minimalnych, różnicujących, wybiórczych.
Celem ćwiczenia jest: badanie fenotypu wymienionych wyżej rodzajów mutantów.
Zadanie I. Mutanty polimerazowe w genach polA i dnaE
Szczepy:
E. coli W3110 polA
E. coli dziki typ
E. coli dnaE48 mutant polC
Podłoża
Podłoże LB i LA
3
Wykonanie:
1) Nocne hodowle szczepów w LB rozcieńczyć 1:20 świeżym podłożem i inkubować około 2
godz. w wytrząsarce w 37oC.
2) Do rozpuszczonego i schłodzonego podłoża LA dodać sulfonian metanometylowy (MMS)
w ilości 40 μl na 200 ml podłoża. Wymieszać, rozlać na płytki.
3) Przygotować płytki z podłożem LA bez MMS.
4) Płytki podzielić na 3 sektory - na każdy sektor wysiać jeden szczep. Należy wysiać
szczepy na 2 płytki LA z MMS i 2 płytki LA. Po jednej płytce z każdego rodzaju wstawić
do inkubacji w 30-37oC i w 42oC przez 24 godz.
5) Sprawdzić, gdzie wystąpił wzrost bakterii. Zinterpretować wyniki.
Zadanie II. Mutanty defektywne w inicjacji i elongacji łańcucha DNA (w genach dnaA i
dnaB)
Szczepy:
E. coli CRT83 dnaA
E. coli CRT266 dnaB
Podłoża i roztwory
LB (uzupełnione tyminą)
płyn fizjologiczny (RF)
Wykonanie:
1) Z pojedynczej kolonii badanego szczepu na agarze odżywczym sporządzić zawiesinę
bakterii w około 2 ml płynu fizjologicznego.
2) Kroplę każdej zawiesiny dodać do 2 probówek z 5 ml podłoża LB.
3) Po posianiu zawiesiny, jedną probówkę inkubować w temp. 30-37oC, a drugą w 42oC.
4) Po 24 godz inkubacji obserwować wzrost w postaci zmętnienia.
Zadanie III. Mutanty auksotroficzne, defektywne w wykorzystywaniu różnych źródeł
węgla i opornościowe
Szczepy:
E. coli HfrC - prototrof
E. coli AB1157 thr leu ara pro lac T6r gal λs his xyl mtl arg thi Strr
Podłoża i roztwory
podłoże minimalne płynne Davisa
agar odżywczy
EMB
r-ry aminokwasów: treoniny, leucyny, proliny, histydyny, argininy (1mg/ml)
r-r tiaminy (0,1 mg/ml)
r-r streptomycyny (5 mg/ml)
r-r chlorku tetrazoliowego (5 mg/ml)
r-r laktozy 20%)
Przygotowane roztwory dodaje się w ilości 1 ml na 100 ml podłoża.
Przygotowanie podłoży:
1) Minimalne płynne Davisa:
do 150 ml jałowej wody destylowanej dodać 40 ml soli Davisa i 4 ml 20% glukozy.
Wymieszać. Rozlać do probówek po 5 ml.
4
2) Agar odżywczy ze streptomycyną:
do kolby zawierającej 200 ml agaru odżywczego dodać roztwór streptomycyny do
końcowego stężenia 50 μg/ml. Rozlać na płytki.
3) Agar odżywczy z tetrazolem:
do 200 ml upłynnionego agaru odżywczego dodać roztwór chlorku tetrazoliowego do
końcowego stężenia 50 μg/ml oraz 10 ml 20% laktozy. Wymieszać, rozlać na płytki.
4) Podłoże EMB z laktozą:
do 200 ml rozpuszczonego podłoża dodać po 2 ml roztworu barwników (eozyna i błękit
metylenowy) oraz 10 ml 20% laktozy. Wymieszać, rozlać na płytki.
Wykonanie:
Z pojedynczej kolonii danego szczepu na agarze odżywczym sporządzić zawiesinę bakterii w
płynie fizjologicznym (około 2 ml).
1) Sprawdzenie wymagań pokarmowych szczepów:
Do probówek zawierających po 5 ml podłoża Davisa dodać po 0,1 ml potrzebnych do
wzrostu czynników (wg schematu podanego przez prowadzącego ćwiczenia). Do każdej
probówki dodać następnie po kropli zawiesiny badanego szczepu. Inkubować przez 24
godz. w 37oC.
2) Sprawdzenie wrażliwości na streptomycynę:
Na płytkę zawierającą agar odżywczy ze streptomycyną wysiać rysą badany szczep.
Inkubować w 37oC przez 24 godz.
3) Badanie zdolności szczepu do fermentowania laktozy:
a) na płytkę agaru odżywczego z laktozą i tetrazolem wysiać badany szczep metodą
posiewu redukcyjnego. Inkubować 24 godz. w 37oC. Kolonie zdolne do fermentowania
laktozy są białe; zabarwienie czerwone świadczy o braku zdolności do fermentacji tego
cukru.
b) na płytkę podłoża EMB z laktozą wysiać badany szczep metodą posiewu
redukcyjnego. Inkubować 24 godz. w 37oC. Kolor bladoróżowy kolonii świadczy o
braku zdolności do fermentowania cukru, kolor bordowo-granatowy o zdolności do
fermentacji.
4) Sprawdzenie wrażliwości na fagi:
Na powierzchnię agaru odżywczego nanieść grubą rysą (przy pomocy pipety) zawiesinę
faga. Po wsiąknięciu zawiesiny faga wysiać badany szczep rysami prostopadłymi
prowadzonymi w jednym kierunku. Po 24 godz. inkubacji w 37oC obserwować, czy
wystąpiła liza bakterii.
Po odczytaniu wyników na wszystkich podłożach porównać własności fenotypowe badanych
szczepów z ich genotypem podanym w opisie szczepu.
5
Ćwiczenie 2
Koniugacja
Koniugacja to bardzo wyspecjalizowany proces, podczas którego przekazywanie DNA z
komórki dawcy do biorcy wymaga bezpośredniego kontaktu komórek - partnerów
koniugacyjnych. Bakteryjne systemy koniugacyjne uwarunkowane są obecnością w
komórkach dawców plazmidów koniugacyjnych. Prototypem takiego plazmidu,
rezydującego w komórkach E. coli, jest plazmid F (rys. 1), który może występować w formie
autonomicznej (komórki typu F+) lub w formie zintegrowanej z chromosomem (komórki typu
Hfr). Te ostatnie charakteryzują się dużą częstością przekazywania markerów
chromosomowych i z tego właśnie powodu były wykorzystywane do sporządzania map
genetycznych chromosomów. Znanych jest bardzo wiele szczepów Hfr, w których określone
są miejsca integracji plazmidu F z chromosomem oraz punkt początkowy i kierunek
przekazywania materiału genetycznego do komórki biorcy (rys. 3).
Celem ćwiczenia jest:
1) otrzymywanie dawcy o wysokiej częstości przekazywania chromosomu (Hfr);
2) określenie czasu wejścia markerów dawcy do komórki biorcy podczas koniugacji
przerywanej, co daje informację o wzajemnym położeniu i odległości między genami
(wyrażonej w minutach);
3) mapowanie chromosomu bakteryjnego metodą analizy sprzężeń;
4) zapoznanie się z różnymi typami i metodami koniugacji.
Zadanie I. Otrzymywanie dawcy o wysokiej częstości przekazywania chromosomu (Hfr)
metodą koniugacji kroplowej na podłożu stałym
Przed eksperymentem koniugacyjnym celowe jest wyprowadzenie czystej hodowli szczepu
Hfr, który ma w pełni funkcjonalny system transferu materiału genetycznego, a więc daje
wysoką częstość uzyskiwania rekombinatów. Wykonuje się to przy pomocy prostego testu z
zastosowaniem koniugacji kroplowej na podłożu stałym.
Szczepy
Dawca - Escherichia coli HfrC
Biorca – E.coli AB1157
Podłoża
podłoże selekcyjne Davisa płynne i stałe,
(z odpowiednimi uzupełnieniami)
agar odżywczy
płyn fizjologiczny (RF)
Wykonanie:
a) Szczep Escherichia coli HfrC rozsiać na pojedyncze kolonie na agarze odżywczym.
b) Z czterech kolonii HfrC oraz hodowli szczepu AB1157 założyć nocne hodowle w
odpowiednio wzbogaconym podłożu Davisa.
c) Przygotować płytki z podłożem selekcyjnym dla rekombinantów Pro+Strr (na bazie podłoża
Davisa).
d) Odwirować 2ml nocnej hodowli biorcy AB1157 i zawiesić w takiej samej objętości RF.
e) Na płytkę z podłożem selekcyjnym wysiać 0,1 ml nierozcieńczonej zawiesiny biorcy
AB1157 i rozprowadzić głaszczką po powierzchni podłoża.
f) Na powierzchnię płytki z wysianym biorcą nanieść krople (po 50 μl) nierozcieńczonych
hodowli dawcy (uzyskane z pojedynczych kolonii) – poczekać, aż płyn wsiąknie a
następnie wstawić do inkubacji w 37oC na 48 godz.
6
g) Ocenić liczbę powstałych rekombinantów w poszczególnych próbach. Wybrać klon dawcy
dający najwyższą liczbę rekombinantów.
h) Wybrany klon dawcy zastosować do dalszych eksperymentów.
Zadanie II. Określenie czasu wejścia markerów dawcy do komórki biorcy metodą
koniugacji przerywanej
Szczepy:
E. coli HfrC - prototrof Strs
E. coli AB1157 F- thr leu ara proA lac T6r gal λs his xyl mtl argE thi Strr
Podłoża i roztwory:
minimalne Davisa - płynne i stałe
agar odżywczy
roztwory: aminokwasów, hydrolizatu kazeiny, tiaminy, streptomycyny
płyn fizjologiczny
Wykonanie:
1) Nocne hodowle szczepów w odpowiednio uzupełnionym podłożu Davisa (wymagane
czynniki wzrostowe i hydrolizat kazeiny) rozcieńczyć 1:20 świeżym podłożem i
inkubować
z wytrząsaniem w 37oC do uzyskania hodowli w fazie wzrostu
logarytmicznego (około 2 godz).
2) Przygotować:
- odpowiednią liczbę probówek zawierających po 4,5 ml podłoża Davisa (bez
glukozy) ze streptomycyną w stężeniu 1 mg/ml,
- płytki z agarem odżywczym,
- płytki z podłożem selekcyjnym dla rekombinantów Pro+Strr, Thr+Leu+Strr i
Arg+Strr,
- odpowiednią ilość probówek zawierających po 4,5 ml płynu fizjologicznego do
rozcieńczania.
3) W celu określenia ilości komórek dawcy w hodowli logarytmicznej wysiać rozcieńczenia
10-5 i 10-6 hodowli na agar odżywczy. Wstawić płytki do inkubacji na 24 godz. w 37o C.
4) Koniugacja - zmieszać 1 ml logarytmicznej hodowli dawcy z 9 ml logarytmicznej hodowli
biorcy. Inkubować w 37o C przez 60 min.
5) Bezpośrednio po zmieszaniu (czas 0), a następnie w czasach wskazanych w tabeli,
pobierać
0,5 ml próbki mieszaniny koniugacyjnej i przenosić je do probówek
zawierających podłoże Davisa ze streptomycyną (będzie to rozcieńczenie 10-1 mieszaniny
koniugacyjnej).
Wytrząsnąć na worteksie i wysiać na podłoża selekcyjne (każde
rozcieńczenie w 2 powtórzeniach). Inkubować w 37oC przez 48 godz.
6) Policzyć kolonie poszczególnych typów rekombinantów i szczepu dawcy. Podać liczbę
kolonii na płytkach, liczbę bakterii w 1 ml i częstość rekombinacji dla każdego markera.
Sporządzić wykres liczby selekcjonowanych typów rekombinantów w zależności od czasu
trwania koniugacji. Określić czas wejścia markerów do komórki biorcy.
7) Sprawdzić rewersję poszczególnych markerów biorcy przez wysiew nierozcieńczonych
hodowli logarytmicznych na wszystkie rodzaje płytek selekcyjnych.
7
Selekcja
rekombinantów
Czas pobierania próbek mieszaniny koniugacyjnej [min] i rozcieńczenia
wysiewane na podłoża selekcyjne:
0
5
10
15
Pro+Strr
10-1
10-1
10-1
10-2
Tre+ Leu+Strr
10-1
10-1
10-1
Arg+Strr
10-1
10-1
10-1
20
30
40
50
60
10-2
10-2
10-3
10-3
10-1
10-2
10-2
10-2
10-3
10-2
10-3
10-1
10-1
10-1
10-1
10-2
10-3
10-1
10-2
10-2
Zadanie III. Mapowanie chromosomu bakteryjnego metodą analizy sprzężeń
Należy sprawdzić zdolność rekombinantów Pro+Strr (pro - marker proksymalny), uzyskanych
po 60-minutowej koniugacji HfrC i F-AB1157, do syntezy innych aminokwasów,
kodowanych przez geny dystalne w stosunku do genu pro. Liczbę rekombinantów Pro+Strr,
które są równocześnie Thr+Leu+ lub Arg+ lub His+ można określić, stosując metodę replik, co
pozwoli na przeprowadzenie tzw. analizy sprzężeń.
Podłoża
Minimalne Davisa
Uzupełnienia podłoży jak w Zadaniu II.
Wykonanie:
1) Przygotować płytki z podłożami selekcyjnymi dla rekombinantów:
a) Thr+Leu+
c) His+
+
b) Arg
d) Pro+
2) Materiał z kolonii rekombinantów Pro+Strr przenieść metodą replik (przy pomocy jałowych
wykałaczek) na płytki z przygotowanymi podłożami selekcyjnymi.
3) Po inkubacji (48 godz. w 37oC) określić procent rekombinantów Pro+Strr, które są
równocześnie:
(i) Thr+Leu+
(ii) Arg+
(iii) His+.
4) Na podstawie procentu sprzężenia z markerem proksymalnym określić ułożenie
pozostałych markerów w stosunku do oriT.
Zadanie IV. Metody koniugacji na podłożu stałym
Koniugacja na podłożu stałym (kroplowa) stosowana jest do szybkiej, szacunkowej oceny
wydajności tworzonych rekombinantów, w przypadku przekazywania cech chromosomowych
jak też częstości powstawania transkoniugantów – w przypadku przekazywania plazmidów.
Metody koniugacji na podłożu stałym pozwalają ponadto na zwiększenie częstości
uzyskiwanych rekombinantów w wyniku bardziej stabilnego kontaktu komórek
koniugujących i z tego względu stosuje się je w przypadkach spodziewanej niskiej
wydajności koniugacji oraz w przypadkach użycia dawcy niosącego plazmid
niekoniugacyjny.
8
A. Koniugacja międzygatunkowa
Szczepy:
dawca: E. coli ECF270(pFL129) Cmr Tcr
biorcy: a) E. coli MC1061 Rifr
b) Klebsiella pneumoniae Rifr
Podłoża i roztwory:
podłoże LB płynne
agar odżywczy
płyn fizjologiczny
r-ry: tetracykliny , ryfampicyny
Wykonanie
a) Przygotować nocną hodowlę szczepu dawcy w podłożu LB z chloramfenikolem (20 μg/ml)
lub tetracykliną (20 μg/ml) oraz hodowle biorców w podłożu LB bez antybiotyków.
Inkubować w 37oC z wytrząsaniem.
b) Doprowadzić gęstości wszystkich hodowli do tej samej wartości.
c) Hodowlę dawcy odwirować i osad zawiesić w podłożu LB bez antybiotyku.
d) Zmieszać hodowlę dawcy z każdym z biorców w stosunku 1:1 (100 μl + 100 μl) w
probówkach Eppendorfa i odwirować (3-5 min).
e) Po dokładnym wylaniu supernatantu, osad w każdej probówce zawiesić w 25 μl LB.
f) Nanieść 20 μl mieszaniny koniugacyjnej na jałowy filtr nitrocelulozowy umieszczony na
powierzchni agaru odżywczego. Inkubować 2 godz w 37oC.
g) Każdy filtr umieścić w probówce Eppendorfa (używając opalonej pensety), zalać 200 μl
LB i wytrząsnąć tak, aby zmyć bakterie z filtra (to już jest rozcieńczenie 10-1).
h) Mieszaniny koniugacyjne rozcieńczyć do 10-2 (50 μl mieszaniny do 450 μl RF), wysiać
rozc. 10-1 i 10-2 (po 2 płytki z każdego) na podłoża selekcyjne:
- agar odżywczy z tetracykliną (20 μg/ml) i ryfampicyną (50 μg/ml) – dla biorcy E. coli
- agar odżywczy z tetracykliną (5 μg/ml) i ryfampicyną (50 μg/ml) – dla biorcy
Klebsiella
pneumoniae.
i) Inkubować w 37oC przez 24 godz lub dłużej. Porównać liczbę transkoniugantów
uzyskanych w obu krzyżówkach.
B. Koniugacja trójrodzicielska
Szczepy:
dawca D1: E. coli DH5α (pRK2013) Kmr
dawca D2: E. coli TG1 (pRK404) Tcr
biorca: E. coli MC1061 Rifr
Podłoża i roztwory:
podłoże LB płynne i stałe
r-ry: kanamycyny, tetracykliny, ryfampicyny
Wykonanie:
a) Przygotować nocne hodowle szczepów: (i) MC1061 w podłożu LB, (ii) DH5α w LB z
kanamycyną (50 μg/ml), (iii) TG1 w LB z tetracykliną (20 μg/ml).
b) Nocne hodowle dawców odwirować (po 1,5 ml), przemyć podłożem LB bez antybiotyków,
ponownie odwirować i zawiesić w tej samej objętości podłoża.
c) Zmieszać w probówce Eppendorfa hodowle rodzicielskie w proporcjach:
DH5α (100μl) + TG1 (100 μl) +MC1061 (200 μl)
d) Wysiać na płytkę z podłożem LB 100 μl tak przygotowanej mieszaniny – lekko
rozprowadzając ją na środku płytki.
e) Przygotować równocześnie kontrolę przez zmieszanie szczepów:
TG1 (100 μl) + MC1061 (200 μl) + LB (100 μl)
9
i wysiać 100 μl tej mieszaniny na płytkę z podłożem LB (jak wyżej).
f) Płytki inkubować w 37oC przez 2 godziny.
g) Każdą płytkę z mieszaniną koniugacyjną spłukać 1 ml RF, zebrać pipetą do probówki
Eppendorfa (to już jest rozcieńczenie 10-1) i rozcieńczyć do 10-3.
h) Wysiać mieszaninę koniugacyjną na:
- podłoże selekcyjne: agar odżywczy z tetracykliną (20 μg/ml) i ryfampicyną (50 μg/ml),
rozcieńczenia 10-1, 10-2 i 10-3 (po 2 powtórzenia);
- agar odżywczy z ryfampicyną (50 μg/ml) rozcieńczenia 10-5, 10-6 (w celu określenia
ilości biorcy w tej mieszaninie).
i) Wysiać mieszaninę kontrolną (rozcieńczenie 10-1) na podłoże selekcyjne - agar odżywczy
z tetracykliną (20 μg/ml) i ryfampicyną (50 μg/ml).
j) Po 24-godz. inkubacji w 37oC określić liczbę kolonii na wszystkich płytkach. Obliczyć, jaki
procent komórek biorcy uzyskało plazmid.
10
Ćwiczenie 3
Rola białek RecA i RecBC w rekombinacji i reperacji DNA
Rekombinacja homologiczna to proces, w którym następuje przerwanie ciągłości jednej lub
obu nici cząsteczki DNA i połączenie z jedno- lub dwuniciowym fragmentem innej
cząsteczki, co uwarunkowane jest homologią sekwencji między rekombinującymi partnerami.
Rekombinacja homologiczna, mimo że jest procesem wieloetapowym i mającym kilka
różnych dróg, zawsze, bezwzględnie wymaga aktywności białka RecA wykazującego liczne
aktywności enzymatyczne. Oprócz kluczowej roli w rekombinacji, białko to istotne jest dla
reperacji DNA, a konkretnie w tzw. naprawie rekombinacyjnej szczególnie ważnej w
usuwaniu uszkodzeń powodowanych światłem UV i promieniami X. RecA jest również
pozytywnym regulatorem (ze względu na swą aktywność koproteazy) globalnego systemu
napraw SOS.
Białko RecBC bierze udział w jednym ze szlaków rekombinacji E. coli, tzw. szlaku
RecBCD, który uczestniczy w rekombinacji pokoniugacyjnej. Mutanty recBC mają obniżoną
częstość rekombinacji, jakkolwiek efekt nie jest tak dramatyczny, jak w przypadku mutantów
recA, a poza tym może być supresowany przez mutacje w genie sbcB, kodującym
egzonukleazę I. Supresja jest pośrednia i polega na odblokowaniu innego szlaku
rekombinacyjnego - RecF. Podobnie jak RecA, RecBC bierze udział w reperacji uszkodzeń w
DNA.
Celem ćwiczenia jest zbadanie:
1) wpływu białek RecA i RecBC na rekombinację - przez określenie częstości rekombinacji
pokoniugacyjnej w krzyżówkach z różnymi mutantami,
2) zaangażowania tych białek w procesie reperacji - przez określenie przeżywalności
mutantów poddanych działaniu czynników uszkadzających DNA.
Zadanie I. Rola białka RecA w rekombinacji
Szczepy:
E. coli HfrC - prototrof Strs
E. coli F- CSH51 - pro Strr
E. coli F- CSH52 - pro recA Strr
Podłoża i roztwory:
minimalne Davisa - płynne i stałe
bulion odżywczy i agar odżywczy
roztwór streptomycyny (5 mg/ml)
płyn fizjologiczny
Wykonanie:
1) Nocne hodowle badanych szczepów rozcieńczyć 1:20 świeżym podłożem Davisa z
hydrolizatem kazeiny i hodować z wytrząsaniem w 37oC przez 2 - 3 godz. (do osiągnięcia
fazy logarytmicznej).
2) Przygotować dwie mieszaniny koniugacyjne:
a) HfrC x F- CSH51
b) HfrC x F- CSH52
przez zmieszanie hodowli rodzicielskich w stosunku 1:10. Koniugację prowadzić przez 50
minut w 37oC.
3) Mieszaniny koniugacyjne odpowiednio rozcieńczyć i wysiać na płytki z podłożem
selekcyjnym dla rekombinantów Pro+Strr:
a) rozcieńczenie 10-2, 10-3
b) rozcieńczenie 10-1, 10-2
11
Zadanie II. Rola białka RecA w reperacji DNA
1) Nocne hodowle bulionowe szczepów CSH51 i CSH52 wysiać bez rozcieńczania po 0,1ml
na płytki z agarem odżywczym.
Każdy szczep wysiać na 5 płytek.
2) Naświetlać lampą UV po jednej płytce każdego szczepu przez 5, 10, 15 i 20 sekund; jedną
płytkę każdego szczepu pozostawić bez naświetlania.
3) Naświetlone płytki owinąć folią aluminiową (zabezpieczenie przed fotoreaktywacją) i
inkubować przez 24 godz. w 37oC.
4) Porównać liczby kolonii obu szczepów otrzymane na płytkach po różnym czasie
naświetlania.
Zadanie III. Rola białka RecBC w rekombinacji; różne szlaki rekombinacyjne u E. coli
Podłoża i roztwory:
LB
agar odżywczy
roztwór tetracykliny (1,5 mg/ml)
roztwór streptomycyny (5 mg/ml)
płyn fizjologiczny (RF)
Szczepy:
dawca - E.coli SK6033 (HfrH Tcr)
biorcy - E.coli MC1061 (recBC+ Strr)
E.coli SK7883 (recBC-Strr)
E.coli SK7892 (recBC-sbcB- Strr)
Wykonanie:
1) Założyć hodowle szczepów:
- dawcy w podłożu LB z tetracykliną (15 μg/ml )
- biorców w podłożu LB ze streptomycyną (50 μg/ml )
Inkubować przez noc w 37oC.
2) Przygotowanie hodowli logarytmicznych: nocne hodowle rozcieńczyć świeżym podłożem
LB w proporcji 1:50 (np. 0,2 ml do 10 ml podłoża) i inkubować w 37oC z wytrząsaniem
przez 2 - 3 godz. (gęstość hodowli 1 - 5 x108/ml ).
3) Koniugacja: każdy ze szczepów biorcy zmieszać z dawcą w proporcji 10 : 1 (np. 0,9 ml
logarytmicznej hodowli biorcy + 0,1 ml logarytmicznej hodowli dawcy ).
Inkubować bez wytrząsania w 37oC przez 30 min.
4) Selekcja rekombinantów: mieszaninę koniugacyjną silnie wytrząsnąć (worteks),
rozcieńczyć do 10-3 po koniugacji z biorcą recBC+ i recBC-sbcB-, oraz do 10-1 po
koniugacji z biorcą recBC-. Wysiać odpowiednio rozcieńczenia 10-2 i 10-3 lub 10-1 na
podłoże selekcyjne (agar odżywczy ze streptomycyną i tetracykliną).
Inkubować przez 24 godz. w 37oC.
5) Oznaczenie liczby komórek dawcy: hodowlę dawcy użytą do koniugacji rozcieńczyć;
rozcieńczenia 10-5 i 10-6 wysiać na agar odżywczy z tetracykliną. Inkubować 24 godz. w
37oC.
6) Obliczyć i porównać częstości rekombinacji w analizowanych układach koniugacyjnych.
Zadanie IV. Rola białka RecBC w reperacji DNA
Szczepy:
E.coli recBC+ Cmr
E.coli recBC- Cmr
E.coli recBC-sbcB- Cmr
Podłoża:
LA
LA z MMS
12
Wykonanie:
1) Szczepy biorców używane w koniugacji wysiać rysą na podłoże:
a) LA;
b) LA + MMS (40 μl/200 ml podłoża).
2) Płytki inkubować w 37oC przez 24 godz.
3) Określić wrażliwość badanych szczepów na czynnik uszkadzający DNA.
13
Ćwiczenie 4
Transdukacja ogólna przy użyciu faga P1
Horyzontalny transfer genów u prokariotów może odbywać się w wyniku bezpośredniego
pobierania DNA ze środowiska (transformacja) lub za pośrednictwem ruchomych elementów
genetycznych, takich jak plazmidy i transpozony koniugacyjne (koniugacja) lub bakteriofagi
(transdukcja).
W transdukcji materiał genetyczny dawcy przenoszony jest do biorcy w kapsydzie
fagowym. Cząstki fagowe niosące w kapsydzie obcy materiał genetyczny nazywamy
cząstkami transdukującymi. Mogą one zawierać DNA fagowy połączony kowalencyjnie z
DNA gospodarza (dzieje się tak w wypadku transdukcji specyficznej) lub wyłącznie materiał
genetyczny gospodarza (transdukcja ogólna).
Do transdukcji specyficznej dochodzi w przypadku fagów, które w czasie szlaku
lizogennego wbudowują swój genom w ściśle określone miejsce chromosomu gospodarza
(np. fag λ E. coli). Z chwilą wejścia faga w szlak lityczny, z niewielką częstością, może zajść
nieprawidlowe wycięcie profaga, w związku z czym powstaje hybrydowy DNA zawierający
sekwencje profagowe z odcinkiem chromosomu znajdującym się po jednej bądź drugiej
stronie genomu profaga. Tak więc w tym przypadku tylko ściśle określone geny gospodarza
mogą by przenoszone przez cząstki transdukujące (dla λ są to geny gal lub bio).
W transdukcji ogólnej uczestniczą cząstki transdukujące zawierające wyłącznie
materiał genetyczny gospodarza. Powstają one w wyniku błędnego pakowania materiału
genetycznego bakterii do główek fagowych w trakcie litycznego rozwoju faga. W przypadku
takich fagów jak P1 (infekujący E. coli) teoretycznie każdy kawałek DNA, o odpowiedniej
wielkości, może być przeniesiony w kapsydzie wirusa. Ze względu na mechanizm tworzenia
cząstek transdukujących, praktycznie z równym prawdopodobieństwem, przeniesieniu może
ulec każdy gen (dlatego proces ten nosi nazwę transdukcji ogólnej). Odcinek DNA
gospodarza przenoszony w cząstkach transdukujących jest wielkością zbliżony do genomu
fagowego. Na przykład genom P1 zawarty w główce fagowej liczy 100 kpz (co stanowi
ponad 2% genomu E. coli) i tej wielkości fragmenty DNA są przenoszone w procesie
transdukcji z jednego szczepu E. coli do innego. Przenoszony może być zarówno DNA
chromosomowy jak i plazmidowy, jednak aby powstały stabilne transduktanty, w pierwszym
przypadku musi dojść do wbudowania, w wyniku rekombinacji homologicznej, materiału do
genomu biorcy, natomiast w drugim przypadku musi zostać odtworzony funkcjonalny
replikon (oczywiście powinien on być zdolny do autonomicznej replikacji w nowym
gospodarzu).
Transdukcja ogólna była kiedyś wykorzystywana do mapowania blisko położonych
genów (prawdopodobieństwo jednoczesnego przeniesienia dwu lub większej liczby genów
zależy od ich odległości od siebie) oraz do konstrukcji szczepów bakterii o określonych
cechach.
Koniugacja, transdukcja i transformacja to procesy odgrywające ważną rolę w
ewolucji prokariotów, bowiem w czasie pojedynczego wydarzenia organizmy te mogą
uzyskać nowe cechy, przystosowujące je do zmieniającego się środowiska.
Celem ćwiczenia jest:
1) wykazanie, że w procesie transdukcji mogą być przenoszone:
a) geny chromosomowe,
b) genom plazmidowy.
2) zbadanie wpływu fenotypu szczepu biorcy (Rec+ lub Rec-) na wynik przekazywania genów
chromosomowych i plazmidowych.
14
Cały eksperyment transdukcji składa się z kilku etapów:
1) Otrzymanie lizatu fagowego o odpowiednio dużym mianie faga i możliwie dużej
zawartości cząstek transdukujących poprzez przeprowadzanie co najmniej 2 cykli namnażania
faga P1 na odpowiednim szczepie dawcy DNA (wrażliwym na P1 i niosącym cechę, którą
chcemy przenieść).
2) Zainfekowanie lizatem fagowym odpowiedniego szczepu biorcy. Zawartość cząstek
transdukujących w tzw. lizacie transdukującym wynosi nie więcej niż 0,3%, pozostałe cząstki
fagowe to funkcjonalne wirulentne fagi. Fakt ten ma swoje implikacje w przebiegu całego
procesu i wymaga spełnienia odpowiednich warunków technicznych, aby uzyskać pozytywny
wynik transdukcji, np. stosowanie niskiej wielokrotności zakażenia (moi = 0,05, ang.
multiplicity of infection), obecności jonów wapnia tylko w etapie adsorpcji.
Dobór szczepu biorcy musi być przeprowadzony z uwzględnieniem kilku ważnych
czynników, w tym:
a) możliwości przeprowadzenia bezpośredniej selekcji odpowiednich transduktantów,
b) lub możliwości uzyskania odpowiedniej klasy transduktantów poprzez wykorzystanie
zjawiska kotransdukcji,
c) zastosowania biorcy o aktywnym systemie rekombinacji ogólnej (RecA+ RecBCD+) w
przypadku transdukcji genów chromosomowych, ponieważ włączenie wprowadzonego
za pośrednictwem faga fragmentu DNA do chromosomu biorcy następuje w wyniku
procesu rekombinacji homologicznej.
3) Selekcja transduktantów na odpowiednich podłożach selekcyjnych;
4) Szczegółowa
analiza
transduktantów
(weryfikacja
fenotypu
oczyszczonych
transduktantów, stwierdzenie występowania kotrandukcji pewych cech).
Zadanie I. Transdukcja genów chromosomowych
Celem eksperymentu jest przeniesienie mutacji recB ze szczepu dawcy Escherichia coli
SK7881 (ΔrecB/Kmr) do dwóch szczepów biorcy:
(i) E. coli MG1693 (RecB+, Kms, thyA),
(ii) E. coli JC5703 ( recC82 Kms).
Szczepy:
SK7881(ΔrecB/Kmr)
MG1693 (RecB+ Kms thyA);
JC5703 (recC82 Kms)
Podłoża i roztwory:
LA
podłoże Davisa stałe
hydrolizat kazeiny (20 %)
roztwór tyminy (1 mg/ml)
roztwór kanamycyny (10 mg/ml)
roztwór chloramfenikolu (50 mg/ml)
roztwory do minilizy alkalicznej
Wykonanie:
Wariant 1 – wykorzystanie szczepu MG1693 (Rec+) jako biorcy
1) Namnożenie faga P1 na szczepie SK7881 (2 pasaże metodą płytek dwuwarstwowych).
2) Oznaczenie miana faga z użyciem E. coli AB1157 jako szczepu wskaźnikowego.
3) Infekcja szczepu MG1693 lizatem fagowym otrzymanym w punkcie „1” i selekcja
transduktantów:
a) Kmr na podłożu LA + Km (50 μg/ml);
15
b) ThyA+
- na podłożu minimalnym Davisa uzupełnionym hydrolizatem kazeiny
(stężenie końcowe 0,2%).
4) Analiza otrzymanych transduktantów metodą replik:
a) transduktanty Kmr (z punktu "3a") replikujemy na podłoża:
- LA zawierające MMS (0,04 %);
- LA zawierające MMS (0,055 %);
- podłoże Davisa + hydrolizat kazeiny (0,2 %).
b) transduktanty Thy+ (z punktu "3b") replikujemy na podłoża:
- LA z kanamycyna;
- LA zawierajace MMS (0,04 %);
- LA zawierające MMS (0,055 %).
5) Zestawienie i omówienie otrzymanych wyników.
Wariant 2. - wykorzystanie szczepu JC5703 (Rec-) jako biorcy
1) Przeprowadzenie infekcji szczepu E. coli JC5703 lizatem transdukującym otrzymanym w
Zadaniu 1. Selekcja transduktantów na podłożu LA z kanamycyną.
2) Porównanie liczby transduktantów Kmr uzyskanych w obu zadaniach.
Zadanie II. Transdukcyjne przenoszenie genomów plazmidowych
Plazmid pWMK3 zawarty w szczepie SK7297 ma wielkość 25 kb. Został skonstruowany
przez sklonowanie fragmentu (o wielkości 19 kb) chromosomu E. coli, niosącego dzikie
allele genów recBCD, w wektorze pochodnym pBR325 (6 kb) w miejsce BamHI. Markerem
selekcyjnym plazmidu pWMK3 jest oporność na chloramfenikol (Cmr).
Szczepy:
E. coli SK7297 (pWMK3) Cmr
E coli SK7881 (ΔrecB/Kmr) Cms
E. coli MG1693 (Rec+KmsthyA) Cms
E. coli AB1157 - szczep wskaźnikowy
Podłoża i roztwory:
LA
roztwór chloramfenikolu (50 mg/ml)
roztwory do minilizy alkalicznej
Wykonanie:
Wariant 1. Przeniesienie plazmidu pWMK3 ze szczepu SK7297 do szczepu MG1693 (Rec+)
Wariant 2. Przeniesienie plazmidu pWMK3 ze szczepu SK7297 do szczepu SK7881 (Rec-).
1) Przygotowanie lizatu transdukującego poprzez namnożenie faga P1 na szczepie SK7297.
2) Oznaczenie miana faga z użyciem szczepu AB1157 jako szczepu wskaźnikowego.
3) Infekcja szczepów MG1693 oraz SK7881 lizatem transdukującym, selekcja
transduktantów Cmr na podłożu LA+ Cm (20 μg/ml).
4) Porównanie liczby transduktantów Cmr uzyskanych dla obu biorców.
5) Potwierdzanie obecności plazmidu pWMK3 w transduktantach Cmr poprzez wykonanie
minilizy z 10 transduktantów i analizę elektroforetyczną preparatów DNA. Jako kontrolę
należy zastosować preparaty DNA uzyskane z minilizy szczepu dawcy (SK7297).
6) Sprawdzenie wrażliwości na MMS transduktantów SK7881 Cmr metodą replik. Ponieważ
plazmid pWMK3 niesie dziki allel genu recB winna nastąpić komplementacja
chromosomowej mutacji recB obecnej w biorcy SK7881, a więc transduktanty powinny
wykazywać fenotyp MMSr.
16
Ćwiczenie 5
Mutageneza transpozonowa
Wykorzystanie transpozonu Tn1000 (transpozonu γδ) do mutagenizacji genu recB
sklonowanego w plazmidzie pBR325
Elementy transpozycyjne (TE, ang. transposable elements) należą do grupy ruchomych
elementów genetycznych, bowiem są one zdolne do zmiany miejsca w genomie, w wyniku
procesu zwanego transpozycją. Transpozycja jest typem rekombinacji nieuprawnionej, która
nie wymaga homologii sekwencji nukleotydowych cząsteczek DNA uczestniczących w tym
procesie i zależy od transpozazy kodowanej przez TE.
Wśród elementów transpozycyjnych wyróżniamy sekwencje insercyjne (IS) i
transpozony (Tn) (rys. 4). Najprostsze IS zawierają jedną otwartą ramkę odczytu, kodującą
transpozazę, otoczoną z obu stron odwróconymi sekwencjami powtórzonymi (IR, ang.
inverted repeats), będącymi miejscami działania tego enzymu. Transpozycja IS może
przebiegać według mechanizmu konserwatywnego bądź replikacyjnego (rys. 6). W
pierwszym przypadku element zmienia jedynie swoje miejsce w genomie - zostaje wycięty z
jednego miejsca i wstawiony w inne. W trakcie transpozycji replikacyjnej IS ulega
powieleniu i powstaje forma pośrednia zwana kointegratem, w której replikony uczestniczące
w transpozycji połączone są kowalencyjnie dwiema kopiami IS, ułożonymi w tej samej
orietacji. Po rozdziale kointegratu, każdy z replikonów zawiera pojedynczą kopię IS.
Transpozony (rys. 4) mają znacznie bardziej skomplikowaną strukturę, bowiem
zwykle niosą geny warunkujące różne cechy fenotypowe. Dzielimy je na transpozony
złożone, charakteryzujące się obecnością na obu końcach sekwencji insercyjnych, które
okalają część centralną, niosącą geny niezwiązane z transpozycją, i transpozony niezłożone,
przypominające budową sekwencje insercyjne, lecz kodujące cechy fenotypowe. Te ostatnie
są zwykle opisywane wraz z sekwencjami insercyjnymi i należą do rodziny Tn3.
Jednym z transpozonów niezłożonych jest transpozon Tn1000 (transpozon γδ), będący
naturalnym składnikiem genomu plazmidu F (rys. 1). Odmiennie od innych członków rodziny
Tn3, nie koduje on żadnych cech fenotypowych. Tn1000 ma wielkość około 6 kb, a jego
sekwencje IR są złożone z 35 par zasad. Charakteryzuje się on wysoką częstością
transpozycji do plazmidów. Miejsce insercji jest przypadkowe, chociaż występują pewne
preferencje do miejsc bogatych w pary AT. Tworzone w trakcie transpozycji kointegraty
odpowiedzialne są za mobilizację chromosomu lub plazmidów niekoniugacyjnych do
transferu koniugacyjnego.
Celem ćwiczenia jest: wykorzystanie transpozonu Tn1000 do inaktywacji genu recB
sklonowanego w plazmidzie pWMK3. Plazmid pWMK3 składa się z wektora typu pBR325,
w którym sklonowany został fragment chromosomu E. coli o wielkości 19 kb, zawierający
geny recBCD (rys. 2)
Eksperyment obejmuje kilka etapów:
1) Wprowadzenie metodą transformacji chemicznej plazmidu (zawierającego gen, który
chcemy zmutować) do szczepu zawierającego plazmid F.
2) Przeprowadzenie koniugacji szczepu zawierającego obydwa plazmidy (F i plazmid
mutagenizowany) ze szczepem biorcy, niosącym w chromosomie defektywną formę
interesującego nas genu oraz dającym możliwość eliminacji z mieszaniny koniugacyjnej
szczepu dawcy.
17
3) Wyselekcjonowanie transkoniugantów, do których został przeniesiony kointegrat obu
plazmidów powstający w czasie transpozycji replikacyjnej Tn1000.
4) Odszukanie wśród transkoniugantów (drogą analizy fenotypu) frakcji klonów, w których
insercja transpozonu Tn1000 spowodowała inaktywację genu poddawanego mutagenezie.
5) Potwierdzenie obecności transpozonu Tn1000 w mutowanym genie poprzez analizę
restrykcyjną badanego plazmidu.
Szczepy:
E. coli W1845 (F+)
E. coli SK7881 (ΔrecB/Kmr)
E. coli 7297(pWMK3)
Podłoża, roztwory i inne
podłoże LB i LA
roztwór chloramfenikolu (50 mg/ml)
roztwory do minilizy
0,8% agaroza
bufor do elektroforezy
roztwory do transformacji
(metodą rubidowo-wapniową)
jałowe wykałaczki
endonukleaza restrykcyjna PstI
Wykonanie:
I etap
1) Przygotować metodą mini-lizy alkalicznej DNA plazmidu pWMK3 ze szczepu SK7297.
2) Otrzymany preparat zanalizować metodą elektroforezy w żelu agarozowym.
3) Przygotować komórki szczepu E. coli W1845 (F+) kompetentne do transformacji metodą
Kushnera (rubidowo-wapniową). Preparatem plazmidu pWMK3 transformować
przygotowane komórki. Selekcjonować transformanty Cmr na podłożu LA z
chloramfenikolem (stęż. końc. 20 μg /ml).
II etap
1) Przeprowadzić koniugację transformanta W1845 Cmr, będącego dawcą, ze szczepem
SK7881 (ΔrecB, Kmr) - biorcą. Koniugację wykonać poprzez zmieszanie logarytmicznych
hodowli biorcy i dawcy w proporcji 10:1 (np. 4,5 ml biorcy i 0,5 ml dawcy).
2) Mieszaniny koniugacyjne inkubować 60 min. w 37oC.
3) Odpowiednie rozcieńczenia mieszaniny koniugacyjnej (100, 10-1, 10-2) wysiać na podłoże
selekcyjne: LA z kanamycyną (25 μg/ml) i chloramfenikolem (20 μg/ml). Płytki
inkubować 24 godz. w 37oC.
III etap
1) Wśród wyselekcjonowanych po koniugacji kolonii o fenotypie KmrCmr drogą replik
odszukać klony wrażliwe na MMS. Każda para studentów replikuje przy pomocy
wykałaczek 50 kolonii transkoniugantów na 3 płytki z następujacymi podłożami:
a) LA + MMS (0,05%);
b) LA + MMS (0,04%);
c) LA.
Jako kontrole użyć SK7881 (MMSs) i SK7297 (MMSr).
2) Wszystkie płytki inkubować w 30oC przez 48 h.
IV etap
1) Odczytać wyniki replik i określić procent otrzymanych klonów (MMSs).
2) Klony MMSs przesiać posiewem redukcyjnym. Płytki inkubować w 37oC.
18
V etap
1) Z klonów MMSs izolować plazmid metodą lizy alkalicznej i wykonać analizę
elektroforetyczną preparatów DNA na żelu agarozowym.
2) Sprawdzić ponownie ich fenotyp, wysiewając je ilościowo (wg wskazówek prowadzącego
ćwiczenia) na podłoża:
1) LA + MMS;
2) LA.
VI etap
1) Wykonać trawienie otrzymanego preparatu plazmidowego DNA enzymem PstI.
Równolegle przeprowadzić trawienie preparatu wyjściowego plazmidu pWMK3.
3) Przeprowadzić elektroforezę strawionych preparatów w 0,8% żelu agarozowym.
4) Poprzez porównanie wzoru restrykcyjnego obu plazmidów wnioskować o obecności i
lokalizacji transpozonu w analizowanym genie recB (mapa restrykcyjna Tn1000 jest
przedstawiona na rys. 5).
19
ILUSTRACJE
Rys. 1. Uproszczona mapa genetyczna plazmidu F.
Na mapie zaznaczono lokalizację systemów replikacyjnych (rep), regionu odpowiedzialnego za transfer
koniugacyjny (tra), punktu początkowego transferu (oriT) oraz elementów transpozycyjnych (IS2, IS3 i
Tn1000).
Region tra obejmuje geny:
1) warunkujące syntezę pilusów płciowych,
2) koniugacyjnego metabolizmu DNA,
3) odpowiedzialne za stabilizacje par,
4) odpowiedzialne za wykluczanie powierzchniowe,
5) regulacyjne.
Rys. 2.Schemat plazmidu pWMK3.
20
Rys. 3. Mapa chromosomu Escherichia coli.
Na mapie wyróżniono loci i szczepy Hfr istotne w przebiegu ćwiczenia.
Na wewnętrznym kole liczbami zaznaczono w minutach pozycje mapy w stosunku do locus
thr oraz zaznaczono wybrane 43 loci z pełnej mapy.
Na zewnętrznym kole zaznaczono strzałkami początek i kierunek przekazywania
chromosomu przez różne szczepy Hfr.
21
Rys 4. Schemat organizacji genetycznej elementów transpozycyjnych.
(strzałkami zaznaczono kierunek transkrypcji genów)
Rys. 5. Mapa restrykcyjna transpozonu Tn1000.
22
Rys. 6. Etapy transpozycji konserwatywnej i replikacyjnej.
(Biologia molekularna bakterii, PWN, 2006, str. 410)
23
PODŁOŻA
Podłoże LB (Luria broth)
Bacto tryptone
10 g
Bacto yeast Extract
5 g
NaCl
5 g
H2O dst.
do 1000 ml
pH 7,2; sterylizować 15 min w 121oC.
Podłoże LA (Luria agar)
Do 200 ml podłoża LB dodać 3 g Bacto - agaru. Jałowić jak wyżej.
Podłoże Davisa
sole:
K2HPO4 bezw.
14 g
KH2PO4 bezw.
6 g
2 g
(NH4)2SO4 bezw.
MgSO4 x 7H2O
0,2 g
cytrynian sodu
1,0 g
H2O
400 ml
Rozlać po 40 ml; jałowić 30 min. w 121oC.
agaroid:
agar-agar
3,0 g
H2O dest.
150
ml
glukoza 20%
Podłoże płynne przygotowuje się przez zmieszanie:
150 ml H2O dest.
40 ml soli
4 ml glukozy
Podłoże stałe otrzymuje się przez zmieszanie:
150 ml agaroidu
40 ml soli
4 ml 20% glukozy
Bulion odżywczy
Bulion suchy (Biomed)
15 g
H2O dest.
do 1000 ml
Agar odżywczy
Do 200 ml bulionu odżywczego dodać 3 g agaru-agaru. Jałowić jak wyżej.
Podłoże EMB
Bacto tryptone
10 g
Bacto yeast extract
1 g
NaCl
5 g
K2HPO4 bezw.
2 g
Bacto - agar
15 g
H2O dest.
do 1000 ml
Wyjałowić, a następnie dodać po 2 ml jałowych roztworów 4% eozyny i 0,65% błękitu
metylenowego oraz jałowy roztwór danego cukru do stężenia końcowego 1%.
24
METODY
1 Miniliza alkaliczna
(modyfikacja metody Birnboim i Doly, 1979)
W metodzie tej wykorzystuje się fakt, że w wąskim zakresie pH (12,0 - 12,5) zachodzi
wybiórcza denaturacja liniowej formy DNA, ale nie formy CCC. Komórki lizuje się
całkowicie traktując je SDS i NaOH. DNA chromosomowy zostaje wybiórczo
zdenaturowany, a kiedy lizat zostaje zobojętniony przez dodatek kwaśnego roztworu octanu
sodu, DNA chromosomowy renaturuje i tworzy nierozpuszczalne agregaty. Jednocześnie pod
wpływem wysokiego stężenia octanu sodu zachodzi wytrącenie kompleksów białek z SDS, a
także wielkokocząsteczkowego RNA. W ten sposób ko-precypitacji ulegają trzy rodzaje
największych makrocząsteczek mogących stanowić zanieczyszczenie preparatów DNA
plazmidowego. Można je następnie usunąć poprzez jedno wirowanie. Supernatant zawiera
przede wszystkim DNA plazmidowy (oraz resztki drobnocząsteczkowego RNA), który
można odzyskać z supernatantu w wyniku wytrącenia etanolem.
Materiały
1) Roztwór I:
50 mM glukoza
10 mM EDTA
25 mM Tris . Cl (pH 8,0)
2) Roztwór II:
0,2 N NaOH
1% SDS
3) Roztwór III:
octan potasu (pH~4,8)
Roztwór III przygotowuje się mieszając 60 ml 5 M octanu potasu z 11,5 ml lodowatwgo
kwasu octowego i 28,5 ml H20 dest. Otrzymany roztwór jest 3 M względem potasu i 5 M
względem octanu.
Wykonanie:
1) Odwirować w eppendorfówce 1,5 ml nocnej hodowli bakterii w LB (3 min,
mikrowirówka)
2) Dokładnie zlać supernatant, osad zawiesić w 100 μl zimnego roztworu I i inkubować 5
min w temp. pokojowej.
3) Dodać 200 μl roztworu II, zawartość eppendorfówki wymieszać przez kilkukrotne
odwracanie i inkubować w lodzie przez 5 min.
4) Dodać 150 μl zimnego roztworu III, wymieszać i inkubować w lodzie przez 5 min.
5) Dodać 30 μl mieszaniny fenolu z chloroformem i wymieszać łagodnie.
6) Odwirować 10 min. w mikrowirówce w temp. pokojowej.
7) Do zebranej fazy wodnej dodać 2 objętości (1ml) 96% etanolu i trzymać 15 min w
zamrażarce.
8) Odwirować wytrącony DNA (10 min. w wirówce z chłodzeniem), zlać supernatant.
10) Przemyć osad 100 μl 70% etanolu i odwirować 10 min w wirówce z chłodzeniem.
11) Dokładnie usunąć supernatant, wysuszyć osad (np. przez wstawienie otwartej
eppendorfówki na 15 min do termostatu na 65oC).
25
12) Osad zawiesić w 40 μl buforu TE (pH 8,0).
2. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym
Elektroforeza DNA w żelu agarozowym jest standardową metodą pozwalającą wykryć
obecność plazmidów w lizatach komórkowych, określić ich liczbę i wielkość, a także
rozdzielić fragmenty DNA otrzymane po trawieniu plazmidów enzymami restrykcyjnymi.
Tempo migracji cząsteczek DNA zależy od ich wielkości a także od użytych parametrów
elektroforezy (stężenia agarozy, przyłożonego napięcia, użytego buforu i temperatury).
Wykonanie:
1) Przygotować bufor elektrodowy Tris-octan (TAE ) o składzie: 0,04 M Tris-octan i 0,001M
EDTA, pH 8,0.
2) Przygotować 0,8% agarozę w buforze elektrodowym, ogrzać do całkowitego
rozpuszczenia, a następnie schłodzić do 60oC.
3) Wlać agarozę do przygotowanego odpowiednio aparatu do elektroforezy z włożonym
grzebieniem (grubość żelu powinna wynosić około 5 mm).
4) Po stężeniu żelu wyjąć grzebień i wlać bufor elektrodowy w takiej ilości, aby przykrył żel
cienką warstwą.
5) Wymieszać próbki DNA z buforem obciążającym (o składzie 0,25% błękit
bromofenolowy, 30% glicerol) w proporcji 6 : 1 i nałożyć do studzienek w żelu przy
pomocy pipety automatycznej.
6) Prowadzić elektroforezę, ustawiając zasilacz na wartość napięcia 100 V do momentu
dojścia barwnika do 2/3 żelu.
7) Barwić żel przez 10 min. w roztworze bromku etydyny o stężeniu końcowym 0,5 μg/ml.
8) Odpłukać bromek etydyny w wodzie destylowanej.
9) Obejrzeć żel pod lampą UV.
3. Transformacja metodą rubidowo-wapniową
(Kushner, 1978)
Metoda ta pozwala uzyskać dla wielu szczepów E. coli wyższą wydajność transformacji niż
standardowa metoda wapniowa.
Podloża i roztwory:
Podłoże LB i LA
Roztwór I do transformacji
10 mM MOPS pH 7,0
10 mM RbCl
Roztwór II do transformacji
100 mM MOPS pH 6,5
50 mM CaCl2
10 mM RbCl
26
Wykonanie:
1) Nocną hodowlę E. coli rozcieńczyć 1 : 50 w świeżym podłożu LB (np. do 10 ml podłoża
w
kolbie a 100 ml dodać 0,2 ml hodowli).
2) Inkubować z wytrząsaniem w 37oC do osiągnięcia gęstości około 1 x 108/ml (co trwa
około 2 godz.).
3) Odwirować 1,5 ml hodowli w probówkach Eppendorfa (3 min, mikrowirówka, 4oC).
4) Zlać dokładnie supernatant, osad zawiesić w 1 ml jałowego roztworu I i odwirować jak
wyżej.
5) Zlać dokładnie supernatant, a osad zawiesić w 0,2 ml jałowego roztworu II.
6) Zawieszone bakterie inkubować 15 min w lodzie.
7) Dodać DNA i trzymać przez dalsze 15 min w lodzie.
8) Przenieść na 50 sek do łaźni wodnej nastawionej na temp. 43 - 44oC.
9) Natychmiast dodać 5 ml LB i inkubować w 37oC bez wytrząsania przez 60 min.
10) Wysiać na odpowiednie płytki selekcyjne. Jeśli to potrzebne komórki przed wysiewem
można rozcieńczyć bądź zagęścić przez wirowanie.
4. Przygotowanie faga P1 do transdukcji
(metoda płytek dwuwarstwowych)
Materiały:
podłoże płynne LB
podłoże półpłynne LB (tzw."top agar"), zawierające 0,8% agaru.
chloroform
Wykonanie:
1) Zaszczepić 10 ml podłoża LB szczepem dawcy i inkubować przez noc w 37oC bez
wytrząsania.
2) Do hodowli dodać 0,1 ml 0,5 M jałowego roztworu CaCl2 (stęż. końc. 5 mM).
3) Rozlać po 0,5 ml hodowli do 4 probówek i dodać faga P1:
nr 1 - bez faga
nr 2 - 0,1 ml faga nierozcieńczonego
nr 3 - 0,1 ml faga rozcieńczonego w LB do 10-1
nr 4 - 0,1 ml faga rozcieńczonego w LB do 10-2
4) Inkubować 10 min. w termostacie (37oC) - adsorpcja.
5) Dodać 3 ml "top agaru" o temp. 45 – 46oC.
6) Delikatnie wymieszać i wylać na powierzchnię płytki LB.
7) Po zakrzepnięciu agaru, płytkę odwrócić i inkubować w 37oC przez noc.
8) Po inkubacji wybrać płytkę o odpowiednim stopniu lizy (tzw. "confluent lysis", tzn nie
widać pojedynczych łysinek, ale liza nie powinna być kompletna). Zeskrobać jałową
bagietką szklaną górną warstwę agaru półpłynnego, przenieść do jałowej probówki
wirowniczej, powierzchnię agaru przepłukać 2 ml LB, przenieść do tej samej probówki;
dodać 0,5 ml chloroformu i mocno wytrząsać.
9) Odwirować 4000 obrotów na min przez 10 - 15 min.
10) Przenieść supernatant do fiolki zawierającej nieco chloroformu.
11) Powtórzyć cykl namnażania, używając w punkcie 3 lizatu otrzymanego w punkcie 10.
27
5. Mianowanie lizatu fagowego
1) Do "nocnej" hodowli szczepu wskaźnikowego E. coli AB1157 lub do hodowli
logarytmicznej dwukrotnie zagęszczonej dodać CaCl2 do końcowego stężenia 5 mM.
2) Przygotować rozcieńczenia lizatu fagowego w LB (zwykle 10oC-5, 10-6 oraz 10-7).
3) Zmieszać w probówce 0,1 ml bakterii wskaźnikowych i 0,1 ml rozcieńczonego lizatu.
4) Inkubować 20 min. w 37oC (etap adsorpcji).
5) Dodać 1,5 - 1,8 ml półpłynnego podłoża LB o temp. 45 - 46oC (mała objętość pozwala
zwiększyć rozmiar łysinek P1, które są małe). Delikatnie wymieszać, i wylać na płytkę LB.
6) Po zakrzepnięciu płytki inkubować w 37o przez noc.
7) Policzyć łysinki i obliczyć miano faga.
6. Transdukcja
1) Nocną hodowlę szczepu biorcy rozcieńczyć 1 : 50 świeżym podłożem LB i inkubować z
wytrząsaniem do gęstości około 1 x 108/ml.
2) Hodowlę (5 ml) odwirować i zawiesić w 1/10 objętości podłoża LB (gęstość 1 x 109/ml).
3) Zmieszać:
- 0,5 ml zagęszczonej hodowli biorcy;
- 0,5 ml lizatu transdukującego rozcieńczonego w LB do gęstości 5 x 107pfu/ml
(co daje moi około 0,05);
- -0,5 ml mieszaniny 0,005 M CaCl2 i 0,03 M MgSO4 (przygotowanej przez
zmieszanie 3,0ml wody, 0,1 ml 0,5 M CaCl2 i 0,1 ml 1 M MgSO4).
4) Inkubować 20 min. w 37oC.
5) Odwirować, przemyć 5 ml buforu Davisa, zawiesić w 1 ml tego buforu.
6) Wysiać 0,1 ml na płytkę selekcyjna, resztę zawiesiny odwirować, osad zawiesić w 0,1 ml
buforu Davisa i wysiać na płytkę selekcyjną.
7) Inkubować co najmniej 2 dni
Uwaga: Wykonać następujące kontrole:
a) bez dodatku faga (na rewersję);
b) bez bakterii - sprawdzenie, czy lizat fagowy jest pozbawiony bakterii.