ĆWICZENIE 5 Barwniki roślinne Ekstrakcja barwników

ĆWICZENIE 5
Barwniki roślinne
Ekstrakcja barwników asymilacyjnych
Potrzebne odczynniki i materiały na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
400 mg - zhomogenizowany w ciekłym azocie proszek z natki pietruszki
6 ml - etanol 96%
2x probówki plastikowe typu Falcon na 15 ml
5x probówki szklane
2x pipetka plastikowa
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
wrząca łaźnia wodna
wirówka
waga laboratoryjna
Wykonanie
Do dwóch plastikowych probówek na 15 ml odwazyć po 200 mg zhomogenizowanego wcześniej w
ciekłym azocie proszku z natki pietruszki. Do pierwszej wlać 6 ml wody destylowanej a do drugiej
6 ml 96% etanolu. Obie probówki wstawić na 5 min do wrzącej łaźni wodnej a następnie
odwirować przez 5 min. Z każdej z probówek pobrac delikatnie nadsącz (tak aby nie naruszyć
peletu) do czystych szklanych probówek. Porównac zabarwienie ekstraktu wodnego i etanolowego.
Następnie ekstrakt etanolowy rozpipetować po ok 2 ml do trzech kolejnych pobówek i pozostawic
do dalszych doświadczeń.
Rozpuszczalnik
Zabarwienie
H20
Etanol 96%
Rozpuszczalność chlorofilu
Potrzebne odczynniki i materiały na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
ekstrakt etanolowy z poprzedniego doswiadczenia
3 ml – benzyna ekstrakcyjna
1x probówka szklana
2x pipetka plastikowa
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
Wykonanie
Do jednej z probówek z alkoholowym ekstraktem chlorofilu z poprzedniego doświadczenia dolać
około 1,5 razy więcej benzyny ekstrakcyjnej, przez chwilę mocno wytrząsać, a następnie probówkę
odstawić do statywu do ponownego rozdzielenia się mieszaniny. Zanotować zabarwienie górnej i
dolnej warstwy cieczy.
Warstwa
górna
dolna
Rozpuszczalnik
Zabarwienie
Barwniki asymilacyjne
19
Reakcja chlorofilu z zasadami
Potrzebne odczynniki i materiały na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
ekstrakt etanolowy z pierwszego doswiadczenia
2,5 ml – benzyna ekstrakcyjna
0,5 ml - 10% NaOH
1x probówka szklana
3x pipetka plastikowa
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
wrząca łaźnia wodna
Wykonanie
Do 2 ml etanolowego ekstraktu chlorofilu z pierwszego doświadczenia dodać 0,5 ml roztworu
zasady sodowej, wymieszać i wstawić na 2 min do wrzącej łaźni wodnej. Po ochłodzeniu roztworu
dodać 2,5 ml benzyny ekstrakcyjnej, wstrząsnąć i odstawić probówkę do rozdzielenia się warstw
cieczy. Zanotować zabarwienie górnej i dolnej warstwy cieczy. Porównac zabarwienie warstw z
poprzednim doswiadczeniem
Warstwa
Rozpuszczalnik
Zabarwienie
Barwniki asymilacyjne
górna
dolna
Reakcja chlorofilu z kwasami
Potrzebne odczynniki i materiały na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
ekstrakt etanolowy z pierwszego doswiadczenia
1 ml – 10% HCl
2 kryształki - octan miedzi
2x probówka szklana
2x pipetka plastikowa
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
wrząca łaźnia wodna
Wykonanie
Do probówki z 2 ml etanolowego ekstraktu chlorofilu z doświadczenia pierwszego dodać 5-6
kropli 10% kwasu solnego i dokładnie wymieszać. Zanotować zabarwienie ekstraktu. Część
roztworu odlać do czystej probówki i pozostawić dla kontroli, a do pozostałej objętości wrzucić 2
kryształki octanu miedzi i ogrzać na wrzącej łaźni wodnej. Porównać zabarwienia roztworów.
Roztwór
ekstrakt alkoholowy chlorofilu
ekstrakt + kwas
feofityna + octan miedzi
Barwa roztworu
20
Oznaczanie zawartości barwników asymilacyjnych metodą
spektrofotometryczną
Odczynniki:
•
•
•
•
zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści 6 gatunków roślin
80% buforowany aceton (200 ml buforu fosforanowego pH 7,8 + 800 ml acetonu)
Bufor fosforanowy pH 7,8 2,5mM 4stC (Na2HPO4 7H2O (268,07mg/mmol) – 0,55g/L i
NaH2PO4 bezw (120 mg/mmol) – 0,05g/L)
25% HCl
na 1 gr (5 zespołów) potrzeba:
• zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści 6 gatunków roślin: 6x 100 mg
• 80% buforowany aceton: 105 ml
• 25% HCl: 3,5 ml
Sprzęt:
Spektrofotometr
wirówka
wytrząsarka
łaźnia wodna
łaźnia lodowa
probówki eppendorfa 1,5ml
Probówki PP zakręcane (bo do wrzącej łaźni wodnej) (co najmniej 7-15ml)
Kuwety szklane
pipety szklane i automatyczne
Procedura:
• przygotować 6 probówek 10 ml
• do każdej odważyć ok 20mg liofilizowanego proszku z rożnych gatunków roślin
• dodać 3 ml buforowanego acetonu o temp 4stC
• wytrząsać przez 30 min
• zwirować 10 min 5000 rcf 4stC
• zlać zwirowane ekstrakty do cylindra miarowego i uzupełnić do 3 ml buforowanym
acetonem 80% po czym przelać do nowej probówki i zatkać
• Z ekstraktu pobrać 1 ml dodać 1 ml 80% acetonu i oznaczyć absorbancje (program
chlo1mz). Jeżeli absorbancja 0,2-0,8 ok, jeżeli za duża zmienić rozcieńczenie. Jako
referencję wlać 80% buforowany aceton 2ml
• Oznaczyć pozostałe próbki już z docelowym rozcieńczeniem.
• Ekstrakt pozostały w probówce wylać a probówkę zostawić do oznaczeń feofityny.
• Kuwetę po oznaczeniu na chlo1mz zlać do probówki i dodać 50 uL/mL 25% HCL w celu
przekształcenia do feofityny.
• Po dokonaniu wszystkich oznaczeń na chlo1mz rozpocząć oznaczanie feofityny na
programie chlofeo. W tym celu przelać zawartość probówki do kuwety i wstawić do
spektrofotometru. Jako referencji użyć 2 ml acetonu buforowanego 80% z dodatkiem 25%
HCL (50uL/ml)
• obliczyć zawartość chlorofilu, karotenoidów i feofityny z następujących wzorów:
Obliczenia
21
wg Porra et al 1989
Chlorofil A = 12,25*A663,6-2,55*A646,6 (ug/mL)
Chlorofil B = 20,31*A646,6-4,91*A663,6 (ug/mL)
Chlorofil A + B = 17,76*A646,6 + 7,34*A663,6 (ug/mL)
wg Lichtenthaller 1987
Karotenoidy = (1000 *A470 – 1,82CA – 85,02CB)/198 (ug/mL)
Feofityna całkowita = 3,84*A665,4+33,36*A653,4 (ug/mL)
w celu przeliczenia na g suchej masy wyniki pomnożyć przez rozcieńczenie próbek (2x) oraz
końcową objętość ekstraktu (3 ml) i podzielić przez 1000*masa naważki (mg/g sm)
Chromatografia bibułowa barwników asymilacyjnych
200 mg proszku z liści szpinaku odważyć w probówce na 7 ml. Zalać 4 ml 96% alkoholem
etylowym . Wytrząsać przez kilka minut. Przesączyć do probówki przez bibułę filtracyjną
umieszczoną w lejku. Ekstrakt przechowywać w łaźni lodowej w ciemności.
Na pasek bibuły o szerokości 1.5 cm i długości 20 cm nanieść kapilarą wyciąg barwników z liści w
następujący sposób: 2 cm od końca paska bibuły nanosić krople barwników do momentu aż
powstanie linii. Zostawić bibułę do wysuszenia. Zabieg nanoszenia powtórzyć kilka razy aż
powstanie ciemnozielona linia grubości kilku mm.
Do szklanej probówki nalać 2-3 cm3 mieszaniny rozwijającej: eter naftowy+aceton 9:1. Włożyć
pasek bibuły do probówki i zanurzyć koniec paska tak aby pasek barwników był około 1 cm nad
roztworem rozwijającym. Po rozwinięciu chromatogramu wyjąć bibułę i wysuszyć.
Właściwości antocyjanin i betacyjanidyn
Potrzebne odczynniki i materiały na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
200 mg - zhomogenizowany w ciekłym azocie proszek z liści kapusty czerwonej
22
200 mg - zhomogenizowany w ciekłym azocie proszek z buraka czerwonego
2x probówki plastikowe typu Falcon na 15 ml
1 ml 10% HCl
1 ml 10% NaOH
6x probówki szklane
5x pipetka plastikowa
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
wrząca łaźnia wodna
wirówka
waga laboratoryjna
Wykonanie
Do dwóch plastikowych probówek na 15 ml odwazyć: do pierwszej 200 mg zhomogenizowanego
wcześniej w ciekłym azocie proszku z z liści kapusty czerwonej, do drugiej 200 mg
zhomogenizowanego wcześniej w ciekłym azocie proszku z buraka czerwonego. Do każdej
probówki wlać 6 ml wody destylowanej. Obie probówki wstawić na 5 min do wrzącej łaźni wodnej
a następnie odwirować przez 5 min. Przygotować sześć szklanych probówek. Do probówki nr 1, 2 i
3 dodac delikatnie po ok. 2 ml nadsączu (tak aby nie naruszyć peletu) z roztworu wodnego z liści
kapusty, a do probówek nr 4, 5 i 6 po ok. 2 ml nadsączu z wodnego roztworu z buraka. Następnie
do probówek 1 i 4 dodać 6 kropli 10% HCl, do probówek 2 i 5 dodać 6 kropli wody destylowanej,
do probówek 3 i 6 dodać 6 kropli 10% NaOH. Porównać zabarwienie w probówkach.
23