przepis do ćwiczenia 4

Ćwiczenie 4
Barwniki asymilacyjne: właściwości, oznaczanie ilościowe.
Oznaczanie zawartości barwników asymilacyjnych metodą spektrofotometryczną
Odczynniki:
•
•
•
•
zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści 6 gatunków roślin
80% buforowany aceton (200 ml buforu fosforanowego pH 7,8 + 800 ml acetonu)
Bufor fosforanowy pH 7,8 2,5mM 4stC (Na2HPO4 7H2O (268,07mg/mmol) – 0,55g/L i
NaH2PO4 bezw (120 mg/mmol) – 0,05g/L)
25% HCl
na 1 gr (5 zespołów) potrzeba:
• zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści 6 gatunków roślin: 6x 100 mg
• 80% buforowany aceton: 105 ml
• 25% HCl: 3,5 ml
Sprzęt:
Spektrofotometr
wirówka
wytrząsarka
łaźnia wodna
łaźnia lodowa
probówki eppendorfa 1,5ml
Probówki PP zakręcane (bo do wrzącej łaźni wodnej) (co najmniej 7-15ml)
Kuwety szklane
pipety szklane i automatyczne
Procedura:
• przygotować 6 probówek 10 ml
• do każdej odważyć ok 20mg liofilizowanego proszku z rożnych gatunków roślin
• dodać 3 ml buforowanego acetonu o temp 4stC
• wytrząsać przez 30 min
• zwirować 10 min 5000 rcf 4stC
• zlać zwirowane ekstrakty do cylindra miarowego i uzupełnić do 3 ml buforowanym
acetonem 80% po czym przelać do nowej probówki i zatkać
• Z ekstraktu pobrać 1 ml dodać 1 ml 80% acetonu i oznaczyć absorbancje (program
chlo1mz). Jeżeli absorbancja 0,2-0,8 ok, jeżeli za duża zmienić rozcieńczenie. Jako
referencję wlać 80% buforowany aceton 2ml
• Oznaczyć pozostałe próbki już z docelowym rozcieńczeniem.
• Ekstrakt pozostały w probówce wylać a probówkę zostawić do oznaczeń feofityny.
• Kuwetę po oznaczeniu na chlo1mz zlać do probówki i dodać 50 uL/mL 25% HCL w celu
przekształcenia do feofityny.
• Po dokonaniu wszystkich oznaczeń na chlo1mz rozpocząć oznaczanie feofityny na
programie chlofeo. W tym celu przelać zawartość probówki do kuwety i wstawić do
spektrofotometru. Jako referencji użyć 2 ml acetonu buforowanego 80% z dodatkiem 25%
12
HCL (50uL/ml)
• obliczyć zawartość chlorofilu, karotenoidów i feofityny z następujących wzorów:
Obliczenia
wg Porra et al 1989
Chlorofil A = 12,25*A663,6-2,55*A646,6 (ug/mL)
Chlorofil B = 20,31*A646,6-4,91*A663,6 (ug/mL)
Chlorofil A + B = 17,76*A646,6 + 7,34*A663,6 (ug/mL)
wg Lichtenthaller 1987
Karotenoidy = (1000 *A470 – 1,82CA – 85,02CB)/198 (ug/mL)
Feofityna całkowita = 3,84*A665,4+33,36*A653,4 (ug/mL)
w celu przeliczenia na g suchej masy wyniki pomnożyć przez rozcieńczenie próbek (2x) oraz
końcową objętość ekstraktu (3 ml) i podzielić przez 1000*masa naważki (mg/g sm)
Ekstrakcja barwników asymilacyjnych
Potrzebne odczynniki i materiały na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
400 mg - zhomogenizowany w ciekłym azocie proszek z natki pietruszki
6 ml - etanol 96%
2x probówki plastikowe typu Falcon na 15 ml
5x probówki szklane
2x pipetka plastikowa
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
wrząca łaźnia wodna
wirówka
waga laboratoryjna
Wykonanie
Do dwóch plastikowych probówek na 15 ml odważyć po 200 mg zhomogenizowanego wcześniej w
ciekłym azocie proszku z natki pietruszki. Do pierwszej wlać 6 ml wody destylowanej a do drugiej
6 ml 96% etanolu. Obie probówki wstawić na 5 min do wrzącej łaźni wodnej a następnie
odwirować przez 5 min. Z każdej z probówek pobrać delikatnie nadsącz (tak aby nie naruszyć
peletu) do czystych szklanych probówek. Porównać zabarwienie ekstraktu wodnego i etanolowego.
Następnie ekstrakt etanolowy rozpipetować po ok 2 ml do trzech kolejnych probówek i pozostawić
do dalszych doświadczeń.
Rozpuszczalnik
Zabarwienie
H20
Etanol 96%
Rozpuszczalność chlorofilu
Potrzebne odczynniki i materiały na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
ekstrakt etanolowy z poprzedniego doświadczenia
3 ml – benzyna ekstrakcyjna
1x probówka szklana
2x pipetka plastikowa
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
13
Wykonanie
Do jednej z probówek z alkoholowym ekstraktem chlorofilu z poprzedniego doświadczenia dolać
około 1,5 razy więcej benzyny ekstrakcyjnej, przez chwilę mocno wytrząsać, a następnie probówkę
odstawić do statywu do ponownego rozdzielenia się mieszaniny. Zanotować zabarwienie górnej i
dolnej warstwy cieczy.
Warstwa
górna
dolna
Rozpuszczalnik
Zabarwienie
Barwniki asymilacyjne
Reakcja chlorofilu z zasadami
Potrzebne odczynniki i materiały na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
ekstrakt etanolowy z pierwszego doświadczenia
2,5 ml – benzyna ekstrakcyjna
0,5 ml - 10% NaOH
1x probówka szklana
3x pipetka plastikowa
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
wrząca łaźnia wodna
Wykonanie
Do 2 ml etanolowego ekstraktu chlorofilu z pierwszego doświadczenia dodać 0,5 ml roztworu
zasady sodowej, wymieszać i wstawić na 2 min do wrzącej łaźni wodnej. Po ochłodzeniu roztworu
dodać 2,5 ml benzyny ekstrakcyjnej, wstrząsnąć i odstawić probówkę do rozdzielenia się warstw
cieczy. Zanotować zabarwienie górnej i dolnej warstwy cieczy. Porównać zabarwienie warstw z
poprzednim doświadczeniem
Warstwa
Rozpuszczalnik
Zabarwienie
Barwniki asymilacyjne
górna
dolna
Reakcja chlorofilu z kwasami
Potrzebne odczynniki i materiały na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
ekstrakt etanolowy z pierwszego doświadczenia
1 ml – 10% HCl
2 kryształki - octan miedzi
2x probówka szklana
2x pipetka plastikowa
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
wrząca łaźnia wodna
Wykonanie
Do probówki z 2 ml etanolowego ekstraktu chlorofilu z doświadczenia pierwszego dodać 5-6
kropli 10% kwasu solnego i dokładnie wymieszać. Zanotować zabarwienie ekstraktu. Część
14
roztworu odlać do czystej probówki i pozostawić dla kontroli, a do pozostałej objętości wrzucić 2
kryształki octanu miedzi i ogrzać na wrzącej łaźni wodnej. Porównać zabarwienia roztworów.
Roztwór
ekstrakt alkoholowy chlorofilu
ekstrakt + kwas
feofityna + octan miedzi
Barwa roztworu
15