Diagnostyka molekularna w OIT
Transkrypt
Diagnostyka molekularna w OIT
Diagnostyka molekularna w OIT BARBARA ADAMIK KATEDRA I KLINIKA ANESTEZJOLOGII I INTENSYWNEJ TERAPII UNIWERSYTET MEDYCZNY WE WROCŁAWIU DNA RNA Białko Diagnostyka molekularna w OIT Niska czułość metod mikrobiologicznych - brak identyfikacji patogenu krwi w 50-70% przypadków ciężkiej sepsy. Długi czas oczekiwania na wynik badania mikrobiologicznego . Przedłużona/niewłaściwa antybiotykoterapia empiryczna jest związana z rozwojem szczepów opornych oraz ze zwiększoną śmiertelnością. Diagnostyka molekularna w OIT wymagająca hodowli patogenów Metoda diagnostyczna Liczba patogenów identyfikowanych PNA FISH Fluorescencja + hybrydyzacja 10 ACCU PROBE chemiluminescencja + sondy DNA 5 HYPLEX PCR + hybrydyzacja 10 Prove-it Sepsis PCR + mikromacierze 64 PLEX-ID BAC PCR +spektroskopia > 300 MALDI-TOF PCR +spektroskopia > 300 Verigene mikromacierze Gram(+) / Gram (-) Diagnostyka molekularna w OIT wymagająca hodowli patogenów Metoda diagnostyczna Liczba patogenów identyfikowanych PNA FISH Fluorescencja + hybrydyzacja 10 ACCU PROBE chemiluminescencja + sondy DNA 5 HYPLEX PCR + hybrydyzacja 10 Prove-it Sepsis PCR + mikromacierze 64 PLEX-ID BAC PCR +spektroskopia > 300 MALDI-TOF PCR +spektroskopia > 300 Verigene mikromacierze Gram(+) / Gram (-) Diagnostyka molekularna z pominięciem etapu hodowli patogenów Metoda diagnostyczna Liczba patogenów możliwych do identyfikacji System GeneExpert RT-PCR 1-2 / 1 godz. LightCycler SeptiFast RT-PCR 25 / 6 godz VYOO PCR + elektroforeza 34 / 7 godz. MagicplexTM Sepsis RT-PCR 91 / 8 godz. SepsiTest PCR + elektroforeza + sekwencjonowanie >300 / 8 godz Standardowa hodowla i identyfikacja Verigene HYPLEX Prove-it Sepsis PLEX-ID BAC MALDI-TOF PNA FISH SepsiTest MagicplexTM Sepsis VYOO LightCycler SeptiFast GeneExpert 0 10 20 30 czas [godz.] 40 50 60 Diagnostyka molekularna w OIT Żywe komórki bakterii/grzybów Komórki bakterii/grzybów w fagocytach Martwe komórki bakterii/grzybów Wolne DNA bakterii i grzybów tętnica/żyła Diagnostyka molekularna w OIT Badanie molekularne składa się z trzech etapów: 1. 2. 3. Ekstrakcja i oczyszczenie DNA Amplifikacja lub hybrydyzacja fragmentu DNA Identyfikacja fragmentu DNA 1. Ekstrakcja i oczyszczenie DNA 2. Amplifikacja lub hybrydyzacja fragmentu DNA PCR (Polymerase Chain Reaction) 3. Identyfikacja fragmentu DNA Diagnostyka molekularna w OIT System GeneExpert Prosty i szybki w użyciu system diagnostyczny POCT Test oparty na metodzie RT-PCR Pozwala na identyfikację pojedynczych patogenów System GeneXpert Detekcja MRSA i SA (wymaz z nosa) Detekcja MRSA i SA (+BC) Detekcja MRSA i SA (wymaz ze skóry i z tkanek miękkich) Detekcja RNA Enterowirusów (PMR) Detekcja DNA Streptococcus grupy B (wymaz z pochwy, odbytu) Detekcja C. difficile (kał) Detekcja Mycobacterium tuberculosis , wrażliwość na rifampicynę (plwocina) Detekcja wirusa grypy (plwocina) System GeneXpert Zalety Wady POCT ograniczone menu prosty w użyciu, w pełni zautomatyzowany brak możliwości jednoczesnej analizy wielu patogenów Diagnostyka gruźlicy, grypy, Detekcja C. difficile brak możliwości określania antybiotykooporności szybki koszt Diagnostyka molekularna w OIT System MagicplexTM Sepsis Pathogen DNA extraction from whole blood 2h Amplification on PCR 2, 5 h Screening 30 min Identification 30 min Gram (+) bacteria screening for: 40 Streptococcus spp. 3 Enterococcus spp. 30 Staphylococcus spp. Drug resistance screening for mecA, vanA, vanB Gram (-) bacteria screening for 12 pathogens Fungi screening for 6 pathogens Charakterystyka pacjentów (N=117) Wiek [lata] 60 ± 17 (18-92) Płeć M/K (%) 81 / 36 (70/30) APACHE II przy przyjęciu 26 ± 8 (9-40) Diagnoza przy przyjęciu na OIT Zapalenie otrzewnej 44 Ostre zapalenie trzustki 3 Niewydolność oddechowa 36 Niewydolność nerek 12 Po przeszczepieniu wątroby 5 Uraz komunikacyjny 6 Neuroinfekcja 2 Infekcja wewnątrzmaciczna 1 Inne 8 Ciężka sepsa n(%) 29 (25) Wstrząs septyczny n(%) 88 (75) Długość pobytu w OIT [dni] Śmiertelność [%] 24 ± 24 (2-107) 40 Magicplex PCR Hodowla dodatni 16% dodatni 49% ujemny 51% ujemny 51% ujemny 33% System MagicplexTM Sepsis Zalety Wady pozwala na jednoczesną identyfikację 91 tylko 91 patogenów w menu różnych patogenów oraz mecA, VanA, VanB identyfikacja patogenów grzybiczych częściowo zautomatyzowany lista patogenów odpowiada warunkom epidemiologicznym OIT wymaga 3 oddzielnych pomieszczeń identyfikacja patogenów bezpośrednio z krwi pobranej od pacjenta brak możliwości określania antybiotykooporności test dokładny i czuły koszt szybki, badanie trwa 8 godz. Diagnostyka molekularna w OIT SepsiTest - możliwość jednoczesnej detekcji i identyfikacji ponad 300 patogenów bakteryjnych i grzybiczych. Badanie jest wykonywane w materiale pobranym bezpośrednio od pacjenta. Test oparty na reakcji PCR, sekwencjonowaniu identyfikacji patogenu za pomocą baz danych on line. amplikonu i SepsiTest - materiał do badań Krew pobrana bezpośrednio od pacjenta Krew z hodowli PMR, BAL, mocz Wymazy z ran Wydzielina z drenu Tkanki 1. Pobranie krwi 2. Ekstrakcja 3. PCR Bazy danych genów dostępne on line (BLAST/FASTA) 5. Sekwencjonowanie 6. Identyfikacja patogenu 4. Elektroforeza 8 godzin System SepsiTest Zalety Wady pozwala na jednoczesną identyfikację > 300 koszt patogenów identyfikacja patogenów grzybiczych duże wymogi sprzętowe identyfikacja patogenów bezpośrednio z materiału pobranego od pacjenta wymaga oddzielnych pomieszczeń test dokładny i czuły brak możliwości określania antybiotykooporności szybki, badanie trwa 8 godz. Badania przesiewowe Stosowane u pacjentów Nosicielstwo MRSA wysokiego ryzyka Diagnoza Do potwierdzenia diagnozy TB, grypa, sepsa Prognozowanie Do oceny ciężkości stanu lub ryzyka nawrotu choroby (OncoType Dx) Wybór i monitorowanie terapii Monitorowanie skuteczności terapii Gram +/ Gram – Sepsa, nawrót choroby, sepsa grzybicza Ocena ryzyka Badania molekularne wspomagają tradycyjne czynniki ryzyka GenOSept - badanie genetycznych predyspozycji na sepsę GENOSEPT (Genetics of Sepsis and septic shock in Europe) badanie genetycznych predyspozycji na sepsę 1. genetyczne predyspozycje na sepsę / zachorowalność 2. genetyczne predyspozycje na sepsę / śmiertelność 3. genetyczne predyspozycje na sepsę / zróżnicowanie odpowiedzi na leczenie sepsy 4. genetyczne predyspozycje na sepsę / płeć 5. ustalenie standardów postępowania dla genotypowania w kier. predyspozycji na sepsę Start Date / End Date: 2005-01-01 / 2008-12-31 Project Cost: 3114228 euro Project Status: Completed www.genosept.eu Liesenfeld et al. Eur J Microbiol Immunol. 2014; 4(1): 1–25