Ocena stabilnosci.indd

Badanie porównawcze „in vitro” stabilności i dezintegracji
preparatu wykonanego w technologi Micro MURE®
z innymi preparatami zawierającymi probiotyki,
w warunkach symulujących środowisko żołądka.
Dr hab. med. Jacek Piątek, Prof. UMP, Katedra i Zakład Fizjologii Człowieka
Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu.
Kierownik Oddziału Chorób Wewnętrznych Szpitala w Jarocinie.
Mgr Beata Oleśków, Stacja Sanitarno Epidemiologiczna w Jarocinie.
Wykaz stosowanych skrótów
CFU - (Colony Forming Units) - jednostka tworząca kolonię bakterii
LAB - (Lactic Acid Bacteria) - bakterie kwasu mlekowego
Słowa kluczowe: mikroflora, probiotyk, sok żołądkowy
Wstęp
Według ogólnie przyjętej definicji probiotyki są żywymi
mikroorganizmami, których podanie w odpowiedniej dawce
wpływa pozytywnie na zdrowie gospodarza 1.
Organizm człowieka ma wiele mechanizmów zabezpieczających przed dostającymi się do niego mikroorganizmami. Jednym z najefektywniejszych jest zawartość dużej ilości
kwasu solnego w żołądku, pH żołądka dorosłego człowieka wynosi około 1. Wartość ta stabilizuje się w wieku około
3 lat. U dzieci młodszych pH jest wyższe. Po ukończeniu pierwszego roku życia pH soku żołądkowego dziecka
wynosi około 3.
Niskie pH stanowi mechanizm obronny, ale jednocześnie jest czynnikiem ograniczającym dostęp do organizmu
bakterii niezbędnych do prawidłowego funkcjonowania
przewodu pokarmowego. Ograniczenie to odnosi się również do preparatów medycznych stosowanych w celach
terapeutycznych, które zawierają żywe kultury bakterii2,3.
Na rynku istnieje wiele preparatów probiotycznych stosowanych również u dzieci. Dotychczas nie wykonano badań
wpływu pH soku żołądkowego u dzieci na przeżywalność
szczepów bakteryjnych zawartych w probiotykach dostępnych na naszym rynku.
Rynek farmaceutyczny obfituje w szeroką gamę produktów zawierających różne szczepy bakteryjne należące
do tzw. probiotyków. Niektóre z tych produktów zawierają
dodatkowo czynniki wpływające na rozwój dobroczynnych
mikroorganizmów. Czynniki te nazwano prebiotykami.
Połączenie probiotyku z prebiotykiem określa się mianem
synbiotyku.
W ostatnich latach pojawiały się preparaty będące synbiotykami, w których skład wchodziły szczepy bakterii probiotycznych, z dodatkiem drożdżaków oraz substancji prebiotycznych. Należy zwrócić uwagę na to, że znajdujące się
w sprzedaży preparaty różnią się zarówno składem ilościowym (różna ilość bakterii), jak i jakościowym (różne szczepy
bakterii), a niektóre posiadają w składzie dodatki substancji prebiotycznych. Wydaje się więc oczywiste, że preparaty probiotyków obecne na polskim rynku należało poddać
badaniom oporności na kwas solny (imitacja warunków
panujących w żołądku), ponieważ dopiero po pasażu przez
żołądek docierają one do właściwego miejsca działania.
W takiej postaci są one zażywane przez pacjentów. Biorąc
pod uwagę powyższe dane, jak najbardziej uzasadniony
wydaje się być ten model badań.
Cel badań
Celem badań było sprawdzenie przeżywalności bakterii
kilku powszechnie dostępnych na rynku preparatów probiotycznych dla dzieci w warunkach symulujących środowisko
soku żołądkowego, w zależności od technologii ich produkcji.
Materiał i metodyka
W przeprowadzonych badaniach stworzono model
eksperymentu naśladujący „in vitro” warunki kwasowe
panujące w świetle żołądka. W warunkach tych (roztwór
o pH 1,2 odpowiadający kwasowości soku żołądkowego
osoby dorosłej) zbadano przeżywalność szczepów bakteryjnych znajdujących się w różnych produktach rynkowych po
godzinnej inkubacji.
Do badań użyto 5 preparatów probiotycznych dla dzieci
dostępnych na rynku.
¨ 4 preparaty produkowane w tradycyjnej technologii.
¨ 1 preparat produkowany w technologii mikroenkapsulacji
Micro MURE®. Technologia ta polega na pokryciu bakterii
dwiema ochronnymi powłokami: białkową i polisacharydowo-hydrokoloidową. Zastosowana warstwa ochronna ma na celu ochronę bakterii przed destrukcyjnym
działaniem soku żołądkowego, enzymów trawiennych
i soli żółci. Zwiększa to przeżywalność bakterii dostających
się do światła jelita – docelowego miejsca ich działania.
Tabela 1. Próbki probiotyków użyte do badań.
Preparat probiotyku
Nr próbki
Zawartość szczepów bakteryjnych w próbce
Multilac® Baby 9 szczepów
w technologii Micro MURE®
8538303
6 szczepów Lactobacillus
3 szczepy Bifidobacterium
Produkt B 1 szczep w saszetce
3227573A238B
1 szczep Bifidobacterium
Produkt C 1 szczep w saszetce
SM 689
1 szczep Lactobacillus rhamnosus
Produkt D 1 szczep w saszetce
2244
1 szczep Saccharomyces boulardii
Produkt E 1 szczep w ampułce
025815
1 szczep Lactobacillus rhamnosus
Badania przeprowadzono zgodnie z metodyką opisaną
w „Enumeration of probiotic microorganisms exposed to
acid conditions”4.
żywych mikroorganizmów znajdujących się w jednej saszetce lub ampułce. Następnie homogenat zawierający probiotyki inkubowano w 0,1 M HCl przy pH 1,2 przez 60 minut.
Po zakończeniu inkubacji zawartość przenoszono do buforu
fosforanowego o pH 6,8 na 60 minut. Całe badanie przeprowadzane było w temperaturze 37° C5, 6.
Preparat Multilac® Baby inkubowano również w kwasie
solnym o pH 2 i pH 3 – występującym w soku żołądkowym
dzieci między 1 a 3 rokiem życia.
Wyniki przedstawiono jako średnią arytmetyczną z trzech
oznaczeń.
Badanie ilości bakterii LAB przed ekspozycją
na działanie kwasu solnego
W pierwszej fazie badań obliczono średnią ilość LAB
znajdującą się w saszetkach i ampułce. W tym celu dokonano homogenizacji badanych preparatów probiotycznych
i metodami mikrobiologicznymi obliczono średnią zawartość
Wyniki
Tabela 2. Liczba bakterii LAB przed i po godzinnej ekspozycji na działanie 0,1 M kwasu solnego o pH 1,2
Nr próbki
Początkowe
CFU
Log
początkowe
CFU
8538303
1 x 109
9
3,9 x 108
8,59
0,41
Produkt B 1 szczep w saszetce
3227573A238B
7,3 x 108
8,86
2,9 x 104
4,46
4,40
Produkt C 1 szczep w saszetce
SM 689
3 x 109
9,47
7,6 x 106
6,88
2,59
Produkt D 1 szczep w saszetce
2244
3,8 x 10
8,58
1,5 x 10
6
6,18
2,40
Produkt E 1 szczep w ampułce
025815
2 x 10
9,3
1,2 x 10
4
4,80
4,5
Produkt
Multilac® Baby 9 szczepów
CFU po
Log CFU po
ekspozycji ekspozycji
na kwas
na kwas
solny
solny
Redukcja
Log
w technologii Micro MURE
®
8
9
Wykres 1. Porównanie w skali logarytmicznej redukcji liczby żywych bakterii LAB wyprodukowanych w technologii
Micro MURE® z czterema innymi probiotykami dostępnymi na rynku po 1-godzinnej ekspozycji na działanie
0,1 M roztworu HCl o pH 1,2.
10
4,8%
9
27%
8
28%
7
50%
50%
6
5
4
3
2
1
0
Multilac®Baby 9 szczepów
ZWHFKQRORJLL0LFUR085(®
Produkt B
1 V]F]HSZVDV]HWFH
Produkt C
V]F]HSZVDV]HWFH
Produkt D
V]F]HSZVDV]HWFH
3RF]ÈWNRZH/RJ&)8VDV]HWNÚ/RJ&)8SRHNVSR]\FML+&/VDV]HWNÚ
2
Produkt E
V]F]HSZDPSXïFH
Wykres 1 prezentuje porównanie w skali logarytmicznej zmniejszenia liczby żywych bakterii po 1-godzinnej
ekspozycji na kwas solny. Multilac® Baby (technologia
Micro MURE®) zanotował spadek po 1 godzinie na poziomie
4,8%, natomiast ilość żywych bakterii w Produkcie B spadła
Tabela 3.
o 50% po ekspozycji na działanie kwasu solnego.
W Produkcie C ilość żywych bakterii spadła o 27%,
w Produkcie D spadek był na poziomie 28% i w ostatnim
Produkcie E odnotowano spadek na poziomie 50%.
Liczba bakterii LAB w preparacie Multilac® Baby przed i po godzinnej ekspozycji na działanie kwasu
solnego o pH 1,2; 2; 3.
Multilac® Baby
Log początkowe CFU
Log końcowe CFU po
1-godzinnej ekspozycji
Redukcja CFU w skali log
pH 1,2
9
8,59
0,41
pH 2
9
8,64
0,36
pH 3
9
8,75
0,25
Wykres 2. Porównanie w skali logarytmicznej liczby żywych bakterii w preparacie Multilac® Baby przed i po ekspozycji
na działanie kwasu solnego o pH 1,2; pH 2; pH 3.
9
2,8%
4,2%
4,8%
8,8
8,6
8,4
9
8,2
8,59
9
8,64
9
8,75
8
7,8
7,6
7,4
7,2
7
pH 1,2
pH 2
pH 3
/RJSRF]ÈWNRZH&)8 /RJNRñFRZH&)8SRJRG]LQQHMHNVSR]\FML
Porównując w skali logartymicznej spadek żywych bakterii
w preparacie Multilac® Baby wykonanym w technologii mikroenkapsulacji Micro MURE® przed i po ekspozycji
na działnie kwasu solnego o różnym stężeniu otrzymano
następujące wyniki:
® przy pH 1,2 odnotowano spadek żywych bakterii na poziomie 4,8% po ekspozycji na działanie kwasu solnego
Tabela 4.
® przy pH 2 odnotowano spadek żywych bakterii na poziomie 4,2% po ekspozycji na działanie kwasu solnego
® przy pH 3 odnotowano spadek żywych bakterii na poziomie 2,8% po ekspozycji na działanie kwasu solnego.
Porównanie w skali logarytmicznej spadku liczby żywych bakterii LAB w preparacie Multilac® Baby wykonanym w technologii Micro MURE®.
Produkt
Nr próbki
Początkowe
CFU
Log
początkowe
CFU
Redukcja
Log
w pH 1,2
Redukcja
Log
w pH 2
Redukcja
Log
w pH 3
Multilac® Baby 9 szczepów
w technologii Micro MURE®
8538303
1 x 109
9
0,41
0,36
0,25
3
Dyskusja
Powszechnie wiadomo, że przyjmowane doustnie pokarmy
oraz leki, dostają się drogą przewodu pokarmowego do żołądka. Enzymy oraz kwas solny wytwarzane przez żołądek wchodzą
w skład soku żołądkowego, który u dzieci ma pH wyższe niż
u dorosłych.
W warunkach fizjologicznych pokarm znajdujący się w żołądku
zostaje poddany ekspozycji na soki trawienne oraz motorykę żołądka przez około 60 min. Te ekstremalne warunki środowiska
są wymogiem prawidłowego trawienia oraz stanowią barierę dla
drobnoustrojów. Niskie pH soku żołądkowego dezynfekuje pokarmy oraz aktywuje proenzymy.
W pewnych sytuacjach ten etap trawienia okazuje się niekorzystny dla organizmu człowieka. W przypadku, w którym chcemy celowo wprowadzić sprzyjające zdrowiu substancje, proces
trawienia żołądkowego może zmniejszyć oczekiwane działanie
podawanych preparatów. Za typowy przykład tych niekorzystnych interakcji służyć może próba zasiedlenia śluzówki przewodu pokarmowego mikroflorą podawaną w probiotykach.
By zasiedlić dalsze odcinki jelita należy mieć na uwadze proces
„przejścia” przez żołądek i zaprojektować preparat w ten sposób, by mikroorganizmy przeżyły i mogły zasiedlić się w obrębie
jelita.
W jelicie grubym na 1 gram treści jelitowej przypada 1012
żywych mikroorganizmów. Jest to najbardziej skolonizowany
odcinek przewodu pokarmowego7. Bakterie zasiedlające jelito
składają się na złożony ekosystem mający ogromny wpływ na
organizm dziecka8.
W procesach życiowych mikroorganizmów powstają metabolity
wywierające różne skutki na gospodarza. Ekstremalne warunki
panujące w żołądku stanowią istotną barierę, której pokonanie
jest warunkiem prawidłowego rozwoju kolonii bakteryjnych po
podaniu probiotyków z zewnątrz9.
Rozmiar kapsułek zawierających probiotyki dla dorosłych
sprawia, że preparaty te nie mogą być przyjmowane w tej postaci
przez dzieci. Aby znaleźć wyjście z tej sytuacji rozpoczęto produkcję środków probiotycznych w postaci proszków do stosowania
doustnego. Niestety, niskie pH panujące w żołądku niekorzystnie
wpływa na przeżywalność bakterii zawartych w tych preparatach.
Wykazano, że technologia mikroenkapsulacji Micro MURE® zawarta w preparacie Multilac® Baby stanowi rozwiązanie tego problemu, ponieważ zapewnia ochronę mikroorganizmów obecnych
w omawianych tutaj preparatach.
Wyniki przeprowadzanych badań „in vitro” wyraźnie sugerują, iż działanie niskiego pH na szczepy bakteryjne znacząco wpływa na ich zdolność do przeżycia w tych niekorzystnych warunkach. Odnosi się to przede wszystkim do
drobnoustrojów, które nie zostały otoczone żadną dodatkową ochroną. Na podstawie wniosków uzyskanych z badania
stwierdza się, że ten brak elementu protekcyjnego sprawia,
iż mikroorganizmy są bardziej podatne na niskie pH i ich zdolność do przetrwania tych warunków jest niższa.
W tabeli nr 2. porównano zdolność do przeżycia w kwasie solnym mikroorganizmów w preparatach wytwarzanych
dwoma różnymi technologiami: Micro MURE® i tradycyjną.
Wykazano, że w tym porównaniu zdecydowanie lepiej wypadają środki wykonane przy pomocy technologii Micro MURE®.
Uwzględniając fizjologicznie wyższe pH panujące w dziecięcym żołądku wyniki powyższych badań okazały się podobne.
Technologia Micro MURE® (preparat handlowy Multilac® Baby)
charakteryzuje się wyższą przeżywalnością bakterii zawartych
w preparatach w tym niekorzystnym środowisku.
Wnioski
1. Inkubacja mikroorganizmów zawartych w preparatach
probiotycznych przeznaczonych dla dzieci w środowisku o niskim pH prowadzi do ich częściowej inaktywacji
i zmniejszonej przeżywalności.
2. Technologia mikroenkapsulacji Micro MURE® zastosowana
w produkcji preparatu Multilac® Baby jest najbardziej
efektywna w ochronie żywych szczepów bakterii probiotycznych przed destrukcyjnym działaniem kwasu solnego
znajdującego się w żołądku.
3. Niska przeżywalność mikroorganizmów w preparatach
produkowanych tradycyjnymi metodami przyczyniać się
może do słabszej kolonizacji jelita i mniejszej efektywności działania.
Piśmiennictwo
1
2
3
4
5
6
7.
8
9
4
FAO/WHO, 2002 Guidelines for the evaluation of probiotics in food. World Health Organization, Geneva, Switzerland.
A. Lillie and A.K. Johansen, 1990, Disintegration and in- vitro acid stability tests on nine lactic acid bacteria preparations. XXIII, Nordic Gastroenterology Meeting in Reykjavik, Iceland
L. Corneliussen, R. Skov and F. Espersen, 1999, Effect of low pH on survival of lactic producing bacteria in oral formulation. The 9th European Congress of Clinical Microbiology
and Infectious Diseases, Berlin, Germany
Sorensen et al, 2010. Report: Enumeration of probiotics microorganisms exposed to acidic condition.
European Pharmacopoeia 6.0 Vol 1.:718;2.9,1:263
D.L. Larsen, H. Harborg and E. Brandsborg, 2009. Protokol 08/30/HF002
Finegold,S. M. Sutter, V. L, Mathisen, G. E. 1983 Normal indigenous intestinal flora. In: Human Intestinal Microflora in Health and Disease pp. 3-31 Academic press, London, UK
Sartor R.B.: Therapeutic manipulation of the enteric microflora in inflammatory bowel diseases: antibiotics, probiotics, and prebiotics. Gastroenterology, 2004; 126: 1620–1633
Fukushima Y., Yamano T.: Adhesion of Probiotics onto Intestinal Epithelial Cell and the Host Defense. J. Intestinal Microbiol., 2003; 17: 1–8
REV: MultB/11.2016/01