streszczenie (PL)

Streszczenie
Ekspresja genów eukariotycznych jest kontrolowana głównie na poziomie translacji,
co w przeciwieństwie do regulacji na poziomie transkrypcji pozwala na szybką zmianę
poziomu białek w komórce w odpowiedzi na działanie czynników stresowych.
Regulacja procesu translacji dotyczy przede wszystkim etapu inicjacji, który może zachodzić
na drodze skanowania regionów terminalnych 5′ mRNA przez kompleks rybosomalny
lub na drodze mechanizmu niezależnego od kapu. Regiony terminalne 5′ mRNA modulują
wydajność
translacji
na
skutek
oddziaływania
z
czynnikami
białkowymi.
Zaobserwowano, że ekspresja białka p53 oraz jego izoformy Np53 jest regulowana
przez region terminalny 5′ mRNA p53. Region ten może występować w postaci kilku
wariantów sekwencyjnych, różniących się miejscem inicjacji transkrypcji, obecnością
sekwencji
intronów
zachowanych
w
alternatywnym
składaniu
oraz
obecnością
alternatywnych kodonów inicjacyjny. Dane literaturowe sugerują, że w obrębie regionu
terminalnego 5′ mRNA p53 występuje element IRES (ang. internal ribosomal entry site),
który umożliwia wewnętrzną inicjację translacji bez konieczności skanowania mRNA przez
kompleks rybosomalny.
W niniejszej pracy doktorskiej określono wpływ wariantów regionu terminalnego 5′
mRNA p53 na translację białka reporterowego. Zweryfikowano również mechanizm
translacji inicjowanej z kodonu AUG1 dla białka p53 pełnej długości oraz z kodonu AUG2
dla izoformy Np53. W tym celu stosowano modelowe konstrukty mRNA, w których
warianty regionu terminalnego 5′ mRNA p53 poprzedzały sekwencję kodującą białko
reporterowe. Następnie, ulegały one translacji in vitro w lizacie z króliczych retikulocytów,
a także w ludzkich komórkach HeLa i MCF-7. Analiza strukturalna regionu terminalnego 5′
mRNA p53 w modelowym konstrukcie mRNA wykazała, że kodon AUG1 znajduje się
w obrębie trwałej termodynamicznie spinki G56-C169. Istnieje możliwość, że spinka ta
stanowi zawadę przestrzenną dla skanującego kompleksu rybosomalnego, dzięki czemu
wzrasta wydajność translacji z kodonu AUG1. Hipotezę tą potwierdziły wyniki analizy
„odcisku palca”, ponieważ identyfikacja kompleksów rybosomalnych w obrębie kodonu
AUG1 była utrudniona. Wyniki uzyskane w reakcjach translacji in vitro sugerują, że inicjacja
translacji z kodonu AUG1 jest w dużej mierze zależna od kapu na końcu 5′ mRNA.
Natomiast translacja z kodonu AUG2 wykazuje raczej charakter zależny od elementu IRES.
Okazało się również, że region pomiędzy miejscami promotorowymi P0 i P1 silnie obniża
wydajność translacji z kodonu AUG1. Prawdopodobnie, efekt ten jest związany ze strukturą
drugorzędową regionu w pobliżu końca 5′ mRNA, która może zakłócać proces skanowania.
Z kolei obecność intronu 2 w innym modelowym konstrukcie mRNA skutkowała translacją
jedynie z kodonu AUG2. Co więcej, mutacja kodonu STOP UGA obecnego w intronie 2
na kodon GCG pokazała, że translacja może być inicjowana również z kodonu AUG1.
W związku z tym, wariant regionu terminalnego 5′ mRNA p53 z zachowanym intronem 2
posiada uORF, która koduje 25-aminokwasowy peptyd. Tak więc, izoforma Np53 może
powstawać z mRNA zawierającym intron 2 według mechanizmu reinicjacji, po zakończeniu
syntezy peptydu z kodonu AUG1.
W celu modulacji efektywności translacji białka p53 i izoformy Np53 wykorzystano
oligonukleotydy antysensowe komplementarne do regionu terminalnego 5′ mRNA p53.
Oligomery, które wiązały się do najbardziej charakterystycznych motywów strukturalnych,
którymi są spinki G56-C169 i U180-A218 indukowały największe zmiany poziomie białek
syntetyzowanych
z
obu
kodonów
AUG
w
lizacie
z
króliczych
retikulocytów.
Wynik ten wskazuje na kluczową rolę obu spinek w procesie inicjacji translacji.
Ponadto, okazało się, że efekt oligonukleotydów antysensowych na wydajność translacji
związany jest z aktywnością RNazy H, która jest obecna w lizacie. W celu obniżenia poziomu
białka
p53
w
komórkach
MCF-7
zastosowano
wybrane
oligomery
w
formie
2′-O-metylowanej oraz gamperów LNA. Modyfikowane oligomery wydają się być
potencjalnymi terapeutykami obniżającym poziom białka p53 w liniach komórek
nowotworowych poddawanych radioterapii.