udzia£ niemięśniowych komórek macierzystych w regeneracji
Transkrypt
udzia£ niemięśniowych komórek macierzystych w regeneracji
KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊNI 187 POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 37 2010 NR 1 (187207) UDZIA£ NIEMIÊNIOWYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH W REGENERACJI MIÊNI SZKIELETOWYCH* PARTICIPATION OF 'NON-MUSCLE' STEM CELLS IN REGENERATION OF SKELETAL MUSCLE Karolina ARCHACKA, Jerzy MORACZEWSKI, Iwona GRABOWSKA Zak³ad Cytologii, Instytut Zoologii, Wydzia³ Biologii, Uniwersytet Warszawski Streszczenie: Miênie szkieletowe s¹ zdolne do regeneracji w odpowiedzi na uszkodzenie bêd¹ce wynikiem na przyk³ad urazu mechanicznego, dzia³ania toksyny lub choroby. Kluczow¹ rolê w tym procesie odgrywaj¹ komórki satelitowe zlokalizowane w miêniu szkieletowym. Jednak zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i eksperymentalnych w regeneracjê mog¹ zostaæ zaanga¿owane komórki macierzyste rezyduj¹ce w miêniu lub pochodz¹ce z innego ród³a. Budzi to nadzieje na potencjalne wykorzystanie tych komórek w terapii chorób miêni szkieletowych, takich jak dystrofie miêniowe czy rdzeniowy zanik miêni. U pacjentów cierpi¹cych na te choroby obserwuje siê zaburzenia regeneracji miêni, czêsto powi¹zane z wyczerpaniem lub zmniejszeniem endogennej populacji komórek satelitowych. Dlatego wykorzystanie komórek macierzystych mog³oby spowodowaæ przywrócenie mo¿liwoci odbudowy miêni szkieletowych. Jednak taka terapia bêdzie mo¿liwa dopiero po przeprowadzeniu precyzyjnej analizy w³aciwoci komórek macierzystych, której kluczowym elementem jest ocena ich potencja³u miogenicznego, czyli zdolnoci do ró¿nicowania w komórki i w³ókna miêniowe. Niniejsza praca podsumowuje aktualny stan wiedzy na temat potencja³u miogenicznego ró¿nych populacji komórek macierzystych i wskazuje te z nich, które maj¹ szansê staæ siê ród³em komórek przeszczepianych podczas terapii chorób miêni szkieletowych. S³owa kluczowe: miênie szkieletowe, regeneracja, komórki macierzyste, transplantacja, potencja³ miogeniczny. Summary: Skeletal muscle tissue is characterized by ability to regenerate in response to injury resulting for example from mechanical trauma, toxin or disease. The key role in this process is played by satellite cells localized in skeletal muscle. However, both under physiological and experimental conditions different types of stem cells originating either from skeletal muscle or other tissues can be also involved in regeneration. This raises the hope for potential use of stem cells in the therapy for skeletal muscles diseases, such as muscular dystrophies or spinal muscle atrophy. These pathologies are characterized by impairment of regeneration linked with depletion or reduction of endogenous population of satellite cells. Thus, transplantation of stem cells could improve regeneration of such muscle and, as a result, support their reconstruction. However, stem cells based therapy will be possible only after precise analysis of *Artyku³ powsta³ podczas realizacji projektów badawczych finansowanych ze rodków na naukê MNiSW nr: N301 4051 33 i N303 3081 33. 188 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA their features, especially their myogenic potential, i.e. the ability to differentiate into muscle cells and fibers. This review summarizes current state of knowledge concerning myogenic potential of different types of stem cells and indicates those that are likely to be used in a future as a source of cells transplanted during skeletal muscle therapy. Keywords: skeletal muscles, regeneration, stem cells, transplantation, myogenic potential. 1. WPROWADZENIE Miênie szkieletowe s¹ zdolne do regeneracji w odpowiedzi na uszkodzenie mechaniczne (intensywny wysi³ek fizyczny, zmia¿d¿enie, rozerwanie), chemiczne (dzia³anie toksyn) oraz termiczne (dzia³anie wysokiej lub niskiej temperatury). Równie¿ podczas rozwoju choroby wywo³anej np. nieprawid³owym unerwieniem miêni lub brakiem istotnych bia³ek strukturalnych w miêniach szkieletowych indukowana jest regeneracja. Podstawow¹ rolê w regeneracji odgrywaj¹ komórki prekursorowe miêni szkieletowych komórki satelitowe. Komórki satelitowe zlokalizowane s¹ w niszy pomiêdzy sarkolemm¹ a b³on¹ podstawn¹ w³ókna miêniowego i w warunkach fizjologicznych pozostaj¹ nieaktywne mitotycznie. Szacuje siê, ¿e u myszy wkrótce po urodzeniu j¹dra komórek satelitowych stanowi¹ oko³o 30% wszystkich j¹der obecnych w miêniach szkieletowych. Wraz z wiekiem ich liczba znacz¹co siê zmniejsza, co wp³ywa na ograniczenie zdolnoci miêni szkieletowych do regeneracji [68]. Komórki satelitowe syntetyzuj¹ wiele charakterystycznych dla nich czynników, takich jak: bia³ka transb³onowe M-kadheryna (cz¹steczka adhezyjna zale¿na od jonów wapnia), c-Met (receptor dla hepatocytowego czynnika wzrostu), CD34 (marker hematopoetycznych komórek macierzystych) oraz czynniki transkrypcyjne Pax7 i Myf-5 [69]. Najwa¿niejsze z wymienionych czynników bia³ko Pax7 jest kluczowe dla powstania odpowiednio du¿ej puli komórek satelitowych. U myszy pozbawionych funkcjonalnego genu pax7 liczba komórek satelitowych jest znacznie mniejsza ni¿ u myszy typu dzikiego, co powoduje zaburzenia procesu regeneracji [45]. Po uszkodzeniu miênia lub w trakcie rozwoju choroby, komórki satelitowe ulegaj¹ aktywacji, zaczynaj¹ siê intensywnie dzieliæ, a nastêpnie ró¿nicowaæ w mioblasty. Nastêpnie mioblasty w wyniku fuzji albo s¹ w³¹czane do istniej¹cych w³ókien miêniowych, albo tworz¹ de novo wieloj¹drowe miotuby i w³ókna miêniowe, co prowadzi do odtworzenia struktury regeneruj¹cego miênia. W zaktywowanych, ró¿nicuj¹cych komórkach dochodzi do sekwencyjnej syntezy miêniowych czynników regulatorowych MRF (ang. myogenic regulatory factors, do rodziny tej nale¿¹ MyoD, Myf-5, Mrf-4 oraz miogenina). W czêci populacji aktywowanych komórek satelitowych rozpoczyna siê ekspresja genu myoD, natomiast stopniowo zanika ekspresja pax7. Uruchamia to kaskadê sygna³ów prowadz¹cych do ró¿nicowania tych komórek w mioblasty. Kolejnym etapem ró¿nicowania jest fuzja mioblastów i utworzenie przez nie wieloj¹drowych miotub, a nastêpnie dojrzewanie powsta³ych w³ókien miêniowych. Procesom tym towarzyszy ekspresja mrf4 i miogeniny czynników transkrypcyjnych zaliczanych do tzw. pónych MRF. W KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊNI 189 pozosta³ych komórkach satelitowych nie dochodzi do ekspresji myoD, dziêki czemu syntetyzuj¹ one nadal bia³ko Pax7, pozostaj¹ w stanie niezró¿nicowanym i odtwarzaj¹ pulê komórek satelitowych [68]. Z komórek satelitowych zwi¹zanych z jednym w³óknem miêniowym mo¿e powstaæ ponad sto nowych w³ókien zawieraj¹cych tysi¹ce j¹der. Ponadto, poniewa¿ komórki satelitowe charakteryzuje zdolnoæ do samoodnawiania populacji, proces ten mo¿e byæ wielokrotnie powtarzany [16]. 2. PIERWSZE PRÓBY TERAPII DYSFUNKCJONALNYCH MIÊNI SZKIELETOWYCH Regeneracja miêni szkieletowych nie zawsze przebiega w sposób prawid³owy. U pacjentów cierpi¹cych na choroby miêni, takie jak dystrofie miêniowe czy rdzeniowy zanik miêni, obserwuje siê powa¿ne zaburzenia tego procesu [26, 37]. Najpowszechniejsz¹ grup¹ chorób miêni s¹ dystrofie miêniowe, w tym wystêpuj¹ca u 1 na 3500 urodzonych ch³opców dystrofia miêniowa Duchenne'a [3]. Dystrofie miêniowe stanowi¹ grupê ponad 30 chorób genetycznych, objawiaj¹cych siê stopniowym os³abieniem i zanikiem miêni szkieletowych. We wczesnej fazie choroby w miêniach zachodz¹ na zmianê fazy degeneracji i regeneracji, które prowadz¹ do wyczerpania puli komórek satelitowych. W efekcie miêsieñ nieprawid³owo regeneruje, dochodzi w nim do rozwoju fibrozy (zw³óknienia), która zaburza strukturê i funkcjê miêni [26]. Opisane zmiany patologiczne mog¹ prowadziæ do niepe³nosprawnoci ruchowej i czêsto do mierci na skutek niewydolnoci oddechowej. Do chwili obecnej nie zosta³a opracowana skuteczna terapia najciê¿szych dystrofii miêniowych oraz wielu innych chorób neuromiêniowych. Wyniki prowadzonych w ostatnich latach badañ wiadcz¹, ¿e wykorzystanie komórek macierzystych w terapii tych chorób mo¿e daæ satysfakcjonuj¹ce rezultaty [46, 47]. Podstawow¹ rolê w regeneracji miêni szkieletowych odgrywaj¹ komórki satelitowe, dlatego te¿ s¹ one komórkami pierwszego wyboru w terapiach komórkowych maj¹cych na celu leczenie lub ³agodzenie objawów chorób miêni szkieletowych. Pionierskie dowiadczenia z wykorzystaniem komórek satelitowych lub powsta³ych z nich, w wyniku ró¿nicowania, mioblastów przeprowadzono na prze³omie lat 80. i 90. W 1989 roku Partridge i wspó³pracownicy wprowadzili mioblasty linii komórkowej C2C12 do miêni myszy mdx, stanowi¹cych zwierzêcy model dystrofii [46, 47]. Myszy mdx charakteryzuje mutacja w genie koduj¹cym dystrofinê, jedno z bia³ek strukturalnych, którego obecnoæ jest niezbêdna do prawid³owego funkcjonowania miêni szkieletowych [3]. Dystrofina zapewnia swoiste po³¹czenie pomiêdzy F-aktyn¹ wchodz¹c¹ w sk³ad cytoszkieletu w³ókna miêniowego a kompleksem glikoproteinowym DAG (ang. dystrophin-associated glycoprotein complex) zlokalizowanym w jego sarkolemmie (ryc. 1). Kompleks DAG zbudowany jest z sarkoglikanów i dystroglikanów odpowiedzialnych z kolei za wi¹zanie bia³ek macierzy zewn¹trzkomórkowej, np. lamininy. Dystrofina, tworz¹c po³¹czenie pomiêdzy cytoszkieletem a macierz¹ zewn¹trzkomórkow¹ stabilizuje b³onê w³ókna miêniowego podczas 190 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA RYCINA 1. Oddzia³ywania dystrofiny z innymi bia³kami strukturalnymi we w³óknie miêniowym. Dystrofina zlokalizowana jest w cytoplazmie w³ókna miêniowego, gdzie odpowiada za po³¹czenie z F-aktyn¹, bia³kiem cytoszkieletu, a tak¿e z kompleksem glikoproteinowym obecnym w sarkolemmie. Kompleks ten sk³ada siê z licznych bia³ek transb³onowych, m.in. z sarkoglikanów i sarkospanu o nieznanych funkcjach, a tak¿e dystroglikanów odpowiedzialnych za wi¹zanie bia³ek macierzy zewn¹trzkomórkowej, np. lamininy. Laminina miêdzy innymi wraz z kolagenem tworzy b³onê podstawn¹ otaczaj¹c¹ w³ókno miêniowe FIGURE 1. Interactions of dystrophin with other structural proteins in a skeletal fiber: Dystrophin is localized in the cytoplasm of a skeletal fiber, where it forms links both with F-actin, a cytoskeletal protein, and the glycoprotein complex present in the sarcolemma. The complex includes many transmembrane proteins like sarcoglycans and sarcospan, not described functionally yet, as well as dystroglycans that bind proteins of the extracellular matrix, for example laminin. Laminin together with collagen are the major proteins of the basal lamina surrounding the muscle fiber skurczu miênia. Ponadto poredniczy w przekazywaniu si³y generowanej w kurcz¹cych siê sarkomerach, podstawowych jednostkach strukturalno-czynnociowych miêni szkieletowych, do macierzy zewn¹trzkomórkowej, a nastêpnie do ciêgien [3]. Nieobecnoæ dystrofiny w miêniu szkieletowym prowadzi wiêc do obni¿enia si³y jego skurczu, a tak¿e do ci¹g³ego uszkadzania b³ony w³ókien miêniowych podczas kolejnych skurczów. W dowiadczeniach przeprowadzonych przez Partridge'a i wspó³pracowników zaobserwowano wznowienie syntezy dystrofiny w miêniach szkieletowych myszy mdx po transplantacji mioblastów linii C2C12. wiadczy³o to o tym, ¿e wprowadzone komórki by³y zdolne do zasiedlenia dystroficznego miênia i tworzenia prawid³owo funkcjonuj¹cych w³ókien miêniowych. Te i podobne dowiadczenia zapocz¹tkowa³y w latach 90. lawinê badañ klinicznych, podczas których wstrzykiwano zdrowe mioblasty do miêni szkieletowych pacjentów cierpi¹cych na dystrofiê. Próby te jednak zakoñczy³y siê niepowodzeniem. Obserwowano bardzo wysok¹ miertelnoæ transplantowanych komórek (oko³o 75% z nich ginê³o wkrótce po transplantacji), ich niewielk¹ migracjê w miêniu oraz, dodatkowo, eliminacjê wprowadzonych KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊNI 191 komórek na skutek odpowiedzi immunologicznej chorego [46, 47]. Zastosowanie leków immunosupresyjnych oraz modyfikacja metod wprowadzania mioblastów do miêni (np. przez wykorzystanie trójwymiarowych rusztowañ dla komórek, podawanie wraz z komórkami czynników wzrostu i bia³ek macierzy zewn¹trzkomórkowej) pozwoli³o w ostatnich latach osi¹gn¹æ lepsze wyniki (wy¿sza prze¿ywalnoæ transplantowanych komórek, lepsza migracja komórek w miêniu). Ci¹gle jednak nie doprowadzono do znacz¹cej poprawy funkcjonowania miênia, co nie pozwala myleæ o stosowaniu tej terapii w leczeniu chorób miêni [60]. Standardowe metody izolacji komórek satelitowych z miêni szkieletowych i ich póniejsza hodowla in vitro prowadz¹ do ró¿nicowania w mioblasty, a przez to niestety do obni¿enia ich potencja³u regeneracyjnego [42]. Pierwsze dowiadczenia polegaj¹ce na wprowadzeniu do miêni szkieletowych niezró¿nicowanych komórek satelitowych przeprowadzono dopiero w ostatnich latach. W dowiadczeniach tych transplantowano ca³e w³ókna miêniowe razem z obecnymi w nich komórkami satelitowymi lub komórki satelitowe bezporednio po ich izolacji z w³ókien. W obu przypadkach obserwowano masow¹ regeneracjê miêni oraz poprawê ich funkcjonowania. Ponadto, przeszczepione komórki zasiedla³y nisze charakterystyczne dla komórek satelitowych, co jest jednym z warunków powodzenia terapii komórkowej [12, 16, 42, 50]. Mimo obiecuj¹cych wyników, terapia z wykorzystaniem komórek satelitowych wydaje siê byæ jednak ma³o realna ze wzglêdu na liczne trudnoci. Po pierwsze, populacja tych komórek jest ograniczona i wykorzystanie ich do transplantacji wymaga³oby zwiêkszenia ich liczby w warunkach in vitro, co niestety prowadzi do utraty ich zdolnoci do wydajnego udzia³u w regeneracji [42]. Ograniczenia zwi¹zane z hodowl¹ in vitro uniemo¿liwiaj¹ tak¿e zabiegi, które mog³yby doprowadziæ do genetycznej korekty komórek pobranych od pacjenta cierpi¹cego na dystrofiê miêniow¹ i powtórne ich wprowadzenie do organizmu chorego. St¹d te¿ du¿e nadzieje wzbudza mo¿liwoæ wykorzystania komórek macierzystych, które mog³yby stanowiæ alternatywne ród³o komórek do przeszczepu. Du¿e zainteresowanie mo¿liwoci¹ wykorzystania komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej wi¹¿e siê z ich cechami charakterystycznymi, tj. zdolnoci¹ do samoodnawiania, która gwarantuje uzyskanie wystarczaj¹co du¿ej populacji komórek do transplantacji, oraz ich zdolnoci¹ do ró¿nicowania w wyspecjalizowane rodzaje komórek. Komórki macierzyste s¹ obecne w organizmach na wszystkich etapach rozwoju, od rozwoju zarodkowego do doros³oci. Te wywodz¹ce siê z zarodków charakteryzuj¹ siê wysokim tempem proliferacji oraz du¿ymi zdolnociami do ró¿nicowania. Komórki macierzyste obecne w organizmach doros³ych zwykle maj¹ ograniczone mo¿liwoci ró¿nicowania i odpowiadaj¹ za uzupe³nianie populacji komórek tkanki, w której rezyduj¹, a które zu¿ywane s¹ w trakcie ¿ycia organizmu [34]. Jednak bez wzglêdu na istniej¹ce ró¿nice kluczow¹ cech¹ wszystkich rodzajów komórek macierzystych, które mog³yby stanowiæ ród³o materia³u do przeszczepu w terapii chorób miêni szkieletowych, musi byæ ich zdolnoæ do ró¿nicowania w komórki miêniowe. Zdolnoæ ta okrelana jest jako potencja³ miogeniczny. 192 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA 3. JAK OCENIÆ POTENCJA£ MIOGENICZNY KOMÓREK MACIERZYSTYCH? Potencja³ miogeniczny komórek macierzystych mo¿na oceniæ testuj¹c je zarówno w warunkach hodowli in vitro, jak i in vivo. Pozwala to na okrelenie, czy z komórek macierzystych powstaj¹ komórki to¿same lub przypominaj¹ce pod wzglêdem w³aciwoci komórki miêniowe czyli komórki satelitowe i wywodz¹ce siê z nich mioblasty, a nastêpnie wieloj¹drowe miotuby i w³ókna miêniowe. a. Ocena potencja³u miogenicznego komórek macierzystych in vitro Poddawane ocenie komórki macierzyste porównuje siê do mioblastów sprawdzaj¹c obecnoæ, zarówno na poziomie mRNA jak i bia³ka, czynników z rodziny Pax oraz MRF, a tak¿e wystêpowanie bia³ek strukturalnych oraz niezbêdnych do fuzji bia³ek adhezyjnych (np. M-kadheryny, syndekanu-4, ciê¿kich ³añcuchów miozyny). Kolejnym istotnym etapem weryfikacji potencja³u miogenicznego komórek macierzystych jest okrelenie, czy sygna³y p³yn¹ce ze rodowiska, w którym siê znajduj¹ s¹ w stanie zaindukowaæ ich ró¿nicowanie w mioblasty. Proces ten mo¿na indukowaæ stosuj¹c kilka procedur. Badane komórki mog¹ byæ hodowane w standardowych po¿ywkach promuj¹cych proliferacjê, a nastêpnie ró¿nicowanie komórek miêniowych. Komórki macierzyste mo¿na hodowaæ tak¿e w po¿ywce kondycjonowanej (inaczej warunkowanej) przez ró¿nicuj¹ce komórki miêniowe, czyli takiej, która zawiera czynniki wydzielane przez mioblasty [6, 58]. W praktyce metody te czêsto okazuj¹ siê niewystarczaj¹ce do indukcji ró¿nicowania komórek macierzystych w mioblasty. Bardziej efektywna wydaje siê byæ hodowla mieszana (inaczej kokultura) komórek macierzystych z ró¿nicuj¹cymi komórkami miêniowymi. Zapewnia ona bezporedni kontakt badanych komórek z mioblastami, dziêki czemu maj¹ one szansê odpowiedzieæ na czynniki wydzielane przez mioblasty, miêdzy innymi insulinopodobny czynnik wzrostu IGFI i IGFII (ang. insulin-like growth factor) czy czynnik wzrostu fibroblastów FGF (ang. fibroblast growth factor) i rozpocz¹æ ró¿nicowanie. Metoda ta umo¿liwia tak¿e okrelenie czêstoci wystêpowania hybrydowych miotub powsta³ych w wyniku fuzji komórek macierzystych z mioblastami, których obecnoæ sugeruje, ¿e z danego typu komórek mog¹ powstaæ funkcjonalne komórki miêniowe bior¹ce aktywny udzia³ w procesie regeneracji miêni szkieletowych [56]. Inn¹ strategi¹ mo¿e byæ wprowadzanie do po¿ywki, w której hodowane s¹ komórki macierzyste, czynników odpowiedzialnych za indukcjê miogenezy podczas rozwoju zarodkowego, takich jak: bia³ka z rodziny Wnt, bia³ko morfogenetyczne koci BMP (ang. bone morphogenetic protein) czy Sonic Hedgehog. Próba naladowania procesów zachodz¹cych in vivo jest jednak doæ trudna i czêsto wymaga zastosowania kilku czynników dodawanych do po¿ywki w cile okrelonym czasie i stê¿eniu. Dlatego popularnym sposobem testowania potencja³u miogenicznego komórek macierzystych jest ich hodowla w obecnoci komórek wydzielaj¹cych wspomniane czynniki, takich jak np. fibroblasty syntetyzuj¹ce bia³ko Wnt7a, które podczas rozwoju zarodkowego odpowiada za indukcjê miogenezy [6]. KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊNI 193 Ró¿nicowanie niektórych komórek macierzystych mo¿na osi¹gn¹æ przez stosowanie czynników chemicznych, np. 5-azacytydyny (5-AzaC), która jest inhibitorem metylacji DNA i przez zmianê konformacji chromatyny w komórce wp³ywa na zmianê wzoru ekspresji okrelonych genów. Pod wp³ywem 5-AzaC wiele typów komórek, np. komórki macierzyste p³ynu owodniowego i mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego ró¿nicuje w komórki miêniowe [11, 24]. Podobny efekt mo¿na osi¹gn¹æ wprowadzaj¹c do testowanych komórek wektory koduj¹ce okrelone miêniowe czynniki regulatorowe. Taka strategia przynios³a pozytywne wyniki m.in. w przypadku zarodkowych komórek macierzystych. Przyk³adowo, nadekspresja bia³ka Pax3 w tych komórkach wywo³a³a ich ró¿nicowanie w komórki miogeniczne [19]. b. Ocena potencja³u miogenicznego komórek macierzystych in vivo Ocena mo¿liwoci ró¿nicowania komórek macierzystych w komórki miêniowe w warunkach in vitro stanowi wstêp do najwa¿niejszej czêci analizy, czyli weryfikacji ich potencja³u miogenicznego in vivo. Najpopularniejszym stosowanym testem jest wprowadzanie badanych komórek do regeneruj¹cych miêni szkieletowych zwierz¹t laboratoryjnych (np. myszy), a nastêpnie kompleksowa analiza skutków tej transplantacji. Regeneracja miêni szkieletowych mo¿e byæ wywo³ana na wiele sposobów, miêdzy innymi przez mechaniczne uszkodzenie miêni, silne zmro¿enie lub nastrzykniêcie miotoksyn¹ (np. kardiotoksyn¹ otrzyman¹ z jadu kobry). Kardiotoksyna powoduje perforacjê b³on komórkowych i aktywacjê tkankowej fosfolipazy C, a w konsekwencji zaburzenia w funkcjonowaniu kana³ów jonowych, które prowadz¹ do depolaryzacji i degradacji b³on komórkowych [28]. Bez wzglêdu na sposób uszkodzenia, w miêniu dochodzi do naruszenia integralnoci b³ony w³ókien miêniowych, które staj¹ siê bardziej przepuszczalne i pozwalaj¹ na uwolnienie do surowicy czynników zlokalizowanych do tej pory w ich cytoplazmie, np. kinazy kreatyninowej. Proces regeneracji przebiega wed³ug podobnego schematu i sk³ada siê z dwóch nak³adaj¹cych siê faz: degeneracyjnej (miolizy) oraz regeneracyjnej (rekonstrukcji). Podczas miolizy dochodzi do nekrozy uszkodzonych w³ókien miêniowych, a uwalniane z nich cytokiny i czynniki wzrostu powoduj¹ rozwój stanu zapalnego w miejscu uszkodzenia. Komórki stanu zapalnego, takie jak neutrofile i makrofagi, fagocytuj¹ uszkodzone w³ókna miêniowe i resztki uszkodzonej tkanki. Równoczenie w miêniu dochodzi do aktywacji komórek satelitowych, które intensywnie proliferuj¹, ró¿nicuj¹ i odtwarzaj¹ w³ókna miêniowe (ryc. 2) [15]. W dowiadczeniach prowadzonych in vivo wa¿ne jest sprawdzenie, czy wprowadzone komórki potrafi¹ przetrwaæ w rodowisku regeneruj¹cych miêni, a tak¿e czy s¹ zdolne do proliferacji i migracji w obrêbie tej tkanki. Wprowadzone komórki mog¹ byæ rozpoznawane i eliminowane przez uk³ad odpornociowy biorcy, nale¿y wiêc okreliæ, jak ich obecnoæ w miêniu szkieletowym wp³ywa na rozwój stanu zapalnego i czy nie wywo³uje odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciwko przeszczepowi, zaburzaj¹c w ten sposób przebieg regeneracji. W prowadzonych in vivo badaniach czêsto wykorzystuje siê myszy SCID, NOD lub Rag2-/-. Zwierzêta te charakteryzuje 194 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA RYCINA 2. Regeneracja miêni szkieletowych myszy. A przekrój poprzeczny przez nieuszkodzony miêsieñ szkieletowy myszy (m. gastrocnemius), widoczne w³ókna miêniowe z peryferyjnie po³o¿onymi j¹drami komórkowymi; B przekrój poprzeczny przez miêsieñ szkieletowy myszy, 3. dzieñ po uszkodzeniu kardiotoksyn¹, widoczne uszkodzone w³ókna miêniowe i liczne komórki stanu zapalnego rozwijaj¹cego siê w miêniu; C przekrój poprzeczny przez miêsieñ szkieletowy myszy, 14 dni po uszkodzeniu kardiotoksyn¹,widoczne nowoutworzone w³ókna miêniowe z centralnie po³o¿onymi j¹drami komórkowymi; D przekrój poprzeczny przez miêsieñ szkieletowy 3-miesiêcznej myszy SMN, widoczne liczne w³ókna miêniowe z centralnie po³o¿onymi j¹drami komórkowymi powsta³e w wyniku spontanicznej regeneracji miênia w odpowiedzi na nieprawid³owe unerwienie miênia (skrawki barwione hematoksylin¹ Harrisa i eozyn¹ Y A, B, C oraz hematoksylin¹ Gilla i eozyn¹ Y D, skala 500 µm FIGURE 2. Regeneration of mouse skeletal muscles: A representative cross section of intact mouse skeletal musle (gastrocnemius muscle). Muscle fibers with peripherally located nuclei are visible. B cross section of mouse skeletal muscle 3 days after cardiotoxin injection. Damaged muscle fibers and numerous inflammatory cells are visible. C cross section of mouse skeletal muscle 14 days after cardiotoxin treatment. Newly regenerated fibers with central nuclei are visible. D cross section of skeletal muscle isolated from 3-month-old SMN mouse. As a result of spontaneous regeneration of muscle in response to improper innervation numerous muscle fibers with centrally located nuclei are visible. Sections stained with Harris' hematoxylin and eosin Y (A, B, C) or Gill's hematoxylin and eosin Y (D) Bar represents 500 µm niedobór odpornoci [33, 35], a co za tym idzie nie odrzucaj¹ one przeszczepów nie tylko w uk³adzie allogenicznym (od osobników tego samego gatunku), ale tak¿e w uk³adzie ksenogenicznym (od osobników innych gatunków). Wykorzystanie tych zwierz¹t pozwala wiêc na testowanie udzia³u np. ludzkich komórek macierzystych w regeneracji miêni szkieletowych. Najwa¿niejszym etapem analizy w³aciwoci KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊNI 195 wprowadzonych do miênia komórek macierzystych jest okrelenie, czy komórki te ró¿nicuj¹ w mioblasty, czy podczas regeneracji bior¹ udzia³ w tworzeniu hybrydowych w³ókien miêniowych i czy s¹ zdolne do zasiedlenia niszy charakterystycznej dla komórek satelitowych. Tylko taka obserwacja pozwala na w³aciw¹ weryfikacjê potencja³u miogenicznego wprowadzonych komórek, a pozytywny wynik daje szansê na uzyskanie d³ugofalowych efektów transplantacji komórek. Oprócz zwierz¹t, u których regeneracja jest wywo³ana uszkodzeniem miênia, w dowiadczeniach in vivo wykorzystuje siê tak¿e zwierzêta, które stanowi¹ zwierzêce modele chorób miêni wystêpuj¹cych u ludzi. Przyk³adem mog¹ byæ wspomniane ju¿ myszy mdx oraz myszy SMN (ang. survival of motor neurons), które stanowi¹ zwierzêcy model choroby okrelanej jako rdzeniowy zanik miêni [44]. W miêniach szkieletowych obu rodzajów myszy obserwuje siê spontaniczn¹ regeneracjê indukowan¹ w odpowiedzi na rozwój choroby (ryc. 2). Regeneracja miêni dystroficznych przebiega standardowo we wczesnych stadiach choroby. Jednak w wyniku kolejnych rund regeneracji i degeneracji miêni populacja komórek satelitowych ulega wyczerpaniu. Nastêpstwem tego s¹ powa¿ne zaburzenia struktury i funkcji miêni szkieletowych, a nastêpnie ich stopniowy zanik. Poniewa¿ rozwój choroby u myszy mdx jest du¿o wolniejszy i ³agodniejszy ni¿ u ludzi, model ten nie jest doskona³y. W przeciwieñstwie do ludzi chorych na dystrofiê Duchenne'a, mimo widocznych zmian w strukturze miêni myszy mdx s¹ zdolne do poruszania siê, a d³ugoæ ich ¿ycia jest tylko nieznacznie krótsza w porównaniu z myszami typu dzikiego. Ró¿nice w przebiegu choroby u ludzi i myszy t³umaczy siê wiêksz¹ zdolnoci¹ miêni szkieletowych myszy do regeneracji, a tak¿e czêciow¹ kompensacj¹ braku dystrofiny przez inne bia³ka strukturalne, np. utrofinê [3]. Pomimo tego myszy mdx stanowi¹ popularny model wykorzystywany do oceny potencja³u miogenicznego komórek macierzystych. Dowodem na to, ¿e przeszczepione komórki macierzyste bior¹ udzia³ w regeneracji miêni myszy mdx jest synteza dystrofiny, poprawa architektury i zwiêkszenie si³y skurczu miênia. Z kolei u myszy SMN obserwuje siê postêpuj¹c¹ degeneracjê miêni szkieletowych wywo³an¹ nieprawid³owym unerwieniem tej tkanki, co prowadzi do przedwczesnej mierci zwierz¹t [37, 44]. Przeprowadzone w ostatnich latach badania wykaza³y jednak, ¿e proces ten mo¿e zostaæ zahamowany przez wprowadzenie do miêni myszy SMN ró¿nych rodzajów komórek macierzystych, m.in. komórek satelitowych i komórek izolowanych ze szpiku kostnego [43, 51]. Obecnoæ tych komórek nie tylko wp³ynê³a na poprawê struktury i funkcjonowania miêni, ale tak¿e przed³u¿y³a ¿ycie tych myszy, co stanowi kluczowy argument przemawiaj¹cy za kontynuowaniem badañ powiêconych poszukiwaniu najlepszego ród³a komórek do terapii chorób miêni. Potencja³ miogeniczny komórek macierzystych mo¿na badaæ nie tylko w regeneruj¹cych, ale tak¿e w rozwijaj¹cych siê miêniach szkieletowych. Dowiadczenia takie polegaj¹ na wprowadzeniu badanych komórek do zarodków myszy na stadium blastocysty, a nastêpnie przeszczepieniu blastocysty do dróg rodnych samicy. Jeli wprowadzone blastocysty ulegn¹ implantacji w macicy samicy-biorczyni, mo¿na 196 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA spodziewaæ siê, ¿e badane komórki wezm¹ udzia³ w tworzeniu tkanek rozwijaj¹cego siê zarodka, w tym równie¿ miêni szkieletowych. Udzia³ poddawanych analizie komórek macierzystych w budowie miêni szkieletowych mo¿na oceniaæ na ró¿nych etapach rozwoju zarodka, a tak¿e po narodzinach uzyskanego w ten sposób zwierzêcia chimerowego. Stosuj¹c tê technikê Schulze i wspó³pracownicy wykazali, ¿e mezenchymalne komórki macierzyste izolowane ze szpiku kostnego mog¹ braæ udzia³ w tworzeniu miêni szkieletowych [56]. 4. POTENCJA£ MIOGENICZNY KOMÓREK MACIERZYSTYCH Dotychczas przeprowadzono wiele badañ weryfikuj¹cych potencja³ miogeniczny komórek macierzystych pochodz¹cych z ró¿nych róde³. Najwiêcej publikacji naukowych powiêconych jest roli komórek macierzystych ze szpiku kostnego, mezenchymalnych komórek macierzystych, komórek macierzystych z naczyñ krwiononych oraz zarodkowych komórek macierzystych (tab. 1) w regeneracji miêni szkieletowych. a. Hematopoetyczne komórki macierzyste Pierwszym rodzajem komórek macierzystych, które wzbudzi³y zainteresowanie jako potencjalne ród³o komórek do wykorzystania w terapii chorób miêni szkieletowych, by³y komórki izolowane ze szpiku kostnego. Obecne s¹ w nim co najmniej dwie populacje komórek macierzystych, tj. hematopoetyczne komórki macierzyste HSC (ang. hematopoietic stem cells) i mezenchymalne komórki macierzyste MSC (ang. mesenchymal stem cells). HSC odpowiedzialne s¹ za wytwarzanie wszystkich komórek krwi, za MSC s¹ ród³em cytokin i czynników wzrostu oraz zapewniaj¹ odpowiednie mikrorodowisko w szpiku kostnym. Pionierskie dowiadczenia przeprowadzone przez Meyera i Yaroma w latach 80. udowodni³y, ¿e obecnoæ komórek izolowanych ze szpiku znacz¹co poprawia³a przebieg regeneracji miêni szkieletowych szczurów i ma³p, a tak¿e zmniejsza³a w³óknienie tkanki miêniowej [61]. W 1988 roku Ferrari i wspó³pracownicy wykazali, ¿e komórki izolowane ze szpiku kostnego s¹ zdolne do zasiedlenia uszkodzonego miênia szkieletowego, a w odpowiedzi na sygna³y docieraj¹ce ze rodowiska s¹ w stanie ró¿nicowaæ i braæ udzia³ w odtwarzaniu w³ókien miêniowych [47]. Kolejne doniesienia sugerowa³y jednak, ¿e mimo i¿ transplantacji komórek uzyskanych ze szpiku kostnego do miêni myszy mdx towarzyszy³o wznowienie syntezy dystrofiny w powstaj¹cych w³óknach miêniowych, to wprowadzone komórki by³y w³¹czane do zaledwie 1% regeneruj¹cych w³ókien [27]. W tym samym czasie LaBarge i Blau opublikowali jednak pracê, w której wykazali, ¿e komórki macierzyste wyizolowane ze szpiku kostnego myszy transgenicznej, w której komórkach dochodzi do ekspresji GFP (ang. green fluorescent protein), i wprowadzone przez ¿y³ê ogonow¹ do krwioobiegu myszy biorczyni wziê³y udzia³ w odtworzeniu 3,5% zregenerowanych w³ókien. Ponadto komórki syntetyzuj¹ce bia³ko GFP by³y zdolne do zasiedlenia niszy komórek o gro mny p o te nc ja ³ re ge ne ra c yjny in v iv o , za sie d la nie niszy k o mó re k sa te lito wyc h b io rc y, funk c jo na lna p o p ra wa za sie d lo nyc h miê ni, b ra k k o nie c zno c i wstê p ne go ró ¿nic o wa nia k o mó re k rutyno wo izo lo wa ne ze szp ik u k o stne go , wyk a zuj¹ p o te nc ja ³ mio ge nic zny in v it ro i in v iv o za sie d la j¹ miê nie szk ie le to we z nisk ¹ c zê sto c i¹ , k o mó rk i o b e c ne w niszy k o mó re k sa te lito wyc h s¹ nie funk c jo na lne , nie zna ny me c ha nizm ró ¿nic o wa nia o gra nic zo na lic zb a k o mó re k , trud no c i w izo la c ji i ho d o wli in v it ro b e z utra ty p o te nc ja ³u re ge ne ra c yjne go wystê p uj¹ w wie lu nisza c h w o rga nizmie , s¹ d o stê p ne , ³a twe sp rze c zne wynik i na te ma t ic h me c ha nizmu w izo la c ji i ho d o wli in v it ro , wyk a zuj¹ p o te nc ja ³ mio ge nic zny ró ¿nic o wa nia (fuzja vs "a uto no mic zna " in v it ro i in v iv o , za sie d la j¹ miê sie ñ z wyso k ¹ c zê sto c i¹ (6 0 %), zmia na wzo ru e k sp re sji ge nó w), b ra k o c e ny za sie d la j¹ niszê k o mó re k sa te lito wyc h (k ilk a na c ie p ro c e nt), wp ³ywu o b e c no c i k o mó re k na si³ê k urc zu synte tyzuj¹ c ha ra k te rystyc zne ma rk e ry i b io r¹ ud zia ³ w k o le jnyc h miê ni i funk c je mo to ryc zne zwie rzê c ia rund a c h re ge ne ra c ji, to le ro wa ne p rze z uk ³a d immuno lo gic zny (te sty fizjo lo gic zne ) go sp o d a rza M e za ng io - zd o lne d o ró ¿nic o wa nia w wa runk a c h in v it ro , za sie d la j¹ nie ma l k o nie c zno æ o p ra c o wa nia me to d y wyd a jne j bla s ty wszystk ie miê nie szk ie le to we p o wp ro wa d ze niu d o uk ³a d u izo la c ji k o mó re k , wynik i musz¹ zo sta æ k r¹ ¿e nia , wyk rywa ne w 8 0 % w³ó k ie n miê nio wyc h, p o p ra wia j¹ p o twie rd zo ne p rze z inne grup y b a d a wc ze funk c je mo to ryc zne zwie rzê c ia Ko mó rk i o b e c ne w k ilk u nisza c h w o rga nizmie , ³a twe w izo la c ji ze wzglê d u k o nie c zno æ p rze p ro wa d ze nia b a d a ñ AC1 3 3 + na o k re lo ny ma rk e r p o wie rzc hnio wy (b ia ³k o D1 3 3 ) zd o lne d o k linic znyc h ró ¿nic o wa nia w wa runk a c h in v it ro , p o tra nsp la nta c ji two rz¹ hyb ryd o we w³ó k na i za sie d la j¹ niszê k o mó re k sa te lito wyc h, ic h o b e c no æ w miê niu p o p ra wia si³ê sk urc zu, o gra nic za ro zwó j fib ro zy i p o wo d uje le p sze uk rwie nie K o mó rk i zd o lne d o p o d jê c ia ró ¿nic o wa nia mio ge nic zne go w wa runk a c h sa mo istne ró ¿nic o wa nie k o mó re k ES w k ula c h ES in v it ro , o b e c ne w miê niu na we t 6 mie siê c y p o tra nsp la nta c ji, za ro d k o wyc h za c ho d zi z nisk ¹ c zê sto c i¹ , nie zna ny wyk rywa ne w 2 0 % w³ó k ie n miê nio wyc h, p o p ra wia j¹ funk c je me c ha nizm ró ¿nic o wa nia , synte za tylk o nie k tó ryc h mo to ryc zne zwie rz¹ t, za sie d la j¹ niszê k o mó re k sa te lito wyc h ma rk e ró w mio ge nic znyc h, mo ¿liwo æ two rze nia z nisk ¹ c zê sto c i¹ , zd o lno æ d o nie o gra nic zo ne j p ro life ra c ji guzó w no wo two ro wyc h p o tra nsp la nta c ji, i sa mo o d na wia nia , uzysk a nie ind uk o wa nyc h k o mó re k sp rze c zne wynik i na te ma t immuno ge nno c i p lurip o te ntnyc h ze ró d ³a nie b ud z¹ c e go k o ntro we rsji e tyc znyc h k o mó re k ES , k o ntro we rsje e tyc zne d o tyc z¹ c e uzysk iwa nia k o mó re k ES z za ro d k ó w M SC HS C K o mó rk i sa te lito we Ro hwe d e l i wsp . , 1 9 9 4 [4 9 ] Ba r b e r i i w s p . , 2 0 0 5 [ 5 ] K a mo c hi i wsp . , 2 0 0 6 [3 6 ] Zhe ng i wsp . , 2 0 0 6 [7 0 ] Ba r b e r i i w s p . , 2 0 0 7 [ 4 ] Da r a b i i ws p . , 2 0 0 8 [ 1 9 ] C ha ng i wsp . , 2 0 0 9 [1 4 ] To rre nte i wsp . , 2 0 0 4 [6 4 ] Ga vina i wsp . , 2 0 0 6 [3 2 ] S hi i wsp . , 2 0 0 9 [5 9 ] De Ange lis i wsp . 1 9 9 9 [2 2 ] S a mp a o le si i wsp . 2 0 0 3 [5 3 ] S a mp a o le si i wsp . 2 0 0 6 [5 2 ] C o llins i wsp . 2 0 0 5 [1 6 ] Mo nta rra s i wsp . 2 0 0 5 [4 2 ] C e rle tti i wsp . 2 0 0 8 [1 2 ] S a c c o i ws p . 2 0 0 8 [ 5 0 ] C a ma rgo i wsp . 2 0 0 3 [1 0 ] C o r b e l i ws p . 2 0 0 3 [ 1 7 ] S he rwo o d i wsp . 2 0 0 4 [5 7 ] S he rwo o d i wsp . 2 0 0 4 [5 8 ] Ab e d i i ws p . 2 0 0 7 [ 1 ] Wa k ita ni i wsp . 1 9 9 5 [6 5 ] D e Ba r i i w s p . 2 0 0 3 [ 2 3 ] S c hulze i wsp . 2 0 0 5 [5 6 ] De za wa i wsp . 2 0 0 5 [2 5 ] Ga ng i wsp . 2 0 0 8 [3 0 ] TABELA 1 . P o ró wna nie wyb ra nyc h p o p ula c ji k o mó re k ma c ie rzystyc h p o d wzglê d e m p o te nc ja ³u mio ge nic zne go . Wyt³uszc zo ne na zwy ro d za jó w k o mó re k wsk a zuj¹ te , k tó re w c hwili o b e c ne j b ud z¹ na jwiê k sze na d zie je na za sto so wa nie w te ra p ii c ho ró b miê ni szk ie le to wyc h TABLE 1 . C o mp a riso n o f myo ge nic p o te ntia l o f se le c te d typ e s o f ste m c e lls. N a me s in b o ld ind ic a te tho se typ e s o f c e lls tha t c urre ntly a re c o nsid e re d to b e the b e st so urc e o f c e lls in the the ra p y fo r sk e le ta l musc le d ise a se s Za le ty Wa d y Lite ra tura KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊNI 197 198 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA satelitowych i ekspresji markerów miogenicznych, takich jak: Myf-5, integryna a7 i c-Met [47]. Komórki syntetyzuj¹ce GFP (komórki dawcy), które wyizolowano z miêni myszy biorczyñ, by³y zdolne do podjêcia ró¿nicowania in vitro i utworzenia wieloj¹drowych miotub. W 2003 roku opublikowano wyniki dowiadczeñ, w których do uszkodzonych miêni szkieletowych wprowadzono wy³¹cznie wyselekcjonowane, hematopoetyczne komórki macierzyste, a nie mieszaninê wszystkich komórek izolowanych ze szpiku kostnego, jak poprzednio. Camargo i wspó³pracownicy oraz Corbel i wspó³pracownicy niezale¿nie wykazali, ¿e pojedyncza komórka HSC wprowadzona do organizmu biorcy wykazuje nie tylko potencja³ hematopoetyczny, ale tak¿e miogeniczny. Wywodz¹ce siê z niej komórki potomne zasiedla³y uszkodzony miêsieñ szkieletowy i bra³y udzia³ w tworzeniu hybrydowych w³ókien, jednak nie by³y zdolne ani do zasiedlenia niszy komórek satelitowych, ani do przekszta³cenia w funkcjonalne mioblasty. Zdaniem Camargo i wspó³pracowników komórki te bra³y udzia³ w regeneracji wy³¹cznie dziêki fuzji z komórkami biorcy podczas tworzenia nowych w³ókien miêniowych [47]. Obserwacje te zosta³y rozszerzone o wyniki innych badañ, które dowiod³y, ¿e mimo i¿ HSC s¹ zdolne do zasiedlania uszkodzonego miênia, to jednak proces ten zachodzi z nisk¹ czêstoci¹. HSC wykryte w niszy komórek satelitowych by³y, w przeciwieñstwie do uprzednio opisanych badañ, niefunkcjonalne [57, 58]. Wyniki te zakwestionowa³y sens prowadzenia terapii z wykorzystaniem hematopoetycznych komórek macierzystych. Pomimo to ci¹gle prowadzone s¹ badania powiêcone ustaleniu optymalnych warunków transplantacji komórek macierzystych ze szpiku kostnego do miêni szkieletowych, choæ uzyskiwane wyniki s¹ nadal niesatysfakcjonuj¹ce [1, 2, 38, 40]. Mo¿e warto wiêc pamiêtaæ o hipotezie Sherwooda i wspó³pracowników mówi¹cej o tym, ¿e jeli jakie komórki obecne w szpiku kostnym maj¹ potencja³ miogeniczny, to nie s¹ to z pewnoci¹ HSC, a z du¿ym prawdopodobieñstwem mezenchymalne komórki macierzyste [58]. b. Mezenchymalne komórki macierzyste Mezenchymalne komórki macierzyste po raz pierwszy zidentyfikowano w szpiku kostnym. Obecne s¹ one w wielu tkankach zarówno zarodkowych, jak i doros³ych organizmów, a tak¿e we krwi pêpowinowej i p³ynie owodniowym [11, 39]. Komórki te s¹ wiêc ³atwiej dostêpne ni¿ np. komórki macierzyste szpiku kostnego. Wiadomo równie¿, ¿e MSC mog¹ ró¿nicowaæ w wiele tkanek pochodzenia mezodermalnego, w tym np. tkankê t³uszczow¹, chrz¹stkê czy koæ. W 1995 roku po raz pierwszy stwierdzono, ¿e wykazuj¹ one tak¿e potencja³ miogeniczny. Badania przeprowadzone przez grupê pod kierownictwem Caplana wykaza³y, ¿e MSC wyizolowane ze szpiku kostnego szczura i hodowane w obecnoci 5-AzaC ró¿nicuj¹ w mioblasty, syntetyzuj¹ specyficzne miêniowo czynniki, takie jak np. miozyna, oraz tworz¹ wieloj¹drowe, spontanicznie kurcz¹ce siê miotuby [11]. Ci sami naukowcy wykazali te¿, ¿e komórki te hodowane z mioblastami tworz¹ hybrydowe miotuby, a po wprowadzeniu MSC do miêni myszy mdx zaobserwowano nie tylko wzrost masy miêni, ale tak¿e ekspresjê dystrofiny w nowopowstaj¹cych w³óknach. Zdaniem autorów wiadczy³o KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊNI 199 to o tym, ¿e w populacji MSC znajduj¹ siê komórki zdolne do ró¿nicowania w mioblasty [11]. W roku 2002 i 2003 de Bari i wspó³pracownicy stwierdzili, ¿e ludzkie MSC wyizolowane z b³ony maziowej i wprowadzone do miêni myszy SCID-mdx s¹ zdolne do ekspresji jedynie jednego markera miogenicznego Myf-5. Pomimo to komórki te uczestniczy³y w tworzeniu 60% nowopowsta³ych w³ókien, a tak¿e zasiedli³y niszê charakterystyczn¹ dla komórek satelitowych. Tak¿e MSC izolowane z krwi pêpowinowej, p³ynu owodniowego oraz krwi p³odowej ró¿nicuj¹ i tworz¹ w³ókna miêniowe w odpowiedzi na czynniki, takie jak: 5-azaC, sterydy, surowica koñska czy wydzielana przez ró¿nicuj¹ce mioblasty galektyna [13, 24, 31]. We wszystkich przypadkach hodowane komórki syntetyzowa³y charakterystyczne dla miêni szkieletowych bia³ka. Dla zrozumienia mechanizmu udzia³u MSC w regeneracji miêni istotne by³o znalezienie odpowiedzi na pytanie, czy ich ró¿nicowanie jest wynikiem autonomicznej reakcji na stosowane bodce, czy te¿ wi¹¿e siê z fuzj¹ tych komórek z mioblastami i ich w³¹czaniem do tworz¹cych siê miotub i w³ókien miêniowych. Wyniki uzyskane przez grupê kierowan¹ przez Brauna wiadczy³y o tym, ¿e MSC hodowane w obecnoci komórek wydzielaj¹cych czynniki istotne dla ró¿nicowania komórek miêniowych, takie jak Wnt7a czy Wnt11 s¹ zdolne do podjêcia ró¿nicowania, ale samodzielnie nie s¹ w stanie utworzyæ funkcjonalnych komórek miêniowych, a ich pe³ne ró¿nicowanie wymaga kontaktu i fuzji z mioblastami [6, 56]. Hipoteza Brauna i wspó³pracowników mówi¹ca o niemo¿noci pe³nego i niezale¿nego od fuzji z mioblastami ró¿nicowania macierzystych komórek mezenchymalnych wydaje siê byæ jednak sprzeczna z obserwacjami innych grup badawczych, m.in. Dezawy i wspó³pracowników oraz Ganga i wspó³pracowników. Wykazali oni, ¿e w hodowanych in vitro MSC, w których doprowadzono do nadekspresji czynników reguluj¹cych miogenezê, takich jak Notch1 i Pax3, dochodzi do ekspresji zarówno markerów charakterystycznych dla wczesnych (MyoD, Myf-5), jak i pónych stadiów ró¿nicowania mioblastów (miogenina, ciê¿kie ³añcuchy miozyny [25, 30]). Komórki te tworzy³y tak¿e zdolne do spontanicznych skurczów wieloj¹drowe miotuby. Warto zaznaczyæ, ¿e w populacji ró¿nicuj¹cych MSC obecne by³y tak¿e takie, które syntetyzowa³y markery komórek satelitowych Pax7, Myf-5 i c-Met, co jest niezwykle istotnym parametrem wiadcz¹cym o potencjale miogenicznym badanych komórek [25, 30]. Oprócz wyników dowiadczeñ przeprowadzonych in vitro, niezwykle obiecuj¹ce dla opracowania metod potencjalnej terapii s¹ równie¿ rezultaty badañ prowadzonych w warunkach in vivo. Dezawa i wspó³pracownicy wykazali, ¿e MSC zaindukowane do ró¿nicowania w komórki miêniowe przez nadekspresjê bia³ka Notch-1, a nastêpnie wprowadzone do regeneruj¹cych miêni, by³y wykrywane w 3040% zregenerowanych w³ókien [25]. Komórki te zasiedla³y tak¿e niszê komórek satelitowych i co istotne bra³y udzia³ w kolejnych rundach regeneracji. W regeneracji miêni szkieletowych myszy SCID mog¹ uczestniczyæ równie¿ ludzkie komórki krwi pêpowinowej, które po wstrzykniêciu do uszkodzonych mechanicznie miêni szkieletowych bior¹ udzia³ w budowie oko³o 10% nowych w³ókien miêniowych i zasiedlaj¹ 200 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA nisze charakterystyczne dla komórek satelitowych [9]. Udowodniony potencja³ miogeniczny oraz mo¿liwoæ pozyskania mezenchymalnych komórek macierzystych z ró¿nych róde³ czyni z nich potencjalne ród³o materia³u do przeszczepów. c. Komórki macierzyste pochodz¹ce z naczyñ krwiononych Oprócz MSC, du¿e nadzieje na wykorzystanie w leczeniu dystrofii i poprawie regeneracji miêni szkieletowych budz¹ komórki macierzyste pochodz¹ce z naczyñ krwiononych, tj. mezangioblasty oraz komórki syntetyzuj¹ce CD133 i okrelane jako AC133+. Pierwsze z nich, mezangioblasty, opisano po raz pierwszy w 1999 roku jako syntetyzuj¹ce markery endotelialne i miogeniczne komórki obecne w cianie aorty grzbietowej rozwijaj¹cego siê zarodka myszy [18]. Hodowane in vitro mezangioblasty nie ró¿ni¹ siê morfologi¹ od mioblastów, poza tym syntetyzuj¹ one m.in. MyoD, Myf-5 oraz M-kadherynê i s¹ zdolne do fuzji z mioblastami. Najistotniejsze jest jednak to, ¿e wprowadzenie mezangioblastów do krwioobiegu myszy lub psów cierpi¹cych na dystrofiê prowadzi do ich rozleg³ej migracji w miêniach poprzez system kapilar, dziêki czemu s¹ one wykrywane nawet w 70% w³ókien [52]. Obecnoæ mezangioblastów w dystroficznych miêniach doprowadzi³a do poprawy funkcji zasiedlonej tkanki, co stwierdzono miêdzy innymi na podstawie analizy si³y skurczów miêni [18]. Poprzedzaj¹ca przeszczep ekspozycja mezangioblastów na stromalny czynnik wzrostu (SDF-1), przy równoczesnej nadekspresji L-selektyny w tych komórkach, zwiêkszy³a ich zdolnoæ do migracji i adhezji. W konsekwencji po wprowadzeniu do organizmu komórki te bra³y udzia³ w budowie ponad 80% w³ókien miêniowych [29]. Przytoczone wyniki badañ czyni¹ z mezangioblastów jeden z najbardziej obiecuj¹cych rodzajów komórek mo¿liwych do wykorzystania w terapii dysfunkcjonalnych miêni szkieletowych. Ci¹gle jednak istnieje potrzeba opracowania wydajnej i wysoce selektywnej metody izolacji tych komórek. Pozwoli³oby to na odrzucenie zarzutów o mo¿liwej kontaminacji populacji mezangioblastów przez inne komórki, a tak¿e o wp³ywie stosowanych przez autorów leków immunosupresyjnych na poprawê funkcjonowania miêni dystroficznych [8, 21, 48]. Inn¹ grup¹ komórek zwi¹zan¹ z naczyniami krwiononymi s¹ komórki syntetyzuj¹ce bia³ko powierzchniowe CD133 i okrelane jako komórki AC133+. Komórki te obecne s¹ m.in. w krwi obwodowej, szpiku kostnym, nerkach, trzustce, krwi pêpowinowej oraz p³odowej w¹trobie. Wykazuj¹ one zdolnoæ do wielokierunkowego ró¿nicowania, m.in. w komórki linii hematopoetycznej, ródb³onkowej i neuronalnej [41]. Komórki AC133+ hodowane z mioblastami s¹ tak¿e zdolne do rozpoczêcia ró¿nicowania miogenicznego wyra¿anego ekspresj¹ takich czynników, jak: Pax7, Myf5, M-kadheryna i CD34 [64]. Wprowadzenie ich do krwioobiegu myszy mdx doprowadzi³o do znacz¹cej poprawy regeneracji dystroficznych miêni, utworzenia przez komórki AC133 w³ókien syntetyzuj¹cych dystrofinê oraz zasiedlenia przez nie niszy komórek satelitowych. Ich obecnoæ w miêniach wp³ynê³a tak¿e na wzrost si³y skurczu miêni [64]. Potencja³ miogeniczny komórek AC133+ zosta³ potwierdzony w kolejnych badaniach, które wykaza³y miêdzy innymi, ¿e wzrost ekspresji odpowiedzialnego za adhezjê bia³ka VCAM-1 (ang. vascular cell adhesion KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊNI 201 molecule-1) w miêniach szkieletowych, wywo³any wysi³kiem fizycznym, czterokrotnie zwiêkszy³ liczbê w³ókien miêniowych powsta³ych przy udziale komórek AC133+ [32]. Obecnoæ komórek AC133+ w regeneruj¹cych miêniach wp³ynê³a na przyspieszenie procesu rekonstrukcji miêni przez ograniczenie rozwoju fibrozy oraz lepsze ukrwienie regeneruj¹cego miênia [59]. Zdolnoæ komórek AC133+ oraz mezangioblastów do migracji w naczyniach krwiononych umo¿liwiaj¹ca im zasiedlenie niemal wszystkich miêni szkieletowych, a tak¿e wp³yw tych komórek na poprawê struktury i fizjologii miêni szkieletowych sprawiaj¹, ¿e s¹ one uwa¿ane za najpowa¿niejszych kandydatów do wykorzystania w terapii komórkowej dystrofii miêniowych. d. Zarodkowe komórki macierzyste Zarodkowe komórki macierzyste komórki ES (ang. embryonic stem cells) s¹ komórkami pluripotencjalnymi, zdolnymi do ró¿nicowania we wszystkie linie komórek i tkanek buduj¹cych organizm. Stosuj¹c odpowiednie warunki hodowli in vitro mo¿na sprawiæ, ¿e bêd¹ one tworzy³y trójwymiarowe agregaty okrelane jako kule zarodkowe, zbudowane z ekto-, endo- i mezodermy. In vivo, po wprowadzeniu komórek ES np. pod skórê myszy SCID, przejawem ich pluripotencji jest tworzenie teratom, czyli ³agodnych guzów nowotworowych zawieraj¹cych ró¿ne rodzaje tkanek. W teratomach znajdowane s¹ równie¿ komórki wykazuj¹ce ekspresjê genów charakterystycznych dla tkanki miêniowej szkieletowej [66]. Sugeruje to, ¿e komórki ES maj¹ potencja³ miogeniczny, pomimo ¿e utrzymywane w stanie niezró¿nicowanym nie syntetyzuj¹ czynników miêniowych [4, 5, 14, 20, 36, 63, 70]. Po raz pierwszy obecnoæ komórek eksprymuj¹cych czynniki MRF zosta³a stwierdzona w kulach zarodkowych w 1994 roku przez Rohwedela i wspó³pracowników. Analiza ta by³a oparta jedynie na obserwacji zmian morfologii komórek oraz wykrywaniu transkryptów MRF metod¹ RT-PCR, co sta³o siê podstaw¹ w¹tpliwoci podnoszonych przez inne grupy badawcze. Badania przeprowadzone w ostatnich latach wykaza³y bowiem, ¿e komórki buduj¹ce kule zarodkowe nie s¹ zdolne do samodzielnego rozpoczêcia ró¿nicowania w mioblasty [19, 54] lub te¿ ró¿nicowanie takie zachodzi bardzo sporadycznie [63, 70]. Indukcja ró¿nicowania w mioblasty by³a mo¿liwa dopiero po zastosowaniu dodatkowego czynnika (np. sperminy lub 5-AzaC) [54, 70]. Jednak uzyskane w ten sposób komórki syntetyzuj¹ tylko niektóre markery miogeniczne i fuzjuj¹ z nisk¹ czêstoci¹, co stawia pod znakiem zapytania ich funkcjonalnoæ. Inna strategia indukcji ró¿nicowania miogenicznego komórek ES zosta³a wykorzystana przez Barberi'ego i wspó³pracowników. Hodowali oni ludzkie komórki ES w kokulturze z komórkami zrêbu szpiku, które wydzielaj¹ czynniki promuj¹ce ró¿nicowanie w mezodermê. Po 6 tygodniach sporód hodowanych komórek wyselekcjonowano te, które syntetyzowa³y charakterystyczne dla komórek mezodermalnych bia³ko CD73, a nastêpnie hodowano je w warunkach umo¿liwiaj¹cych ich ró¿nicowanie w mioblasty. Uzyskane komórki nie by³y jednak zdolne do podjêcia takiego ró¿nicowania nie wykryto w nich obecnoci ¿adnych markerów miogenicznych, ani nie zaobserwowano zmian morfologii. Dopiero hodowla komórek CD73+ 202 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA w obecnoci mioblastów linii komórkowej C2C12 lub inkubacja z 5-AzaC zaindukowa³y ekspresjê myoD i miogeniny [5]. Modyfikacja procedury dowiadczenia o dodatkow¹ selekcjê komórek, które syntetyzowa³y charakterystyczne m.in. dla komórek satelitowych i ró¿nicuj¹cych mioblastów bia³ko N-CAM (ang. neural cell adhesion molecule), przynios³a lepsze wyniki. Po 6 tygodniach hodowli od 2 do 10% komórek komórek CD73+ i N-CAM+ syntetyzowa³o markery miogeniczne [4]. Wyselekcjonowane w ten sposób komórki wykrywano jeszcze po 6 miesi¹cach od ich wprowadzenia do uszkodzonych miêni szkieletowych myszy SCID [4]. Najlepsze rezultaty w uzyskiwaniu komórek miêniowych z komórek ES otrzymano w wyniku nadekspresji okrelonych czynników w komórkach ES. Nadekspresja insulinopodobnego czynnika wzrostu II IGFII (ang. insulin-like growth factor-II), wydzielanego przez ró¿nicuj¹ce mioblasty zarówno w hodowli in vitro, jak i w regeneruj¹cym miêniu szkieletowym, doprowadzi³a do rozpoczêcia syntezy MyoD, Myf5, miogeniny i M-kadheryny. Komórki, w których zaindukowano zwiêkszon¹ ekspresjê igfII, by³y zdolne do fuzji i utworzenia wieloj¹drowych, kurcz¹cych siê miotub [36, 66]. Natomiast nadekspresja genu pax3 doprowadzi³a do zmiany morfologii zarodkowych komórek macierzystych oraz do ekspresji czynników miogenicznych [19]. Potencja³ miogeniczny komórek ES zosta³ tak¿e poddany ocenie w warunkach in vivo. Bhagavati i Xu przeprowadzili dowiadczenia, w których wykorzystano komórki ES hodowane uprzednio przez kilka dni z mioblastami. Procedura ta mia³a zaindukowaæ ró¿nicowanie komórek ES w mioblasty. Dowodem na potencja³ miogeniczny tych komórek mia³ byæ ich udzia³ w regeneracji miêni myszy mdx i obecnoæ w³ókien, w których stwierdzono syntezê dystrofiny [7]. Jednak liczba w³ókien zawieraj¹cych dystrofinê by³a bardzo ma³a i mog³a byæ wynikiem tzw. spontanicznego odwrócenia mutacji. Zjawisko to obserwowane jest u myszy mdx, u których pomimo mutacji w genie koduj¹cym dystrofinê sporadycznie wykrywa siê obecnoæ tego bia³ka w miêniach [67]. Transplantacja wstêpnie zró¿nicowanych komórek ES do miêni szkieletowych, a nastêpnie ocena skutków takiego zabiegu zosta³a przeprowadzona tak¿e przez kilka innych grup badawczych. Wprowadzenie komórek ES, w których najpierw zaindukowano ekspresjê igfII, wp³ynê³o na poprawê funkcji motorycznych regeneruj¹cych miêni ju¿ po 14 dniach od zabiegu [36]. Transplantowane komórki syntetyzowa³y specyficzne miêniowo czynniki oraz receptory acetylocholiny, co wiadczy³o o dojrzewaniu utworzonych w³ókien miêniowych oraz tworzeniu funkcjonalnych p³ytek motorycznych. W miêniach, do których wprowadzono komórki ES zaindukowane do ró¿nicowania przez nadekspresjê genu pax3, czêstoæ wystêpowania w³ókien zasiedlonych przez te komórki wynios³a 1020% [19]. Mimo ¿e wprowadzone do miênia komórki syntetyzowa³y M-kadherynê, syndekan-4 i CD34, markery komórek satelitowych, to transplantowanych komórek nie wykryto w niszy komórek satelitowych. Zasiedlenie niszy komórek satelitowych stwierdzono w innych dowiadczeniach, w których wykorzystano komórki ES uprzednio zaindukowane do ró¿nicowania przez hodowlê w obecnoci epidermal-nego czynnika wzrostu, 5-azaC lub surowicy koñskiej [14, 70]. Komórki KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊNI 203 takie by³y zdolne do syntezy markerów komórek satelitowych, takich jak: Pax7, Myf-5, c-Met, M-kadheryna, i bra³y udzia³ w kolejnych rundach regeneracji, mimo i¿ zasiedla³y niszê komórek satelitowych z nisk¹ czêstoci¹. Przeszczepianie do miêni wstêpnie zró¿nicowanych komórek znacz¹co zwiêksza mo¿liwoæ wykorzystania komórek ES w terapii chorób miêni. Do najpowa¿niejszych problemów stoj¹cych przed badaczami oceniaj¹cymi szanse na wykorzystanie komórek ES w medycynie regeneracyjnej jest zagro¿enie zwi¹zane z powstawaniem w organizmie biorcy teratom, problemy zwi¹zane z usuwaniem przeszczepionych komórek w wyniku reakcji immunologicznej oraz budz¹ce zastrze¿enia natury etycznej zarodkowe pochodzenie komórek ES. Tworzenie teratom u myszy, którym wszczepiono komórki ES, stwierdzono tylko w nielicznych przypadkach, gdy niezró¿nicowane komórki by³y przeszczepiane do tkanek myszy z upoledzonym uk³adem odpornoci [19, 63]. Jednak w wiêkszoci opisanych badañ, w których wykorzystywano wstêpnie zró¿nicowane komórki ES, nie zaobserwowano rozwoju guzów [4, 14, 70]. Wed³ug Tiana i wspó³pracowników brak teratom w organizmie niepoddawanego immunosupresji, allogenicznego biorcy wiadczy o usuniêciu tych komórek z zasiedlonego miênia w wyniku odpowiedzi immunologicznej [63]. Jednak w dwóch niezale¿nych badaniach potwierdzono obecnoæ komórek ES w miêniach biorcy pomimo wykorzystania w dowiadczeniu uk³adu allogenicznego [14, 36]. Trzeba jednak wspomnieæ, ¿e Autorzy pierwszej pracy nie podali czêstoci wystêpowania tych komórek, w drugiej pracy opisano, ¿e by³y one obecne jedynie w 1% wszystkich w³ókien. Zatem mimo obiecuj¹cych wyników przeprowadzonych do tej pory badañ, ci¹gle istnieje wiele niewiadomych dotycz¹cych mo¿liwoci ró¿nicowania komórek ES w warunkach in vitro i in vivo, a tak¿e oceny skutków transplantacji tych komórek do organizmu biorcy. W 2006 roku z fibroblastów uzyskano indukowane komórki pluripotencjalne iPS (ang. induced pluripotent stem [62]). W kolejnych latach komórki takie otrzymano tak¿e z innych rodzajów komórek [55]. Poniewa¿ pochodzenie komórek iPS jak dotychczas nie budzi w¹tpliwoci natury etycznej, nale¿y rozwa¿aæ je jako nowe ród³o komórek, które mog³yby w przysz³oci wspomagaæ regeneracjê miêni szkieletowych. Ze wzglêdu na wiele cech wspólnych w badaniach komórek iPS wykorzystywana jest wiedza uzyskana z badañ nad komórkami ES. Stwarza to nadziejê na szybki postêp badañ, a co za tym idzie identyfikacjê czynników, które pozwoli³yby nie tylko wydajnie uzyskiwaæ z komórek pluripotencjalnych komórki miêniowe, ale tak¿e dok³adnie przeanalizowaæ mechanizmy ich ró¿nicowania. 5. PODSUMOWANIE Jednym z najbardziej fascynuj¹cych aspektów badañ nad biologi¹ komórek macierzystych jest szansa na opracowanie nowych terapii chorób, których do tej pory nie mo¿na by³o skutecznie leczyæ. Prace badawcze nad zastosowaniem komórek 204 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA macierzystych jako potencjalnego ród³a komórek do wspomagania regeneracji miêni szkieletowych s¹ prowadzone od wielu lat i w wielu laboratoriach. Przytoczone powy¿ej wyniki badañ przyczyni³y siê do lepszego poznania ró¿nych populacji komórek, dziêki czemu byæ mo¿e niektóre z nich (np. mezenchymalne komórki macierzyste) znajd¹ w przysz³oci zastosowanie w leczeniu chorób miêni. Jednak¿e pomimo prowadzenia intensywnych analiz wiele pytañ dotycz¹cych udzia³u niemiêniowych komórek macierzystych w regeneracji miêni szkieletowych pozostaje bez odpowiedzi. 6. LITERATURA [1] ABEDI M, FOSTER BM, WOOD KD, COLVIN GA, MCLEAN SD, JOHNSON KW, GREER DA. Haematopoietic stem cells participate in muscle regeneration. Br J Haematol 2007; 138: 792801. [2] ABEDI M, GREER DA, FOSTER BM, COLVIN GA, HARPEL JA, DEMERS DA, PIMENTEL J, DOONER MS, QUESENBERRY PJ. Critical variables in the conversion of marrow cells to skeletal muscle. Blood 2005; 106: 14881494. [3] BANKS GB, CHAMBERLAIN JS. The value of mammalian models for duchenne muscular dystrophy in developing therapeutic strategies. Curr Top Dev Biol 2008; 84: 431453. [4] BARBERI T, BRADBURY M, DINCER Z, PANAGIOTAKOS G, SOCCI ND, STUDER L. Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells. Nat Med 2007; 13: 642648. [5] BARBERI T, WILLIS LM, SOCCI ND, STUDER L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Med 2005; 2: e161. [6] BEDADA FB, BRAUN T. Partial induction of the myogenic program in noncommitted adult stem cells. Cells Tissues Organs 2008; 188: 189201. [7] BHAGAVATI S, XU W. Generation of skeletal muscle from transplanted embryonic stem cells in dystrophic mice. Biochem Biophys Res Commun 2005; 333: 644649. [8] BRUNELLI S, SCIORATI C, D'ANTONA G, INNOCENZI A, COVARELLO D, GALVEZ BG, PERROTTA C, MONOPOLI A, SANVITO F, BOTTINELLI R, ONGINI E, COSSU G, CLEMENTI E. Nitric oxide release combined with nonsteroidal antiinflammatory activity prevents muscular dystrophy pathology and enhances stem cell therapy. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 264269. [9] BRZOSKA E, GRABOWSKA I, HOSER G, STREMINSKA W, WASILEWSKA D, MACHAJ EK, POJDA Z, MORACZEWSKI J, KAWIAK J. Participation of stem cells from human cord blood in skeletal muscle regeneration of SCID mice. Exp Hematol 2006; 34: 12621270. [10] CAMARGO FD, GREEN R, CAPETANAKI Y, JACKSON KA, GOODELL MA. Single hematopoietic stem cells generate skeletal muscle through myeloid intermediates. Nat Med 2003; 9: 15201527. [11] CAPLAN AI. Why are MSCs therapeutic? New data: new insight. J Pathol 2009; 217: 318324. [12] CERLETTI M, JURGA S, WITCZAK CA, HIRSHMAN MF, SHADRACH JL, GOODYEAR LJ, WAGERS AJ. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell 2008; 134: 3747. [13] CHAN J, O'DONOGHUE K, GAVINA M, TORRENTE Y, KENNEA N, MEHMET H, STEWART H, WATT DJ, MORGAN JE, FISK NM. Galectin-1 induces skeletal muscle differentiation in human fetal mesenchymal stem cells and increases muscle regeneration. Stem Cells 2006; 24: 18791891. [14] CHANG H, YOSHIMOTO M, UMEDA K, IWASA T, MIZUNO Y, FUKADA S, YAMAMOTO H, MOTOHASHI N, MIYAGOE-SUZUKI Y, TAKEDA S, HEIKE T, NAKAHATA T. Generation of transplantable, functional satellite-like cells from mouse embryonic stem cells. Faseb J 2009; 23: 1907 1919. [15] CHARGE SB, RUDNICKI MA. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev 2004; 84: 209238. [16] COLLINS CA, OLSEN I, ZAMMIT PS, HESLOP L, PETRIE A, PARTRIDGE TA, MORGAN JE. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell 2005; 122: 289301. KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊNI 205 [17] CORBEL SY, LEE A, YI L, DUENAS J, BRAZELTON TR, BLAU HM, ROSSI FM. Contribution of hematopoietic stem cells to skeletal muscle. Nat Med 2003; 9: 15281532. [18] COSSU G, SAMPAOLESI M. New therapies for muscular dystrophy: cautious optimism. Trends Mol Med 2004; 10: 516520. [19] DARABI R, GEHLBACH K, BACHOO RM, KAMATH S, OSAWA M, KAMM KE, KYBA M, PERLINGEIRO RC. Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells. Nat Med 2008; 14: 134143. [20] DARABI R, SANTOS FN, PERLINGEIRO RC. The therapeutic potential of embryonic and adult stem cells for skeletal muscle regeneration. Stem Cell Rev 2008; 4: 217225. [21] DAVIES KE, GROUNDS MD. Treating muscular dystrophy with stem cells? Cell 2006; 127: 13041306. [22] DE ANGELIS L, BERGHELLA L, COLETTA M, LATTANZI L, ZANCHI M, CUSELLA-DE ANGELIS MG, PONZETTO C, COSSU G. Skeletal myogenic progenitors originating from embryonic dorsal aorta coexpress endothelial and myogenic markers and contribute to postnatal muscle growth and regeneration. J Cell Biol 1999; 147: 869878. [23] DE BARI C, DELL'ACCIO F, VANDENABEELE F, VERMEESCH JR, RAYMACKERS JM, LUYTEN FP. Skeletal muscle repair by adult human mesenchymal stem cells from synovial membrane. J Cell Biol 2003; 160: 909918. [24] DE COPPI P, BARTSCH G, JR., SIDDIQUI MM, XU T, SANTOS CC, PERIN L, MOSTOSLAVSKY G, SERRE AC, SNYDER EY, YOO JJ, FURTH ME, SOKER S, ATALA A. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotechnol 2007; 25: 100106. [25] DEZAWA M, ISHIKAWA H, ITOKAZU Y, YOSHIHARA T, HOSHINO M, TAKEDA S, IDE C, NABESHIMA Y. Bone marrow stromal cells generate muscle cells and repair muscle degeneration. Science 2005; 309: 314317. [26] EMERY AE. The muscular dystrophies. Lancet 2002; 359: 687695. [27] FERRARI G, MAVILIO F. Myogenic stem cells from the bone marrow: a therapeutic alternative for muscular dystrophy? Neuromuscul Disord 2002; 12 Suppl 1: S710. [28] FLETCHER JE, HUBERT M, WIELAND SJ, GONG QH, JIANG MS. Similarities and differences in mechanisms of cardiotoxins, melittin and other myotoxins. Toxicon 1996; 34: 13011311. [29] GALVEZ BG, SAMPAOLESI M, BRUNELLI S, COVARELLO D, GAVINA M, ROSSI B, CONSTANTIN G, TORRENTE Y, COSSU G. Complete repair of dystrophic skeletal muscle by mesoangioblasts with enhanced migration ability. J Cell Biol 2006; 174: 231243. [30] GANG EJ, BOSNAKOVSKI D, SIMSEK T, TO K, PERLINGEIRO RC. Pax3 activation promotes the differentiation of mesenchymal stem cells toward the myogenic lineage. Exp Cell Res 2008; 314: 1721 1733. [31] GANG EJ, JEONG JA, HONG SH, HWANG SH, KIM SW, YANG IH, AHN C, HAN H, KIM H. Skeletal myogenic differentiation of mesenchymal stem cells isolated from human umbilical cord blood. Stem Cells 2004; 22: 617624. [32] GAVINA M, BELICCHI M, ROSSI B, OTTOBONI L, COLOMBO F, MEREGALLI M, BATTISTELLI M, FORZENIGO L, BIONDETTI P, PISATI F, PAROLINI D, FARINI A, ISSEKUTZ AC, BRESOLIN N, RUSTICHELLI F, CONSTANTIN G, TORRENTE Y. VCAM-1 expression on dystrophic muscle vessels has a critical role in the recruitment of human blood-derived CD133+ stem cells after intra-arterial transplantation. Blood 2006; 108: 28572866. [33] HAWLEY RG, SOBIESKI DA. Of mice and men: the tale of two therapies. Stem Cells 2002; 20: 275 278. [34] HIPP J, ATALA A. Sources of stem cells for regenerative medicine. Stem Cell Rev 2008; 4: 311. [35] ITO M, KOBAYASHI K, NAKAHATA T. NOD/Shi-scid IL2rgamma(null) (NOG) mice more appropriate for humanized mouse models. Curr Top Microbiol Immunol 2008; 324: 5376. [36] KAMOCHI H, KUROKAWA MS, YOSHIKAWA H, UEDA Y, MASUDA C, TAKADA E, WATANABE K, SAKAKIBARA M, NATUKI Y, KIMURA K, BEPPU M, AOKI H, SUZUKI N. Transplantation of myocyte precursors derived from embryonic stem cells transfected with IGFII gene in a mouse model of muscle injury. Transplantation 2006; 82: 516526. [37] LUNN MR, WANG CH. Spinal muscular atrophy. Lancet 2008; 371: 21202133. [38] LUTH ES, JUN SJ, WESSEN MK, LIADAKI K, GUSSONI E, KUNKEL LM. Bone marrow side population cells are enriched for progenitors capable of myogenic differentiation. J Cell Sci 2008; 121: 1426 1434. [39] MARKERT CD, ATALA A, CANN JK, CHRIST G, FURTH M, AMBROSIO F, CHILDERS MK. Mesenchymal stem cells: emerging therapy for Duchenne muscular dystrophy. Pm R 2009; 1: 547559. 206 K. ARCHACKA, J. MORACZEWSKI, I. GRABOWSKA [40] MATZIOLIS G, WINKLER T, SCHASER K, WIEMANN M, KROCKER D, TUISCHER J, PERKA C, DUDA GN. Autologous bone marrow-derived cells enhance muscle strength following skeletal muscle crush injury in rats. Tissue Eng 2006; 12: 361367. [41] MIZRAK D, BRITTAN M, ALISON MR. CD133: molecule of the moment. J Pathol 2008; 214: 39. [42] MONTARRAS D, MORGAN J, COLLINS C, RELAIX F, ZAFFRAN S, CUMANO A, PARTRIDGE T, BUCKINGHAM M. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science 2005; 309: 20642067. [43] NICOLE S, DESFORGES B, MILLET G, LESBORDES J, CIFUENTES-DIAZ C, VERTES D, CAO ML, DE BACKER F, LANGUILLE L, ROBLOT N, JOSHI V, GILLIS JM, MELKI J. Intact satellite cells lead to remarkable protection against Smn gene defect in differentiated skeletal muscle. J Cell Biol 2003; 161: 571582. [44] NICOLE S, DIAZ CC, FRUGIER T, MELKI J. Spinal muscular atrophy: recent advances and future prospects. Muscle Nerve 2002; 26: 413. [45] OUSTANINA S, HAUSE G, BRAUN T. Pax7 directs postnatal renewal and propagation of myogenic satellite cells but not their specification. Embo J 2004; 23: 34303439. [46] PEAULT B, RUDNICKI M, TORRENTE Y, COSSU G, TREMBLAY JP, PARTRIDGE T, GUSSONI E, KUNKEL LM, HUARD J. Stem and progenitor cells in skeletal muscle development, maintenance, and therapy. Mol Ther 2007; 15: 867877. [47] PRICE FD, KURODA K, RUDNICKI MA. Stem cell based therapies to treat muscular dystrophy. Biochim Biophys Acta 2007; 1772: 272283. [48] RADLEY HG, DE LUCA A, LYNCH GS, GROUNDS MD. Duchenne muscular dystrophy: focus on pharmaceutical and nutritional interventions. Int J Biochem Cell Biol 2007; 39: 469477. [49] ROHWEDEL J, MALTSEV V, BOBER E, ARNOLD HH, HESCHELER J, WOBUS AM. Muscle cell differentiation of embryonic stem cells reflects myogenesis in vivo: developmentally regulated expression of myogenic determination genes and functional expression of ionic currents. Dev Biol 1994; 164: 87101. [50]. SACCO A, DOYONNAS R, KRAFT P, VITOROVIC S, BLAU HM. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature 2008; 456: 502506. [51] SALAH-MOHELLIBI N, MILLET G, ANDRE-SCHMUTZ I, DESFORGES B, OLASO R, ROBLOT N, COURAGEOT S, BENSIMON G, CAVAZZANA-CALVO M, MELKI J. Bone marrow transplantation attenuates the myopathic phenotype of a muscular mouse model of spinal muscular atrophy. Stem Cells 2006; 24: 27232732. [52] SAMPAOLESI M, BLOT S, D'ANTONA G, GRANGER N, TONLORENZI R, INNOCENZI A, MOGNOL P, THIBAUD JL, GALVEZ BG, BARTHELEMY I, PERANI L, MANTERO S, GUTTINGER M, PANSARASA O, RINALDI C, CUSELLA DE ANGELIS MG, TORRENTE Y, BORDIGNON C, BOTTINELLI R, COSSU G. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature 2006; 444: 574579. [53] SAMPAOLESI M, TORRENTE Y, INNOCENZI A, TONLORENZI R, D'ANTONA G, PELLEGRINO MA, BARRESI R, BRESOLIN N, DE ANGELIS MG, CAMPBELL KP, BOTTINELLI R, COSSU G. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science 2003; 301: 487492. [54] SASAKI T, MATSUOKA H, SAITO M. Generation of a multi-layer muscle fiber sheet from mouse ES cells by the spermine action at specific timing and concentration. Differentiation 2008; 76: 10231030. [55] SCHEPER W, COPRAY S. The molecular mechanism of induced pluripotency: a two-stage switch. Stem Cell Rev Rep 2009; 5: 204223. [56] SCHULZE M, BELEMA-BEDADA F, TECHNAU A, BRAUN T. Mesenchymal stem cells are recruited to striated muscle by NFAT/IL-4-mediated cell fusion. Genes Dev 2005; 19: 17871798. [57] SHERWOOD RI, CHRISTENSEN JL, CONBOY IM, CONBOY MJ, RANDO TA, WEISSMAN IL, WAGERS AJ. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell 2004; 119: 543554. [58] SHERWOOD RI, CHRISTENSEN JL, WEISSMAN IL, WAGERS AJ. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells 2004; 22: 12921304. [59] SHI M, ISHIKAWA M, KAMEI N, NAKASA T, ADACHI N, DEIE M, ASAHARA T, OCHI M. Acceleration of skeletal muscle regeneration in a rat skeletal muscle injury model by local injection of human peripheral blood-derived CD133-positive cells. Stem Cells 2009; 27: 949960. KOMÓRKI MACIERZYSTE W REGENERACJI MIÊNI 207 [60] SKUK D, GOULET M, ROY B, PIETTE V, COTE CH, CHAPDELAINE P, HOGREL JY, PARADIS M, BOUCHARD JP, SYLVAIN M, LACHANCE JG, TREMBLAY JP. First test of a high-density injection protocol for myogenic cell transplantation throughout large volumes of muscles in a Duchenne muscular dystrophy patient: eighteen months follow-up. Neuromuscul Disord 2007; 17: 3846. [61] SKUK D, TREMBLAY JP. Myoblast transplantation: the current status of a potential therapeutic tool for myopathies. J Muscle Res Cell Motil 2003; 24: 285300. [62] TAKAHASHI K, YAMANAKA S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126: 663676. [63] TIAN C, LU Y, GILBERT R, KARPATI G. Differentiation of murine embryonic stem cells in skeletal muscles of mice. Cell Transplant 2008; 17: 325335. [64] TORRENTE Y, BELICCHI M, SAMPAOLESI M, PISATI F, MEREGALLI M, D'ANTONA G, TONLORENZI R, PORRETTI L, GAVINA M, MAMCHAOUI K, PELLEGRINO MA, FURLING D, MOULY V, BUTLER-BROWNE GS, BOTTINELLI R, COSSU G, BRESOLIN N. Human circulating AC133(+) stem cells restore dystrophin expression and ameliorate function in dystrophic skeletal muscle. J Clin Invest 2004; 114: 182195. [65] WAKITANI S, SAITO T, CAPLAN AI. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve 1995; 18: 14171426. [66] WOBUS AM, BOHELER KR. Embryonic stem cells: prospects for developmental biology and cell therapy. Physiol Rev 2005; 85: 635678. [67] YOKOTA T, LU QL, MORGAN JE, DAVIES KE, FISHER R, TAKEDA S, PARTRIDGE TA. Expansion of revertant fibers in dystrophic mdx muscles reflects activity of muscle precursor cells and serves as an index of muscle regeneration. J Cell Sci 2006; 119: 26792687. [68] ZAMMIT PS. All muscle satellite cells are equal, but are some more equal than others? J Cell Sci 2008; 121: 29752982. [69] ZAMMIT PS, PARTRIDGE TA, YABLONKA-REUVENI Z. The skeletal muscle satellite cell: the stem cell that came in from the cold. J Histochem Cytochem 2006; 54: 11771191. [70] ZHENG JK, WANG Y, KARANDIKAR A, WANG Q, GAI H, LIU AL, PENG C, SHENG HZ. Skeletal myogenesis by human embryonic stem cells. Cell Res 2006; 16: 713722. Karolina Archacka Wydzia³ Biologii, Uniwersytet Warszawski Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa e-mail: [email protected]