Marta Wanarska, Józef Kur β-D-galaktozydazy

Marta Wanarska, Józef Kur β-D-galaktozydazy

PRACE PRZEGL¥DOWE
b-D-galaktozydazy – Ÿród³a,
w³aœciwoœci i zastosowanie
Marta Wanarska, Józef Kur
Katedra Mikrobiologii, Wydzia³ Chemiczny, Politechnika Gdañska,
Gdañsk
b-D-galactosidases – sources, properties and applications
Summary
The rapid development of the world industry requires the introduction of
new technologies which are more effective and cheaper. Therefore, the application of enzymes in different industry sectors grows steadily. This article reviews
some properties and applications of b-D-galactosidases derived from microbial
sources.
Key words:
b-D-galactosidase, lactose hydrolysis, transglycosylation.
1. Wstêp
Adres do korespondencji
Marta Wanarska,
Katedra Mikrobiologii,
Wydzia³ Chemiczny,
Politechnika Gdañska,
ul. Narutowicza 11/12,
80-952 Gdañsk.
4 (71) 46–62 2005
Rozwój œwiatowego przemys³u uzale¿niony jest od wprowadzania coraz nowszych technologii, które umo¿liwiaj¹ wydajn¹
i tani¹ produkcjê wysokiej jakoœci dóbr konsumpcyjnych. Tradycyjne technologie stosowane w przemyœle czêsto nie spe³niaj¹
tych wymogów, wymagaj¹ du¿ych nak³adów energii, charakteryzuj¹ siê zu¿yciem du¿ej iloœci substratów i wytworzeniem znacznej iloœci odpadów poprodukcyjnych. Z tych wzglêdów coraz
czêœciej stosowane s¹ procesy technologiczne, w których rolê
katalizatorów reakcji chemicznych pe³ni¹ enzymy. G³ówn¹ w³aœciwoœci¹ enzymów jest ich aktywnoœæ katalityczna i specyficznoœæ dzia³ania. Reakcje katalizowane enzymatycznie przebiegaj¹
z du¿¹ szybkoœci¹ w ³agodnych warunkach i pozwalaj¹ na uzyskanie po¿¹danego produktu z du¿¹ wydajnoœci¹. Stosowanie
b-D-galaktozydazy – Ÿród³a, w³aœciwoœci i zastosowanie
enzymów umo¿liwia te¿ uzyskanie jednego produktu bêd¹cego okreœlonym izomerem przestrzennym (stereoizomerem). Chocia¿ aktywnoœæ katalityczna enzymów od
wieków by³a wykorzystywana przez cz³owieka, dopiero rozwój nowoczesnej biotechnologii pozwoli³ na szerokie zastosowanie tych biokatalizatorów w procesach
przemys³owych. Na najwiêksz¹ skalê produkowane s¹ i wykorzystywane enzymy hydrolityczne: proteazy, lipazy i hydrolazy glikozydowe. Jako sk³adniki proszków do
prania stosowane s¹ na co dzieñ w ka¿dym gospodarstwie domowym (1). Enzymy
znajduj¹ te¿ coraz wiêksze zastosowanie w przemyœle farmaceutycznym. Lipazy,
acylazy i glikozylotransferazy wykorzystywane s¹ w regio- i stereoselektywnej syntezie leków (2,3). Natomiast przemys³ chemiczny stosuje katalizê enzymatyczn¹
w produkcji akrylamidu, 1,3-propanodiolu, a tak¿e zwi¹zków chemicznych wykazuj¹cych czynnoœæ optyczn¹ (3).
Obecnie wiêkszoœæ enzymów stosowanych w procesach przemys³owych pochodzi z mikroorganizmów mezofilnych, jednak wzrastaj¹ce zapotrzebowanie na biokatalizatory sprawia, ¿e ci¹gle poszukiwane s¹ nowe Ÿród³a enzymów o specyficznych w³aœciwoœciach. Przyk³adowo, enzymy bêd¹ce sk³adnikami proszków do prania
(proteazy, lipazy, amylazy i celulazy) musz¹ byæ aktywne i stabilne w wysokim pH.
W ostatnich latach wzros³o te¿ zainteresowanie enzymami wykazuj¹cymi wysok¹
aktywnoœæ w niskich temperaturach. Zastosowanie tych biokatalizatorów w œrodkach pior¹cych pozwoli³oby na zmniejszenie zu¿ycia energii elektrycznej (1). Natomiast a-amylazy wykorzystywane w przetwórstwie skrobi musz¹ wykazywaæ aktywnoœæ i stabilnoœæ w wysokiej temperaturze. Pierwszy etap przemys³owego procesu
wytwarzania syropów skrobiowych, prowadzony jest w temperaturze 80-90°C, która zapewnia odpowiedni¹ rozpuszczalnoœæ substratu, zapobiega zanieczyszczeniom
mikrobiologicznym bioreaktora i powoduje str¹canie pozosta³oœci bia³ek zanieczyszczaj¹cych skrobiê (1,4). W przypadku b-galaktozydaz wykorzystywanych w przemyœle mleczarskim do produkcji bezlaktozowego mleka, istniej¹ dwa alternatywne
rozwi¹zania pozwalaj¹ce na ulepszenie dotychczas stosowanej technologii. Zastosowanie enzymu aktywnego w niskiej temperaturze umo¿liwi³oby przeprowadzenie
hydrolizy laktozy w warunkach ch³odniczych i zapobieg³o rozwojowi niepo¿¹danej
mikroflory podczas prowadzenia procesu. Natomiast wykorzystanie termostabilnej
b-D-galaktozydazy pozwoli³oby na jednoczesn¹ hydrolizê disacharydu i pasteryzacjê mleka.
2. Aktywnoœci enzymatyczne b-D-galaktozydaz
b-D-galaktozydaza (EC 3.2.1.23) jest enzymem katalizuj¹cym reakcjê hydrolizy
wi¹zañ O-glikozydowych w b-D-galaktozydach. Najbardziej znanym galaktozydem
jest disacharyd wystêpuj¹cy w mleku – laktoza. Katalizowana enzymatycznie reakcja hydrolizy wi¹zania b-1,4-glikozydowego w laktozie prowadzi do powstania cz¹steczek D-glukozy i D-galaktozy (I). Niektóre b-D-galaktozydazy wykazuj¹ równie¿
BIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005
47
Marta Wanarska, Józef Kur
zdolnoœæ syntezy wi¹zañ glikozydowych, która prowadzi do powstania ³añcucha oligosacharydowego, gdy substratem reakcji jest laktoza (II).
b-D-galaktozydaza
laktoza
D-glukoza + D-galaktoza
(I)
mieszanina galaktooligosacharydów
(II)
b-D-galaktozydaza
laktoza
Obie aktywnoœci b-D-galaktozydazy – hydrolityczna i transferazowa s¹ ze sob¹
nierozerwalnie zwi¹zane, a ich mechanizm jest wspólny. Obejmuje on trzy nastêpuj¹ce po sobie etapy, a ostatni z nich decyduje, czy zachodzi reakcja hydrolizy czy
transglikozylacji:
enzym + laktoza
enzym-laktoza
galaktozyl-enzym + akceptor
enzym-laktoza
(I),
galaktozyl-enzym + glukoza
(II),
galaktozyl-akceptor + enzym (III).
W pierwszym etapie nastêpuje wi¹zanie cz¹steczki laktozy w centrum aktywnym
b-D-galaktozydazy. Drugi etap obejmuje rozszczepienie disacharydu z udzia³em reszt
aminokwasowych enzymu o znaczeniu katalitycznym. Cz¹steczka glukozy opuszcza
wnêkê katalityczn¹, zaœ reszta galaktozylowa pozostaje zwi¹zana z enzymem. W ostatnim etapie nastêpuje przeniesienie reszty galaktozylowej na cz¹steczkê akceptora i produkt reakcji opuszcza centrum aktywne b-D-galaktozydazy. Je¿eli akceptorem jest woda, uwolniona zostaje cz¹steczka D-galaktozy. Je¿eli zaœ rolê akceptora
pe³ni cz¹steczka cukru (laktoza lub jeden z produktów jej hydrolizy), powstaje galaktooligosacharyd (5). Reakcj¹ preferowan¹ przez b-D-galaktozydazy jest na ogó³
reakcja hydrolizy. W celu zwiêkszenia efektywnoœci reakcji transglikozylacji nale¿y
zwiêkszyæ stê¿enie akceptora lub zastosowaæ niskowodne œrodowisko reakcji. Wykazano, ¿e akceptorem w reakcji transglikozylacji mo¿e byæ nie tylko cz¹steczka cukru, ale równie¿ alkoholu (6), antybiotyku (7) lub pochodna aminokwasu (8). Dziêki
temu b-D-galaktozydazy mog¹ znaleŸæ zastosowanie przy produkcji farmaceutyków
i innych zwi¹zków biologicznie czynnych.
3. Charakterystyka b-D-galaktozydaz z ró¿nych Ÿróde³
b-D-galaktozydaza jest enzymem syntetyzowanym przez komórki ssaków, roœlin, dro¿d¿y, grzybów strzêpkowych i bakterii. W zale¿noœci od Ÿród³a pochodzenia, enzymy ró¿ni¹ siê mas¹ cz¹steczkow¹, liczb¹ podjednostek wchodz¹cych
48
PRACE PRZEGL¥DOWE
b-D-galaktozydazy – Ÿród³a, w³aœciwoœci i zastosowanie
w sk³ad natywnej cz¹steczki, wartoœciami optymalnej temperatury i pH dzia³ania,
a tak¿e zapotrzebowaniem na jony metali niezbêdne dla aktywnoœci enzymu lub/i
stabilizacji jego struktury. b-D-galaktozydazy ró¿ni¹ siê równie¿ spektrum substratowym, wra¿liwoœci¹ na dzia³anie inhibitorów i aktywatorów oraz termostabilnoœci¹. Najbogatszym Ÿród³em b-D-galaktozydaz o ró¿nych w³aœciwoœciach s¹ mikroorganizmy. Niektóre z nich zdolne s¹ do syntezy kilku ró¿nych b-D-galaktozydaz,
np. Bifidobacterium adolescentis DSM 20083 wytwarza dwa enzymy (9), zaœ z Bacillus
circulans wyizolowano a¿ trzy ró¿ne b-D-galaktozydazy (10).
b-D-galaktozydazy s¹ najczêœciej bia³kami oligomerycznymi. Jednym z wyj¹tków
s¹ enzymy syntetyzowane przez grzyby z rodzaju Aspergillus, które wystêpuj¹ w postaci monomeru. A. niger wytwarza trzy ró¿ne formy glikoproteiny o aktywnoœci
b-D-galaktozydazy, ró¿ni¹ce siê liczb¹ reszt cukrowych (11). Enzymy z A. aculeatus
i A. oryzae s¹ równie¿ monomerami (12-14). b-D-galaktozydazy z dro¿d¿y K. fragilis
i K. lactis s¹ homodimerami (15,16). Dwie identyczne podjednostki ma te¿ enzym
z psychrofilnej antarktycznej cyjanobakterii z rodzaju Planococcus (17). Wiele b-D-galaktozydaz ma postaæ tetrameru. Z czterech identycznych podjednostek sk³adaj¹ siê:
b-D-galaktozydaza LacZ z E. coli (18), enzymy pochodz¹ce z antarktycznych bakterii
Arthrobacter (19) i Pseudoalteromonas sp. 22b (20), b-D-galaktozydaza z Bifidobacterium
adolescentis DSM 20083 (b-gal II) (9), czy enzym z Penicillium chrysogenum (21).
ród³o, z którego wyizolowano b-D-galaktozydazê decyduje najczêœciej o optymalnych wartoœciach temperatury, pH oraz stê¿enia soli wymaganych do prowadzenia przez dany enzym efektywnej katalizy. Bywa jednak, ¿e z organizmu mezofilnego mo¿na wyizolowaæ enzym, którego optymalna temperatura dzia³ania bêdzie wynosi³a nawet 85°C (22). Ró¿nice w optymalnych wartoœciach temperatury i pH dla
swojego dzia³ania mog¹ wykazywaæ te¿ b-D-galaktozydazy pochodz¹ce z jednego
organizmu. Trzy enzymy wyizolowane z Bacillus circulans s¹ tego doskona³ym
przyk³adem. b-D-galaktozydaza-I wykazuje najwy¿sz¹ aktywnoœæ w 44°C i w buforze
o pH 6,0, optymalne warunki dzia³ania dla b-D-galaktozydazy-II to pH 4,0 i 74°C, zaœ
dla b-D-galaktozydazy-III – pH 4,0 i 60°C (10). Wykorzystywane w przemyœle mleczarskim enzymy z dro¿d¿y s¹ aktywne w œrodowisku obojêtnym i lekko kwaœnym
(pH 6,0-7,0), zaœ b-D-galaktozydazy otrzymywane z grzybów strzêpkowych wykazuj¹ najwy¿sz¹ aktywnoœæ w pH 3,5-4,5 (23). Ciekawym enzymem jest b-D-galaktozydaza z halofilnego archaeona Haloferax alicantei, która maksymaln¹ aktywnoœæ wykazuje w buforze zawieraj¹cym 4 M NaCl (24).
Z definicji b-D-galaktozydazy wynika, ¿e podstawowym substratem enzymu jest
laktoza. Jednak niektóre b-D-galaktozydazy nie rozk³adaj¹ tego disacharydu. Dzieje
siê tak w przypadku jednego z enzymów wyizolowanych z Bifidobacterium adolescentis
DSM 20083, który hydrolizuje wi¹zania glikozydowe w oligosacharydach powsta³ych
z laktozy na drodze transglikozylacji, a nie wykazuje aktywnoœci hydrolitycznej w stosunku do laktozy (9). W przeprowadzonych badaniach ujawniono, ¿e równie¿ b-D-galaktozydaza z Haloferax alicantei nie hydrolizuje laktozy, wykazuje zaœ zdolnoœæ hydrolizy wi¹zañ b-1,4-glikozydowych laktulozy (O-b-D-galaktopiranozylo-(1®4)-D-fruktoBIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005
49
Marta Wanarska, Józef Kur
piranoza) (24). Niektóre b-D-galaktozydazy maj¹ bardzo ograniczone spektrum substratowe i wykazuj¹ aktywnoœæ tylko w stosunku do b-D-galaktozydów (19,20,25).
Inne zaœ s¹ ma³o specyficzne i hydrolizuj¹ zarówno b-D-galaktozydy, jak i b-D-glukozydy, np. enzymy z Sulfolobus solfataricus i Pyrococcus furiosus (26-28). Ze wzglêdu na szerokie spektrum substratowe, enzymy te czêsto nazywane s¹ b-glikozydazami. Enzym
wyizolowany z Rhodotorula minuta IFO897 wykazuje aktywnoœæ hydrolityczn¹ w stosunku do b-D-galaktozydów, b-D-glukozydów, b-D-fukozydów i a-L-arabinozydów (29).
Jony metali nie tylko stabilizuj¹ strukturê enzymów, ale mog¹ te¿ wp³ywaæ na
ich aktywnoœæ, dzia³aj¹c aktywuj¹co lub pe³ni¹c rolê inhibitora. Aktywnoœæ b-D-galaktozydaz zazwyczaj wzrasta, gdy w buforze znajduj¹ siê jony Na+, K+ i Mg2+.
Jony metali ciê¿kich dzia³aj¹ zaœ jako inhibitory (23,26). Kationy Ca2+ równie¿ obni¿aj¹ aktywnoœæ wielu b-D-galaktozydaz (16,23,26,30). Silnym aktywatorem enzymu z dro¿d¿y K. lactis i K. fragilis jest Mn2+. Jony Co2+ tak¿e stymuluj¹ aktywnoœæ
b-D-galaktozydazy z K. fragilis (15,16). W przypadku b-D-galaktozydazy z Mucor
pusillus, ¿aden z testowanych jonów (Ca2+, Co2+, Cu2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+) nie mia³
wp³ywu na aktywnoœæ enzymu (31). W celu okreœlenia, czy enzym nie wymaga obecnoœci jonów dwuwartoœciowych dla maksymalnej aktywnoœci, czêsto stosuje siê
kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Równie¿ zwi¹zki zawieraj¹ce grupy tiolowe maj¹ wp³yw na aktywnoœæ b-D-galaktozydaz. W badaniach wykazano, ¿e enzym
z Pseudoalteromonas sp. 22b jest silnie aktywowany przez ditiotreitol (20), zaœ na aktywnoœæ b-galaktozydazy z Mucor pusillus nie wp³ywaj¹ ani zwi¹zki maj¹ce grupy tiolowe, ani EDTA (31). Stwierdzono równie¿, ¿e wspólna obecnoœæ Mg2+ i 2-merkaptoetanolu w mieszaninie reakcyjnej silnie aktywuje enzym z dro¿d¿y K. lactis. Sam
2-merkaptoetanol nie mia³ wp³ywu na aktywnoœæ b-D-galaktozydazy, zaœ dodatek
samego Mg2+ s³abo j¹ aktywowa³. Mo¿liwe jest, ¿e zwi¹zki te tworz¹ kompleks
i dopiero on aktywuje b-D-galaktozydazê z K. lactis (16).
Podobnie jak wp³yw jonów, tak i wp³yw cukrów na aktywnoœæ b-D-galaktozydaz
jest cech¹ specyficzn¹ dla ka¿dego z tych enzymów. Intensywnie badany jest przede
wszystkim wp³yw glukozy i galaktozy na przebieg reakcji hydrolizy laktozy. Stwierdzono, ¿e 10 mM stê¿enie glukozy lub galaktozy powoduje zmniejszenie aktywnoœci b-D-galaktozydazy z Thermus 4-1A odpowiednio o 46 i 30% (32). Niekiedy tylko
jeden z produktów hydrolizy laktozy wywiera dominuj¹ce oddzia³ywanie na aktywnoœæ enzymu, np. w przypadku b-D-galaktozydazy z Mucor pusillus, roztwór galaktozy o stê¿eniu 10 mM powoduje spadek aktywnoœci enzymu o 77,4%, a glukoza
w tym samym stê¿eniu nie wp³ywa na jego aktywnoœæ (31). Glukoza jest natomiast
inhibitorem b-D-galaktozydazy z Rhodotorula minuta IFO879 (29).
Charakterystykê b-D-galaktozydaz pochodz¹cych z ró¿nych Ÿróde³ przedstawiono w tabeli.
50
PRACE PRZEGL¥DOWE
b-D-galaktozydazy – Ÿród³a, w³aœciwoœci i zastosowanie
4. Charakterystyka termostabilnych b-D-galaktozydaz
Od oko³o 30 lat trwaj¹ prace nad izolacj¹ i charakterystyk¹ enzymów pochodz¹cych z organizmów termofilnych. W 1972 r. zosta³a opisana termostabilna
b-D-galaktozydaza wyizolowana z komórek termofilnej bakterii Thermus sp. T2. Mikroorganizm pochodzi³ z gor¹cego Ÿród³a w Parku Narodowym Yellowstone w USA
i by³ podobny morfologicznie do Thermus aquaticus. Du¿a iloœæ enzymu o aktywnoœci
b-D-galaktozydazy wytwarzana by³a w komórkach Thermus sp. T2 podczas ich hodowli w po¿ywce zawieraj¹cej galaktozê. Wyizolowany z tych komórek enzym mia³
masê cz¹steczkow¹ 570 kDa (33). b-D-galaktozydaza Thermus sp. T2 jest kodowana
przez gen bgaA. Polipeptyd bêd¹cy produktem ekspresji tego genu sk³ada siê z 645
reszt aminokwasowych. Obliczona na podstawie sekwencji aminokwasowej jego
masa cz¹steczkowa wynosi 73,595 kDa (34), co sugeruje, ¿e enzym w formie natywnej jest oktamerem. Optymalne warunki dzia³ania enzymu to 80°C i pH 5,0. Maksymaln¹ aktywnoœæ termostabilna b-D-galaktozydaza wykazuje jedynie w obecnoœci
jonów Na+. Jony Mn2+ i Fe2+ s¹ aktywatorami enzymu, zaœ dodatek kationów Mg2+
i Co2+ nie wp³ywa na jego aktywnoœæ (33). W innych badaniach wykazano natomiast, ¿e jony Mn2+, Co2+ i Cu2+ s¹ inhibitorami tej b-D-galaktozydazy (15). Obecnoœæ cysteiny i 2-merkaptoetanolu w mieszaninie reakcyjnej powoduje zwiêkszenie
aktywnoœci tej b-D-galaktozydazy. Dodatek cysteiny wp³ywa ponadto na zwiêkszenie jej termostabilnoœci (33).
Termostabiln¹ b-D-galaktozydazê wyizolowano równie¿ z komórek bakterii
Thermus sp. 4-1A (szczep izolowany w Nowej Zelandii). Podobnie jak w przypadku
Thermus sp. T2, ekspresja genu koduj¹cego enzym zachodzi³a najefektywniej po dodaniu do po¿ywki galaktozy. Masa cz¹steczkowa enzymu wynosi³a 440 kDa. Wszystkie oznaczenia aktywnoœci enzymu w reakcji z ONPG (o-nitrofenylo-b-D-galaktopiranozyd) wykonywano w 70°C i pH 6,0. Wykazano, ¿e zwi¹zki zawieraj¹ce grupy tiolowe (cysteina, 2-merkaptoetanol, czy ditiotreitol) s¹ aktywatorami enzymu z Thermus
sp. 4-1A, zaœ kwas jodooctowy (inhibitor enzymów zawieraj¹cych w centrum aktywnym reszty cysteiny) ca³kowicie go inaktywuje. Silny wzrost aktywnoœci b-D-galaktozydazy powoduje dodatek EDTA do mieszaniny reakcyjnej. Natomiast jony Zn2+,
Cu2+, Cu+, Fe2+, Fe3+, Ni2+ i Mn2+ s¹ inhibitorami enzymu. S³aby wzrost aktywnoœci
zanotowano tylko w obecnoœci jonów Mg2+, zaœ kationy Ca2+ i Co2+ nie wp³ywa³y
na aktywnoœæ termostabilnej b-D-galaktozydazy. W badaniach nad wp³ywem cukrów na aktywnoœæ enzymu wykazano, ¿e 10 mM stê¿enie laktozy, glukozy i galaktozy w mieszaninie reakcyjnej powoduje obni¿enie aktywnoœci enzymu odpowiednio o 22, 46 i 30%. b-D-galaktozydaza ze szczepu Thermus 4-1A jest wysoce termostabilnym enzymem. Po 20 godzinach inkubacji w 80°C zachowuje 83% pocz¹tkowej
aktywnoœci. Dodanie 0,5% NaCl zwiêksza termostabilnoœæ enzymu (32).
Scharakteryzowano równie¿ enzym wyizolowany z komórek termofilnych bakterii Thermus sp. A4 (szczep wyizolowany z gor¹cych Ÿróde³ Atagawa w Japonii).
Stwierdzono, ¿e natywna cz¹steczka enzymu jest monomerem. Na podstawie seBIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005
51
Marta Wanarska, Józef Kur
kwencji nukleotydowej genu ustalono, ¿e bia³ko zbudowane jest z 645 reszt aminokwasowych, a jego masa cz¹steczkowa wynosi 72,741 kDa i jest mniejsza od wyznaczonej dla tego bia³ka z zastosowaniem techniki SDS-PAGE (75 kDa) i filtracji ¿elowej (86 kDa). Za optymalne warunki aktywnoœci enzymu uznano pH 6,5 i temperaturê 70°C. W tej temperaturze enzym jest ca³kowicie stabilny i nawet po 20 godzinach
inkubacji zachowuje pe³n¹ aktywnoœæ. Aktywatorami b-D-galaktozydazy z Thermus
sp. A4 s¹ zwi¹zki zawieraj¹ce grupy –SH (ditiotreitol, cysteina i 2-merkaptoetanol),
jony Co2+, Mn2+ i Zn2+ oraz, w mniejszym stopniu, EDTA. Spadek aktywnoœci enzymu powoduj¹ zaœ jony Cu2+ i Fe2+. Obecnoœæ kationów Mg2+ w mieszaninie reakcyjnej nie ma wp³ywu na aktywnoœæ tej b-D-galaktozydazy. Nie zanotowano te¿ inaktywacji enzymu pod wp³ywem kwasu jodooctowego. Podobnie jak w przypadku
b-D-galaktozydazy z Thermus 4-1A, 10 mM stê¿enie laktozy, glukozy i galaktozy
w mieszaninie reakcyjnej powoduje obni¿enie aktywnoœci enzymu. Najsilniejszym
inhibitorem jest galaktoza. W jej obecnoœci aktywnoœæ enzymu jest o 40% ni¿sza od
poziomu uzyskanego dla próby kontrolnej nie zawieraj¹cej cukru. Termostabilna
b-D-galaktozydaza z Thermus sp. A4 nie wykazywa³a aktywnoœci transglikozylacyjnej
w warunkach, w których prowadzono badania (35). Ciekawe wyniki dotycz¹ce struktury b-D-galaktozydazy z Thermus sp. A4 uzyskano na podstawie analizy kryszta³ów
enzymu. We wczeœniejszych badaniach ustalono, ¿e enzym wyizolowany z komórek
Thermus sp. A4 wystêpuje w postaci monomeru (filtracja ¿elowa, SDS-PAGE) (35). To
samo bia³ko wyizolowane z komórek rekombinowanego szczepu E. coli charakteryzowa³o siê mas¹ cz¹steczkow¹ 170 kDa, co sugerowa³o, ¿e jest oligomerem zbudowanym z 2 lub 3 podjednostek. Na podstawie analizy kryszta³ów enzymu jednoznacznie potwierdzono, ¿e jest on homotrimerem. Ró¿nice w stopniu oligomeryzacji b-D-galaktozydazy s¹ najprawdopodobniej wynikiem zastosowania ró¿nych procedur oczyszczania bia³ka (36).
Termostabiln¹ b-D-galaktozydazê wykazuj¹c¹ aktywnoœæ transglikozylacyjn¹ wyizolowano z komórek Thermus aquaticus YT-I. Enzym ten bêd¹cy oligomerem ma niezwykle du¿¹ masê cz¹steczkow¹, przekraczaj¹c¹ 700 kDa. Masa cz¹steczkowa jednej podjednostki wynosi 59 kDa. Optymalne warunki dzia³ania b-D-galaktozydazy to
pH 5,5 i 80°C. Enzym zachowuje ponad 80% aktywnoœci w zakresie temperatur
65-85°C. Powy¿ej 85°C aktywnoœæ enzymu gwa³townie spada na skutek denaturacji
termicznej, ale obecnoœæ CaCl2 powoduje zwiêkszenie jego termostabilnoœci. Jony
Ca2+ s¹ najsilniejszymi aktywatorami b-D-galaktozydazy z T. aquaticus YT-I. Zwiêkszenie aktywnoœci enzymu powoduj¹ równie¿ kationy Fe3+, Zn2+, Co2+, Mg2+ oraz
jony Na+, Li+ i K+. W obecnoœci kationów Mn2+ nie zanotowano zmian aktywnoœci
enzymu, zaœ jony Fe2+, Cu2+ i Ni2+ j¹ obni¿a³y. Aktywatorami b-D-galaktozydazy s¹
zwi¹zki maj¹ce grupy tiolowe, zaœ kwas jodooctowy i inne inhibitory enzymów zawieraj¹cych w centrum aktywnym reszty cysteiny, powoduj¹ inaktywacjê enzymu.
b-D-galaktozydaza katalizuje reakcjê hydrolizy wi¹zañ glikozydowych w b-D-galaktozydach i b-D-glukozydach, wykazuje jednak wiêksze powinowactwo do o-nitrofenylo-b-D-galaktopiranozydu i p-nitrofenylo-b-D-galaktopiranozydu ni¿ do p-nitrofe52
PRACE PRZEGL¥DOWE
b-D-galaktozydazy – Ÿród³a, w³aœciwoœci i zastosowanie
nylo-b-D-glukopiranozydu. Produkty hydrolizy laktozy s¹ inhibitorami tej b-D-galaktozydazy. Glukoza powoduje silniejszy efekt inhibicji ni¿ galaktoza. Enzym wykazuje ponadto aktywnoœæ transglikozylacyjn¹. G³ównymi produktami reakcji transglikozylacji, której substratem jest laktoza, s¹ tri- i tetrasacharydy (37).
ród³em termostabilnej b-D-galaktozydazy mog¹ byæ te¿ termofilne grzyby Rhizomucor
sp., bakterie Bacillus coagulans RCS3 lub mezofilne dro¿d¿e Sterigmatomyces elviae
CBS8119.
Termofilne grzyby strzêpkowe Rhizomucor sp. produkuj¹ zewn¹trzkomórkow¹
b-D-galaktozydazê o masie cz¹steczkowej 250 kDa. Enzym jest glikoprotein¹ i wystêpuje w postaci dimeru. Masa cz¹steczkowa jednej podjednostki wynosi 120 kDa.
Optymalne warunki dzia³ania tej b-galaktozydazy to pH 4,5 i temperatura 60°C.
W tej temperaturze enzym zachowuje stabilnoœæ przez 4 godziny, zaœ w temperaturze 70°C jego czas pó³trwania wynosi 150 minut. b-D-galaktozydaza z Rhizomucor
sp. wykazuje wysok¹ specyficznoœæ substratow¹. Hydrolizuje tylko wi¹zania glikozydowe w b-D-galaktozydach. Obecnoœæ jonów K+, Na+ oraz Mg2+ i innych kationów
dwuwartoœciowych w mieszaninie reakcyjnej nie ma wp³ywu na aktywnoœæ enzymu.
Po wykonaniu intensywnej dializy wobec buforu zawieraj¹cego EDTA potwierdzono, ¿e b-D-galaktozydaza z Rhizomucor sp. nie wymaga jonów metali do zachowania
pe³nej aktywnoœci. Kationy Hg2+ i Cu2+ oraz galaktoza i IPTG (izopropylo-b-D-tiogalaktopiranozyd) s¹ inhibitorami enzymu (38).
Zewn¹trzkomórkowa termostabilna b-D-galaktozydaza jest produkowana przez
termofilny szczep Bacillus coagulans RCS3. Maksymaln¹ aktywnoœæ enzym wykazuje
w temperaturze 65°C i pH 6,8. Pozostaje ona na wysokim poziomie w pH 6,0-7,0
i temperaturze 63-67°C. Za optymaln¹ temperaturê dzia³ania enzymu przyjêto 63°C,
bo w tych warunkach b-D-galaktozydaza wykazuje wysok¹ stabilnoœæ termiczn¹
(czas pó³trwania enzymu wynosi 15 godzin). Silnymi inhibitorami enzymu s¹ jony
Cu2+, Hg2+ i Ni2+ oraz galaktoza. Kationy Mn2+ powoduj¹ s³ab¹ aktywacjê, podobnie jak wysokie stê¿enie EDTA (20 mM) (39).
Termostabilna b-D-galaktozydaza syntetyzowana w komórkach Sterigmatomyces
elviae CBS8119 zwi¹zana jest ze œcian¹ komórkow¹ mikroorganizmu. Po enzymatycznej lizie komórek dro¿d¿y, enzym izolowano, z frakcji zawieraj¹cej nierozpuszczalne ich fragmenty, g³ównie œciany komórkowe. Masa cz¹steczkowa b-D-galaktozydazy z S. elviae wynosi 170 kDa. W formie natywnej enzym jest dimerem z³o¿onym z podjednostek o masie cz¹steczkowej 86 kDa. Optymalne pH dzia³ania b-D-galaktozydazy obejmuje zakres 4,5-5,0. Najwy¿sz¹ aktywnoœæ enzym uzyskuje w 85°C
w pH 5,0. Wykazano, ¿e b-D-galaktozydaza z S. elviae jest wysoce termostabilnym
enzymem. Po 60-minutowej inkubacji w 80 i 85°C zachowuje odpowiednio 90 i 62%
pocz¹tkowej aktywnoœci. Inhibitorami enzymu s¹ jony Hg2+ i Pb2+. W przypadku innych dwuwartoœciowych kationów metali, EDTA, kwasu jodooctowego, czy ditiotreitolu nie stwierdzono wp³ywu na aktywnoœæ enzymu. b-D-galaktozydaza z S. elviae wykazuje ma³¹ specyficznoœæ substratow¹. Katalizuje reakcjê hydrolizy nie tylko b-D-galaktozydów, ale równie¿ b-D-glukozydów, b-D-fukozydów i b-L-arabinozydów.
BIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005
53
54
4
15
–
20c
7,0
nb
19
Liczba monomerów
Optymalna temp. dzia³ania
(°C)
Optymalne pH dzia³ania
AktywnoϾ transglikozylacyjna
Literatura
463
3
4
20
25
nb
17
nb
18
25
48
52
+
6,0
–
8,0
6,5
6,0
–
8,0
4
55
2
42
465
Escherichia
coli
B
4
155
Planococcus
B
40
490
Pseudoalteromonas
sp. 22b
Arthrobacter
sp. SB
Masa cz¹steczkowa (kDa)
2
B
1
B
Mikroorganizmy
psychrofilne
Charakterystyka b-galaktozydaz pochodz¹cych z ró¿nych Ÿróde³
5
9
+
10
57
nb
30
9
nb
16
+
15
54
56
+
nb
13
14
nb
11
12
+
5,4
4,5
2,5
–
4,0
6,5
–
6,8
6,9
–
7,3
6,0
6,0
4,0
4,0
7,2
–
7,5
1
55
–
60
1
46
1
30
37
60
2
40f
120b
2
105
Aspergillus
aculeatus
Aspergillus
oryzae
RT102
nbe
124b*
150b*
173b*
Aspergillus
niger
12
GS
11
GS
4
200
10
GS
35
270a
Kluyveromyces Kluyveromyces
lactis Y1140
fragilis
D
1
350
8
D
44
74
60
212
145
86
Bifidobacterium
adolescentis
DSM 20083
Bacillus
circulans
7
B
6
B
Mikroorganizmy mezofilne
43
–
58
nb
nb
Leuconostoc*
B
ród³o b-D-galaktozydazy
Tabela
Marta Wanarska, Józef Kur
PRACE PRZEGL¥DOWE
BIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005
65
nb
31
AktywnoϾ transglikozylacyjna
Literatura
21
nb
4,0
–
5,0
30
24
nb
29
+
4,
–
5,2
70
nbd
144b
2
nbd
D
17
22
53
+
4,5
–
5,0
85
2
170
Rhodotorula
Sterigmatomyces
minuta
elviae CBS8119
IFO879
D
16
2
180
Haloferax
alicantei
B
15
ród³o b-D-galaktozydazy
38
nb
4,5
60
2
250b
Rhizomucor
sp.
GS
18
39
nb
6,0
–
7,0c*
63
–
67c*
nb
nb
Bacillus
coagulans
RCS3
B
19
B
20
B
21
B
22
15
33
34
+
5,0
80
8
570
–
35
36
32
6,5
37
+
5,5
80
12
1#
3#
70
>700
Thermus
aquaticus
YT-I
B
23
86#
170#
nb
6,0
nbe*
nb
440
Thermus sp. Thermus sp. Thermus sp.
T2
4-1A
A4
Mikroorganizmy termofilne
27
40
43
+
6,5
95
4
240
Sulfolobus
solfataricus
MT-4
B
24
45
47
+
5,4
92
–
93
1#
2#
60#
122#
Pyrococcus
woesei
B
25
Tabela cd.
Objaœnienia skrótów:
a – wartoœæ obliczona (2 × 135 kDa); B – bakterie; b – glikoproteina; b* – trzy formy glikoproteiny ró¿ni¹ce siê zawartoœci¹ cukrów; c – maksymaln¹ aktywnoœæ enzymu zanotowano w 18°C, w pH 7,0; c* – maksymaln¹ aktywnoœæ enzymu
zanotowano w 65°C, w pH 6,8; D – dro¿d¿e; d – pomiary aktywnoœci enzymu prowadzono w temperaturze pokojowej, w pH 7,2; e – pomiary aktywnoœci enzymu prowadzono w 30°C; e* – pomiary aktywnoœci enzymu prowadzono w 70°C; f –
temperatura, w której enzym wykazuje wysok¹ aktywnoœæ i stabilnoœæ, jednak maksymaln¹ aktywnoœæ enzymu zanotowano w 50°C i pH 6,5; GS – grzyby strzêpkowe; nb – nie badano; * – badano 6 szczepów (Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides 19D, 6M, 18F i 19M; Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris 195; Leuconostoc lactis S3); # – wyniki uzyskane przez ró¿nych badaczy.
4,0
Optymalne pH dzia³ania
(°C)
Optymalna temp. dzia³ania
4
270
131b
1
Penicillium
chrysogenum
Mucor
pusillus
Liczba monomerów
Masa cz¹steczkowa (kDa)
14
GS
13
GS
Charakterystyka b-galaktozydaz pochodz¹cych z ró¿nych Ÿróde³
b-D-galaktozydazy – Ÿród³a, w³aœciwoœci i zastosowanie
55
Marta Wanarska, Józef Kur
Enzym ma te¿ wysok¹ aktywnoœæ transglikozylacyjn¹. Wydajnoœæ reakcji transglikozylacji prowadzonej przez 24 godziny w 60°C i pH 5,0 wynosi 39%. G³ównymi
produktami s¹ tri- i tetrasacharydy oraz niewielka iloœæ oligosacharydów o wy¿szym
stopniu polimeryzacji (22).
Enzym o aktywnoœci b-D-galaktozydazy wyizolowano równie¿ z komórek hipertermofilnego archaeona Sulfolobus solfataricus. Masa cz¹steczkowa tej b-D-galaktozydazy wynosi 240 kDa. W formie natywnej enzym jest tetrametrem z³o¿onym z podjednostek o masie 60 kDa. Najwy¿sz¹ aktywnoœæ w reakcji z ONPG wykazuje w temperaturze 95°C i pH 6,5. b-D-galaktozydaza z S. solfataricus nie wymaga obecnoœci
dwuwartoœciowych jonów metali do zachowania wysokiej aktywnoœci. Zwi¹zki zawieraj¹ce grupy sulfhydrylowe powoduj¹ s³ab¹ aktywacjê enzymu. Natomiast obecnoœæ pCMB (inhibitora enzymów zawieraj¹cych w centrum aktywnym reszty cysteiny)
nie powoduje inaktywacji b-D-galaktozydazy. D-galaktoza nie zmienia aktywnoœci
enzymu w reakcji hydrolizy ONPG (40), jest natomiast s³abym inhibitorem w reakcji
hydrolizy laktozy (41). W badaniach nad wp³ywem D-glukozy na aktywnoœæ hydrolityczn¹ termostabilnej b-D-galaktozydazy, prowadzonych przez dwa niezale¿ne zespo³y badawcze wykazano, ¿e jest ona s³abym inhibitorem (40) lub te¿ aktywatorem
enzymu (41). b-D-galaktozydaza z S. solfataricus wykazuje niezwyk³¹ termostabilnoœæ.
Jej czas pó³trwania w 75, 80 i 85°C wynosi odpowiednio 24, 10 i 3 godziny (40). Enzym charakteryzuje siê szerokim spektrum substratowym. Katalizuje reakcjê hydrolizy wi¹zañ glikozydowych w syntetycznych b-D-galaktozydach, b-D-glukozydach
i b-D-fukozydach. Wykazuje równie¿ aktywnoœæ hydrolityczn¹ w stosunku do laktozy, celobiozy (O-b-D-glukopiranozylo-(1®4)-D-glukopiranoza) i oligomerów glukozy
o stopniu polimeryzacji 3 i 4 (aktywnoϾ egzoglukozydazy) (27). Szerokim spektrum
substratowym charakteryzuje siê równie¿ termostabilny enzym z archaeona Pyrococcus
furiosus. Wykazuje on jednak wy¿sz¹ aktywnoœæ hydrolityczn¹ w stosunku do b-D-glukozydów syntetycznych i naturalnych (p-nitrofenylo-b-D-glukopiranozyd, celobioza),
ni¿ b-D-galaktozydów (p-nitrofenylo-b-D-galaktopiranozyd, laktoza). Z tego wzglêdu
enzym ten zosta³ zakwalifikowany do b-D-glukozydaz (28). Mimo to prowadzono
badania nad wykorzystaniem obu hydrolaz glikozydowych (b-D-galaktozydazy
z S. solfataricus i b-D-glukozydazy z P. furiosus) zarówno do hydrolizy laktozy, jak
i syntezy oligosacharydów z laktozy w wysokiej temperaturze (41,42).
Geny koduj¹ce termostabilne enzymy z Thermus sp. T2, S. solfataricus, czy P. furiosus
klonowano w komórkach E. coli. Prowadzono równie¿ wydajn¹ biosyntezê termostabilnych enzymów w komórkach mezofilnego gospodarza i wykazano, ¿e rekombinowane bia³ka maj¹ zbli¿one w³aœciwoœci do enzymów wyizolowanych z naturalnego
Ÿród³a (34,41,43,44).
W Katedrze Mikrobiologii Politechniki Gdañskiej skonstruowano szereg uk³adów
ekspresyjnych pozwalaj¹cych na wydajn¹ biosyntezê termostabilnej b-D-galaktozydazy z hipertermofilnego archaeona Pyrococcus woesei (DSM 3773) w komórkach E. coli
i Pichia pastoris (45-47). Gen koduj¹cy termostabilne bia³ko zosta³ zidentyfikowany
i zsekwencjonowany. Na podstawie sekwencji nukleotydowej genu ustalono se56
PRACE PRZEGL¥DOWE
b-D-galaktozydazy – Ÿród³a, w³aœciwoœci i zastosowanie
kwencjê aminokwasow¹ kodowanego polipeptydu. Obliczona masa cz¹steczkowa
jednej podjednostki enzymu wynosi 59,056 kDa. b-D-galaktozydaza zosta³a oczyszczona i scharakteryzowana. Wyznaczona metod¹ filtracji ¿elowej masa cz¹steczkowa bia³ka wynosi 60 kDa (46) lub 122 kDa (47). Najwy¿sz¹ aktywnoœæ hydrolityczn¹
enzym wykazuje w pH 5,4 i 92-93°C (45-47). Enzym ma te¿ aktywnoœæ transglikozylacyjn¹. Jego aktywatorami s¹ zwi¹zki zawieraj¹ce grupy tiolowe, jony Mg2+ i D-galaktoza, a inhibitorami jony metali ciê¿kich i D-glukoza. Natomiast obecnoœæ kationów Ca2+ w mieszaninie reakcyjnej nie ma wp³ywu na aktywnoœæ tej b-D-galaktozydazy. Enzym nie wymaga obecnoœci dwuwartoœciowych jonów metali do zachowania wysokiej aktywnoœci. Po dializie wobec buforu zawieraj¹cego EDTA nie stwierdzono obni¿enia jego aktywnoœci (47).
Charakterystykê termostabilnych b-D-galaktozydaz zaprezentowano w tabeli.
5. Zastosowanie b-D-galaktozydaz
b-D-galaktozydazê, enzym katalizuj¹cy reakcjê hydrolizy laktozy, wykorzystuje
siê g³ównie w procesach produkcji mleka o niskiej zawartoœci laktozy, przeznaczonego dla osób cierpi¹cych z powodu nietolerancji tego disacharydu. Mleko o obni¿onej zawartoœci laktozy produkowane jest na skalê przemys³ow¹ w wielu krajach,
z zastosowaniem ró¿nych technologii. W Kanadzie produkcja mleka bezlaktozowego polega na aseptycznym dodawaniu preparatu b-D-galaktozydazy do mleka UHT
po sterylizacji, w czasie nape³niania kartonów. Nastêpnie mleko poddaje siê kilkudniowej inkubacji. Inn¹ metodê stosuje siê w Japonii. Mleko szczepi siê kultur¹
Lactobacillus, inkubuje przez 4 godziny, a nastêpnie poddaje sonifikacji. Inkubacjê
kontynuuje siê przez nastêpne 12 godzin, co prowadzi do uzyskania 71-74% stopnia
redukcji laktozy. W USA, oprócz przemys³owo produkowanego mleka bezlaktozowego, dostêpne s¹ preparaty enzymatyczne s³u¿¹ce do domowej hydrolizy laktozy.
Do mleka dodaje siê 5-15 kropli preparatu i inkubuje przez 24 godziny (58). W wielu
krajach dostêpne s¹ równie¿ tabletki zawieraj¹ce b-D-galaktozydazê, które nale¿y
przyjmowaæ przed wypiciem mleka. W Polsce mleko o obni¿onej zawartoœci laktozy
produkowane jest przez SM „Maækowy” w Gdañsku.
Mleko ze zhydrolizowan¹ laktoz¹ wykorzystywane jest do produkcji jogurtów.
W technologii wytwarzania jogurtu stosowane s¹ tzw. szczepionki jogurtowe, zawieraj¹ce szczepy bakterii Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus. Mikroorganizmy te maj¹ zdolnoœæ fermentacji laktozy. Zastosowanie mleka poddanego
wczeœniej dzia³aniu b-D-galaktozydazy, w celu roz³o¿enia laktozy na cukry proste
(D-glukozê i D-galaktozê), stymuluje rozwój tych bakterii, co pozwala na znaczne
skrócenie czasu fermentacji. Produkty hydrolizy laktozy s¹ ponadto znacznie od niej
s³odsze. St¹d wykorzystanie do produkcji jogurtów mleka ze zhydrolizowanym disacharydem eliminuje koniecznoœæ dodawania do nich sacharozy jako œrodka s³odz¹cego, co znacznie obni¿a kalorycznoœæ gotowych wyrobów.
BIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005
57
Marta Wanarska, Józef Kur
Mleko o obni¿onej zawartoœci laktozy stosowaæ mo¿na do produkcji mleka
skondensowanego i lodów w celu wyeliminowania wady „piaszczystoœci”, która prowadzi do pogorszenia ich w³aœciwoœci organoleptycznych. M¹czny lub piaszczysty
posmak produktów powstaje na skutek krystalizacji laktozy podczas zagêszczania
lub/i pod wp³ywem niskiej temperatury stosowanej w procesach technologicznych.
Dodatek b-D-galaktozydazy przy produkcji twarogu skraca czas krzepniêcia mleka, zaœ sery wyprodukowane z mleka z dodatkiem enzymu szybciej dojrzewaj¹.
Enzymatyczna hydroliza laktozy zawartej w serwatce prowadzi do otrzymania
syropu glukozowo-galaktozowego. Syrop ten mo¿e zast¹piæ mleko odt³uszczone
i sacharozê w produktach piekarskich, cukierniczych i mro¿onych produktach
mlecznych. Mo¿na go te¿ stosowaæ jako zamiennik cukru czy syropu glukozowego
w produkcji napojów.
Suszona serwatka ze zhydrolizowan¹ laktoz¹ mo¿e byæ wykorzystana równie¿
jako dodatek do pasz dla trzody chlewnej, byd³a i zwierz¹t futerkowych. Zagospodarowanie serwatki bêd¹cej uci¹¿liwym produktem ubocznym przemys³u mleczarskiego ma ogromne znaczenie dla ochrony œrodowiska. Obecnie znaczna czêœæ serwatki traktowana jest jako odpad i podlega utylizacji lub czasami trafia do œcieków.
Wykorzystanie transglikozylacyjnej aktywnoœci b-D-galaktozydazy umo¿liwia produkcjê oligosacharydów glukozowo-galaktozowych, stosowanych jako cenne dodatki do ¿ywnoœci. Ze wzglêdu na swoje w³aœciwoœci, oligosacharydy zaliczone zosta³y
do sk³adników ¿ywnoœci funkcjonalnej, czyli takiej, która oprócz tradycyjnie uznanej wartoœci od¿ywczej, wywiera równie¿ korzystny wp³yw na zdrowie cz³owieka.
Od 1991 r., kiedy Ministerstwo Zdrowia i Opieki Spo³ecznej Japonii nada³o status
FOSHU (Foods for Specified Health Use) czterem typom oligocukrów (fruktooligosacharydy, galaktooligosacharydy, palatynozooligosacharydy i oligosacharydy z ziaren
soi) (59), prowadzone s¹ intensywne badania nad w³aœciwoœciami, sposobami produkcji i zastosowaniem ró¿nych typów oligosacharydów. Obecnie na œwiecie produkuje siê ponad 20 rodzajów oligocukrów nie ulegaj¹cych rozk³adowi pod wp³ywem
ludzkich enzymów trawiennych (NDOs). Niektóre izolowane s¹ z naturalnych Ÿróde³
na drodze ekstrakcji (oligosacharydy z ziaren soi), otrzymuje siê je równie¿ poprzez
enzymatyczn¹ hydrolizê polisacharydów (ksylo- i izomaltooligosacharydy) lub jako
produkt katalizowanej enzymatycznie reakcji transglikozylacji (frukto- i galaktooligosacharydy) (59,60).
Galaktooligosacharydy (GOS) to wêglowodany z³o¿one z cz¹steczek D-glukozy
i D-galaktozy po³¹czonych wi¹zaniami glikozydowymi. Tak jak inne NDOs, galaktooligosacharydy nie ulegaj¹ hydrolizie pod wp³ywem dzia³ania ludzkich enzymów
trawiennych. S¹ natomiast substratem reakcji fermentacji prowadzonej przez specyficzne gatunki bakterii zasiedlaj¹ce jelito grube. Podstawow¹ zalet¹ GOS (a tak¿e innych oligosacharydów) jest zdolnoœæ do stymulowania rozwoju i aktywnoœci szczepów Bifidobacterium i Lactobacillus w okrê¿nicy. Sprzyja to utrzymaniu równowagi
w sk³adzie mikroflory jelitowej, hamuje rozwój bakterii chorobotwórczych (Escherichia
coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus) i w efekcie zapobiega infekcjom. Spo¿y58
PRACE PRZEGL¥DOWE
b-D-galaktozydazy – Ÿród³a, w³aœciwoœci i zastosowanie
wanie oligosacharydów pomaga te¿ w odbudowie naturalnej mikroflory jelitowej po
kuracji antybiotykowej. Ponadto dieta zawieraj¹ca galaktooligosacharydy sprzyja
obni¿eniu poziomu cholesterolu we krwi, zapobiega nadciœnieniu, a tak¿e zmniejsza ryzyko powstawania nowotworów jelita grubego (60,61). Ze wzglêdu na wymienione prozdrowotne w³aœciwoœci galaktooligosacharydów, znalaz³y one zastosowanie jako dodatek do ¿ywnoœci, g³ównie jogurtów i napojów mlecznych zawieraj¹cych ¿ywe kultury bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium. GOS stosowane
s¹ równie¿ jako dodatek do od¿ywek dla niemowl¹t (59).
Galaktooligosacharydy nie ulegaj¹ hydrolizie pod wp³ywem ludzkich enzymów
trawiennych, posiadaj¹ zatem ni¿sz¹ wartoœæ energetyczn¹ od sacharozy. Dziêki
temu znalaz³y zastosowanie jako œrodek s³odz¹cy przy produkcji napojów, s³odyczy,
d¿emów, a tak¿e pieczywa. Ich du¿a zdolnoœæ wi¹zania wody powoduje ponadto, ¿e
pieczywo d³ugo pozostaje œwie¿e. GOS s¹ odporne na wysok¹ temperaturê i zachowuj¹ swoje w³aœciwoœci po obróbce cieplnej ¿ywnoœci.
Na skalê przemys³ow¹ galaktooligosacharydy produkowane s¹ z laktozy z zastosowaniem enzymów b-D-galaktozydaz wykazuj¹cych aktywnoœæ transglikozylacyjn¹.
Komercyjnie dostêpne GOS s¹ mieszanin¹ galaktooligosacharydów o ró¿nej d³ugoœci, laktozy oraz D-glukozy i D-galaktozy. Procentowy sk³ad mieszaniny i budowa
chemiczna oligosacharydów uzale¿nione s¹ od Ÿród³a enzymu, stê¿enia substratu
i warunków prowadzenia reakcji.
Stosuj¹c b-D-galaktozydazê z Bacillus circulans lub Cryptococcus laurentii uzyskuje siê
galaktooligosacharydy, w których podjednostki cukrowe po³¹czone s¹ g³ównie wi¹zaniami b-1,4-glikozydowymi. Je¿eli reakcja transglikozylacji katalizowana jest przez enzym wyizolowany z Aspergillus oryzae lub Streptococcus thermophilus, w cz¹steczkach oligocukrów wystêpuj¹ przede wszystkim wi¹zania b-1,6-glikozydowe (60). Ponadto
w przypadku stosowania b-D-galaktozydazy z A. oryzae g³ównym produktem reakcji s¹
trisacharydy (57,60,62), zaœ u¿ycie enzymu z B. circulans pozwala na uzyskanie, obok
trisacharydów, stosunkowo du¿ej iloœci tetra- i pentasacharydów (57,60).
Najwiêksza iloœæ oligosacharydów o stopniu polimeryzacji 3-6 powstaje przy wysokim stê¿eniu laktozy (5,57,60,62). W przypadku niskiego stê¿enia substratu
w mieszaninie reakcyjnej, g³ównymi produktami reakcji s¹ disacharydy, w których
cz¹steczki glukozy i galaktozy po³¹czone s¹ innymi wi¹zaniami ni¿ w laktozie – allolaktoza i galaktobioza (5). Stê¿ony roztwór laktozy otrzymywany jest g³ównie
z serwatki, w której zawartoœæ tego disacharydu dochodzi do 80% suchej masy.
Dobór temperatury i pH w jakich prowadzona jest reakcja transglikozylacji uzale¿niony jest od w³aœciwoœci stosowanej b-D-galaktozydazy. Podwy¿szenie temperatury wp³ywa przede wszystkim na zwiêkszenie rozpuszczalnoœci laktozy i pozwala
uzyskaæ wy¿sze stê¿enie pocz¹tkowe substratu, które ma ogromny wp³yw na wydajnoœæ procesu. Chroni te¿ przed zanieczyszczeniem œrodowiska reakcji niepo¿¹dan¹
mikroflor¹. Wysokoœæ temperatury limitowana jest stabilnoœci¹ termiczn¹ enzymu.
Z tego powodu coraz czêœciej prowadzone s¹ badania nad wykorzystaniem termostabilnych b-D-galaktozydaz do syntezy oligosacharydów (42,63).
BIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005
59
Marta Wanarska, Józef Kur
Wzrastaj¹ce zapotrzebowanie na galaktooligosacharydy sk³ania do poszukiwania nowych b-D-galaktozydaz wykazuj¹cych wysok¹ aktywnoœæ tranglikozylacyjn¹,
a tak¿e wydajnych metod immobilizacji enzymów pozwalaj¹cych na produkcjê GOS
w przemys³owych procesach ci¹g³ych (22,62,64).
W procesach przemys³owych wykorzystywane s¹ hydrolazy glikozydowe pochodz¹ce z organizmów mezofilnych: grzybów strzêpkowych Aspergillus niger i Aspergillus
oryzae oraz dro¿d¿y Kluyveromyces lactis i Kluyveromyces fragilis. Enzymy te posiadaj¹
status substancji GRAS (Generally Recognized as Safe) nadany przez U.S. Food and
Drug Administration (FDA) (65). b-D-galaktozydazy izolowane z grzybów strzêpkowych, wykazuj¹ce wysok¹ aktywnoœæ przy pH 3,5-4,5, stosowane s¹ do hydrolizy
laktozy w kwaœnej serwatce. Natomiast enzymy pochodz¹ce z dro¿d¿y, aktywne
w zakresie pH 6,0-7,0, wykorzystuje siê w przetwórstwie mleka i s³odkiej serwatki
(23).
6. Uwagi koñcowe
Enzymy jako katalizatory reakcji chemicznych znalaz³y szerokie zastosowanie
w wielu ga³êziach przemys³u. Istnieje jednak wiele problemów zwi¹zanych z ich
praktycznym wykorzystaniem. Czynnikiem limituj¹cym jest ich wysoka cena. Wi¹¿e
siê ona przede wszystkim z du¿ymi kosztami zwi¹zanymi z ich izolacj¹ i oczyszczaniem. Powa¿n¹ wad¹ katalizatorów bia³kowych jest stosunkowo szybka utrata aktywnoœci, zwi¹zana z niestabilnoœci¹ ich struktury, po wyizolowaniu z naturalnego
œrodowiska jakim jest ¿ywa komórka. Enzymy s¹ wra¿liwe na zmiany warunków fizykochemicznych, takich jak: temperatura, pH, czy obecnoœæ substancji pe³ni¹cych
rolê aktywatorów lub inhibitorów. Przez d³ugi czas uwa¿ano równie¿, ¿e biokatalizatory mog¹ dzia³aæ tylko w œrodowisku wodnym, co znacznie ogranicza³o zakres
ich stosowania. Bardzo wa¿na dla przydatnoœci enzymu w procesach przemys³owych jest cena i iloœæ dostêpnego komercyjnie biokatalizatora. Obecnie wiêkszoœæ
enzymów wytwarzana jest przez rekombinowane szczepy drobnoustrojów, dziêki
czemu s¹ znacznie tañsze od bia³ek wyizolowanych z komórek ich naturalnego producenta. Biosynteza termostabilnych b-D-galaktozydaz w komórkach mezofilnych
gospodarzy (np. E. coli), znacznie u³atwia proces ich oczyszczania. Znaczn¹ czystoœæ
preparatu mo¿na uzyskaæ ju¿ we wstêpnym etapie polegaj¹cym na termicznej denaturacji bia³ek mezofilnego mikroorganizmu. Uproszczenie metodyki oczyszczania
bioproduktu zwiêksza wydajnoœæ procesu i znacznie redukuje zwi¹zane z nim koszty. Ponadto zwarta struktura cz¹steczek termostabilnych bia³ek sprawia, ¿e s¹ one
mniej podatne na zmiany konformacji spowodowane tworzeniem wi¹zañ pomiêdzy
enzymem a z³o¿em w procesie immobilizacji. Dziêki temu unieruchomione termostabilne biokatalizatory zachowuj¹ wysok¹ aktywnoœæ. Immobilizacja b-D-galaktozydaz umo¿liwia stosowanie ich w procesach ci¹g³ych. W tym przypadku wystêpuje
jednak du¿e prawdopodobieñstwo zanieczyszczenia mikrobiologicznego bioreakto60
PRACE PRZEGL¥DOWE
b-D-galaktozydazy – Ÿród³a, w³aœciwoœci i zastosowanie
ra. Prowadzenie reakcji w wysokiej temperaturze z zastosowaniem enzymów termostabilnych ca³kowicie eliminuje to niebezpieczeñstwo. Pozwala równie¿ na jednoczesne wytwarzanie produktów i ich obróbkê ciepln¹, co jest niezwykle u¿yteczne w przemyœle spo¿ywczym.
Literatura
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
Kirk O., Borchert T. V., Fuglsang C. C., (2002), Curr. Opin. Biotechnol., 13, 345-351.
Rasor J. P., Voss E., (2001), Appl. Catal. A: General., 221, 145-158.
van Beilen J. B., Li Z., (2002), Curr. Opin. Biotechnol., 13, 338-344.
Synowiecki J., (1998), Biotechnologia, 3, 42, 98-105.
Mahoney R. R., (1998), Food Chem., 63, 147-154.
Stevenson D. E., Stanley R. A., Furneaux R. H., (1993), Biotechnol. Bioeng., 42, 657-666.
Scheckermann C., Wagner F., Fischer L., (1997), Enzyme Microb. Technol., 20, 629-634.
van Rantwijk F., Woudenberg-van Oosterom M., Sheldon R. A., (1999), J. Mol. Catal. B: Enzymatic,
6, 511-532.
van Laere K. M. J., Abee T., Schols H. A., Beldman G., Voragen A. G. J., (2000), Appl. Environ. Microbiol., 66, 1379-1384.
Vetere A., Paoletti S., (1998), Biochim. Biophys. Acta, 1380, 223-231.
Widmer F., Leuba J-L., (1979), Eur. J. Biochem., 100, 559-567.
van Casteren W. H. M., Eimermann M., van den Broek L. A. M., Vincken J-P., Schols H. A., Voragen A.
G. J., (2000), Carb. Res., 329, 75-85.
Tanaka Y., Kagamiishi A., Kiuchi A., Horiuchi T., (1975), J. Biochem., 77, 241-247.
Akasaki M., Suzuki M., Funakoshi I., Yamashina I., (1976), J. Biochem., 80, 1195-1200.
Ladero M., Santos A., Garcia J. L., Carrascosa A. V., Pessela B. C. C., Garcia-Ochoa F., (2002), Enzyme
Microb. Technol., 30, 392-405.
Dickson R. C., Dickson L. R., Markin J. S., (1979), J. Bacteriol., 137, 51-61.
Sheridan P. P., Brenchley J. E., (2000), Appl. Environ. Microbiol., 66, 2438-2444.
Jacobson R. H., Zhang X-J., DuBose R. F., Matthews B. W., (1994), Nature, 369, 761-766.
Coker J. A., Sheridan P. P., Loveland-Curtze J., Gutshall K. R., Auman A. J., Brenchley J. E., (2003), J.
Bacteriol., 185, 5473-5482.
Turkiewicz M., Kur J., Bia³kowska A., Cieœliñski H., Kalinowska H., Bielecki S., (2003), Biomol. Eng.,
20, 317-324.
Nagy Z., Kiss T., Szentirmai A., Biro S., (2001), Protein Expr. Purif., 21, 24-29.
Onishi N., Tanaka T., (1995), Appl. Environ. Microbiol., 61, 4026-4030.
Kowalewska-Piontas J., (1993), Przegl¹d Mleczarski, 3, 197-200.
Holmes M. L., Scopes R. K., Moritz R. L., Simpson R. J., Englert C., Pfeifer F., Dyall-Smith M. L.,
(1997), Biochim. Biophys. Acta, 1337, 276-286.
Cieœliñski H., Kur J., Bia³kowska A., Baran I., Makowski K., Turkiewicz M., (2005), Protein Expr. Purif., 39, 27-34.
Synowiecki J., Maciuñska J., (2000), Biotechnologia, 1, 48, 117-123.
Nucci R., Moracci M., Vaccaro C., Vespa N., Rossi M., (1993), Biotechnol. Appl. Biochem., 17,
239-250.
Kengen S. W. M., Luesink E. J., Stams A. J. M., Zehnder A. J. B., (1993), Eur. J. Biochem., 213,
305-312.
Onishi N., Tanaka T., (1996), J. Ferment. Bioeng., 82, 439-443.
Huang D. Q., Prevost H., Divies C., (1995), Int. Dairy J., 5, 29-43.
Ismail S. A., Mabrouk S. S., Mahoney R. R., (1997), J. Food Biochem., 21, 145-162.
Cowan D. A., Daniel R. M., Martin A. M., Morgan H. W., (1984), Biotechnol. Bioeng., 26, 1141-1145.
Ulrich J. T., McFeters G. A., Temple K. L., (1972), J. Bacteriol., 110, 691-698.
BIOTECHNOLOGIA 4 (71) 46-62 2005
61
Marta Wanarska, Józef Kur
34. Vian A., Carrascosa A. V., Garcia J. L., Cortes E., (1998), Appl. Environ. Microbiol., 64, 2187-2191.
35. Ohtsu N., Motoshima H., Goto K., Tsukasaki F., Matsuzawa H., (1998), Biosci. Biotechnol. Biochem.,
62, 1539-1545.
36. Hidaka M., Fushinobu S., Ohtsu N., Motoshima H., Matsuzawa H., Shoun H., Wakagi T., (2002), J.
Mol. Biol., 322, 79-91.
37. Berger J-L., Lee B. H., Lacroix C., (1997), Biotechnol. Appl. Biochem., 25, 29-41.
38. Shaikh S. A., Khire J. M., Khan M. I., (1999), Biochim. Biophys. Acta, 1472, 314-322.
39. Batra N., Singh J., Banerjee U. C., Patnaik P. R., Sobti R. C., (2002), Biotechnol. Appl. Biochem., 36,
1-6.
40. Pisani F. M., Rella R., Raia C. A., Rozzo C., Nucci R., Gambacorta A., de Rosa M., Rossi M., (1990),
Eur. J. Biochem., 187, 321-328.
41. Petzelbauer I., Nidetzky B., Haltrich D., Kulbe K. D., (1999), Biotechnol. Bioeng., 64, 322-332.
42. Petzelbauer I., Zeleny R., Reiter A., Kulbe K. D., Nidetzky B., (2000), Biotechnol. Bioeng., 69,
140-149.
43. Moracci M., Nucci R., Febbraio F., Vaccaro C., Vespa N., la Cara F., Rossi M., (1995), Enzyme Microb.
Technol., 17, 992-997.
44. Pessela B. C. C., Vian A., Mateo C., Fernandez-Lafuente R., Garcia J. L., Guisan J. M., Carrascosa A. V.,
(2003), Appl. Environ. Microbiol., 69, 1967-1972.
45. D¹browski S., Maciuñska J., Synowiecki J., (1998), Mol. Biotechnol., 10, 217–222.
46. Maciuñska J., (1999), Otrzymywanie i w³aœciwoœci termostabilnych b-D-galaktozydaz wytwarzanych przez
Thermus thermophilus i zmodyfikowan¹ genetycznie Escherichia coli, rozprawa doktorska, Politechnika
Gdañska.
47. Wanarska M., (2005), Termostabilna b-D-galaktozydaza Pyrococcus woesei – konstrukcja nowych systemów ekspresyjnych, oczyszczanie, charakterystyka i immobilizacja enzymu, rozprawa doktorska, Politechnika Gdañska.
48. www.prozyme.com
49. Reithel F. J., Newton R. M., Eagleson M., (1966), Nature, 210, 1265.
50. Shifrin S., Grochowski B. J., Luborsky S. W., (1970), Nature, 227, 608-609.
51. Lederberg J., (1950), J. Bacteriol., 60, 381-392.
52. Ladero M., Santos A., Garcia J. L., Garcia-Ochoa F., (2001), Enzyme Microb. Technol., 29, 181-193.
53. Onishi N., Yamashiro A., Yokozeki K., (1995), Appl. Environ. Microbiol., 61, 4022-4025.
54. Roy I., Gupta M. N., (2003), Proc. Biochem., 39, 325-332.
55. Santos A., Ladero M., Garcia-Ochoa F., (1998), Enzyme Microb. Technol., 22, 558-567.
56. Rustom I. Y. S., Foda M. I., Lopez-Leiva M. H., (1998), Food Chem., 62, 141-147.
57. Boon M. A., Janssen A. E. M., van’t Riet K., (2000), Enzyme Microb. Technol., 26, 271-281.
58. Bielecka M., (1998), Przemys³ Spo¿ywczy, 52, 13-15.
59. Crittenden R. G., Playne M. J., (1996), Trends Food Sci. Technol., 7, 353-361.
60. Sako T., Matsumoto K., Tanaka R., (1999), Int. Dairy J., 9, 69-80.
61. Demczuk A., Bednarski W., Kowalewska-Piontas J., (2004), Biotechnologia 3, 66, 152-165.
62. Lopez Leiva M. H., Guzman M., (1995), Proc. Biochem., 30, 757-762.
63. Reuter S., Rusborg Nygaard A., Zimmermann W., (1999), Enzyme Microb. Technol., 25, 509-516.
64. Shin H-J., Park J-M., Yang J-W., (1998), Proc. Biochem., 33, 787-792.
65. www.fda.gov
62
PRACE PRZEGL¥DOWE