Epifity bakteryjne z Salvinia natans eksponowane na rtęć - Eko-DOk

Epifity bakteryjne z Salvinia natans eksponowane na rtęć - Eko-DOk

rtęć, Salvinia natans, Microtox,
bakterie oporne na rtęć
Viktoriya FILYAROVSKAYA, Teodora M. TRACZEWSKA*
EPIFITY BAKTERYJNE Z SALVINIA NATANS
EKSPONOWANE NA RTĘĆ
Zainteresowanie rtęcią w skali światowej jest związane z jej właściwościami fizyko-chemicznymi
oraz z dużą toksycznością. Ten metal ciężki jest jednym z najbardziej toksycznych pierwiastków, który nie spełnia żadnych funkcji biologicznych w żywych organizmach oraz raz wprowadzony do środowiska nie ulega zanikowi pozostając w nim na zawsze. Mikroflora (bakterie i grzyby) bierze aktywny udział w transformacji związków rtęci w środowisku naturalnym. Oprócz zdolności do
metylacji (np. Pseudomonas spp.) pewne szczepy posiadają właściwości pozwalające na redukcję
związków rtęci do postaci lotnej. System detoksykacji kodowany przez operon mer jest rozpoznawany zarówno w bakteriach Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych. W pracy przedstawiono wstępne
wyniki badań oporności na azotan rtęci (II). W celu określenia toksyczności rtęci zastosowano test
przesiewowy Microtox.
1. WSTĘP
Rtęć jest jednym z najbardziej toksycznych metali ciężkich i jedynym pierwiastkiem
metalicznym mający ciekły stan skupienia i wysokie ciśnienie pary (1,9×10-3 mmHg) w
temperaturze pokojowej. To jedyny pierwiastek, nie licząc gazów szlachetnych (helowców), posiadający zdolność do występowania w postaci gazu monoatomicznego (rtęć lotna).
Rtęć występuje na trzech stopniach utlenienia: Hg0, Hg2II (HgI) i HgII. Najczęściej metal
ten przybiera II i 0 stopień utlenienia. I stopień utlenienia w postaci Hg2II jest mniej powszechny w środowisku naturalnym niż pozostałe [2].
__________
* Politechnika Wrocławska, Wydział Inżynierii Środowiska, Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki,
pl. Grunwaldzki 9, 50-377 Wrocław, [email protected]
148
V. FILYAROVSKAYA, T.M. TRACZEWSKA
Toksyczność rtęci zależy od formy występowania. Najmniej toksycznym związkiem
tego metalu jest rtęć pierwiastkowa (lotna). Niemniej jednak stężenie par rtęci powyżej
1 mg/m3 uszkadza tkankę płucną, powodując ostre zapalenie płuc i oskrzeli. Najbardziej
toksycznymi są związki metaloorganiczne rtęci takie jak metylortęć CH3HgX oraz dimetylortęć (CH3)2Hg. Związki te charakteryzują się trwałością, nie ulegają hydrolizie i wykazują się dużym powinowactwem do grup tiolowych białek. Następstwem tego jest destrukcja
stabilizujących mostków disiarczkowych, co powoduje denaturację białek [8].
Rtęć nie posiada żadnych właściwości niezbędnych dla żywych organizmów. W odróżnieniu od miedzi lub cynku działanie rtęci na organizm ludzki jest wyłącznie toksyczne.
Zatrucie tym metalem ciężkim negatywnie wpływa na układ nerwowy (utrata pamięci,
choroba Alzheimera, ataksja, subkliniczne drżenie palców, zaburzenia słuchu, wzroku),
układ immunologiczny, rozrodczy (duży procent upośledzeń płodu), wydalniczy (szczególnie na nerki) oraz sercowo-naczyniowy.
W środowisku naturalnym głównymi źródłami rtęci są procesy takie jak: aktywność
wulkaniczna, parowanie oceanów, wietrzenie skał, emanacja z powierzchni ziemi oraz
pożary leśne.
Z powodu zdolności rtęci do rozpuszczania metali do postaci amalgamatu znalazła ona
wykorzystanie w wielu dziedzinach przemysłu. Oprócz wydobywania metali szlachetnych
w rudach, rtęć jest wykorzystywana w elektrolizie litowców, przy produkcji lamp rtęciowych, aparatów pomiarowych (termometrów, barometrów), w przemyśle elektrotechnicznym, chloro-alkalicznym, chemicznym, farmaceutycznym, w sektorze produktów PCV [3].
Między innymi jednym z głównych źródeł antropogenicznych rtęci jest proces spalania
węgla, który stanowi 45 % całkowitej antropogenicznej emisji metalu [1]. Nieorganiczne
sole rtęci takie jak: chlorek rtęciowy, azotan rtęciawy i siarczek rtęciowy znalazły zastosowanie w impregnowaniu drewna, produkcji akumulatorów, trawieniu stali itd. Organiczne związki pierwiastka stosuje się jako środki bakteriobójcze, konserwujące i grzybobójcze.
Ze względu na dużą toksyczność oraz powszechne zastosowanie w przemyśle niezwykle ważnym jest usuwanie rtęci ze środowiska (szczególnie wód użytkowych) do wartości
normatywnych oraz poszukiwanie alternatywnych a zarazem efektywnych metod oczyszczania, między innymi z użyciem szczepów bakteryjnych opornych na rtęć.
Mikroflora (bakterie, grzyby) bierze czynny udział w transformacji rtęci w środowisku
naturalnym.
Istnieje co najmniej pięć mechanizmów obronnych przed działaniem rtęci:
- obniżenie przepuszczalności ściany komórkowej;
- tworzenie nierozpuszczalnych siarczków rtęci;
- konwersja związków rtęci poprzez metylację;
- konwersja nielotnych związków rtęci do rtęci lotnej (Hg0) [4].
W pracy podjęto próbę izolacji bakterii poroślowych z Salvinia natans opornych na
rtęć w celu ich późniejszego zastosowania we wspomaganiu procesu fitoremediacji.
Epifity bakteryjne z salvinia natans eksponowane na rtęć
149
2. MATERIAŁY I METODY
Materiał do badań oporności na rtęć stanowiły bakterie epifityczne pleustofitów
Salvinia natans pobrane ze środowiska naturalnego (rzeka Oława we Wrocławiu) w
okresie wegetacyjnym (rys.1).
Rys. 1. Salvinia natans rzeczna
Pobrany materiał (rzeczne Salvinia natans) wytrząsano w roztworze fizjologicznym za pomocą łaźni ultradźwiękowej przez 15 minut, następnie dokonano serii rozcieńczeń uzyskanej zawiesiny bakteryjnej. Z wybranych zdrowych roślin wykonano
odciski korzeni i liści oraz homogenat roślinny w porcelanowym moździerzu. Uzyskane w ten sposób szczepy posiewano na trzech podłożach bakteriologicznych: agarze odżywczym, podłożu mineralnym z glukozą (0,5 %) oraz podłożu mineralnym z
biotyną dla określenia optymalnego składu pożywki. Wszystkie podłoża zostały kontaminowane roztworem azotanu rtęci (II) o stężeniu 0,15 mgHg/l.
Płytki z materiałem bakteryjnym inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 22°.
Po 2 dobach dokonano izolacji mikroorganizmów. Po oczyszczeniu kulturę bakteryjną
posiano na płytki gradientowe zawierającą stężenie rtęci od 0,15 mgHg/dm3 do 0,30
mgHg/dm3. Wykonano barwienie Grama najbardziej opornych szczepów bakterii.
Równolegle toksyczność roztworu metalu określono za pomocą Testu Toksyczności Ostrej Microtox wykorzystującym zdolność do bioluminescencji bakterii morskich
Vibrio fischeri. Jest to szybki test przesiewowy, w którym wykorzystuje się bakterie
morskie Photobacterum phosphereum (Vibrio fischeri). Poziom toksyczności, wyra-
150
V. FILYAROVSKAYA, T.M. TRACZEWSKA
żanej jako EC50 (stężenia, powodującego wystąpienie 50% reakcji testowej) mierzy
się za pomocą lumometru. Monitoruje on intensywność światła emitowanego przez
bakterie w jednostce czasu w wyniku interakcji z substancją toksyczną. Zaletą testu
jest szybkość, czułość, prostota w obsłudze oraz powtarzalność [6]. Jako odczynnik
pomiarowy, system Microtox używa liofilizowane bakterie.
Pomiar prowadzono na Analizatorze Microtox model 500. Do oznaczenia toksyczności roztworów rtęci (0,15 mgHg/dm3, 0,20 mgHg/dm3 oraz 0,30 mgHg/dm3) zastosowano procedurę 81,9% Screening Test.
2. WYNIKI BADAŃ I ICH OMÓWIENIE
Badania mające na celu określenie najlepszego podłoża dla wzrostu bakterii pokazały, że najbardziej sprzyjającą rozwoju kolonii pożywką jest agar odżywczy (od
1,28·109 jtk/cm3 do 2,78·109 jtk/cm3) (rys.2), a najmniej podłoże mineralne z biotyną,
na której wyizolowane mikroorganizmy najsłabiej rosły (tabela 1).
Rys. 2. Szczepy bakteryjne na agarze odżywczym
Jednak ze względu na skład podłoża z agarem odżywczym pożywka została odrzucona w dalszych badaniach w związku z obecnością w niej między innymi wyciągu
z kazeiny. Rtęć cechująca się łatwością wiązania z grupą tiolową z dużym prawdopodobieństwem mogła być związana w pożywce i niedostępna dla bakterii. Proces ten
mógł powodować bardzo dobry wzrost na pożywce kontaminowanej i wpłynąć na
wyniki badań.
Epifity bakteryjne z salvinia natans eksponowane na rtęć
151
Do dalszych badań wybrano pożywkę mineralną z 0,5 % zawartością glukozy.
Tabela 1. Przykładowy chromosom
Numer
szczepu
1
2
Agar odżywczy
Podłoże mineralne z glukozą
+++
+++
++
+
Podłoże mineralne
z biotyną
brak wzrostu
-
3
+++
++
bardzo słaby wzrost
4
5
6
7
8
9
10
11
12
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++
+++
++
+
+
++
+
++
+++
bardzo słaby wzrost
bardzo słaby wzrost
bardzo słaby wzrost
-
Z kolei posiew wyizolowanych szczepów na płytki gradientowe (w zakresie od
0,15 mgHg/dm3 do 0,30 mgHg/dm3) pozwolił określić wartość stężenia badanego
roztworu rtęci przy którym nie rosły wyizolowane szczepy (rys.3.).
Rys. 3. Płytki gradientowe (podłoże mineralne z glukozą)
152
V. FILYAROVSKAYA, T.M. TRACZEWSKA
Z siedemnastu wyizolowanych szczepów współistniejących z makrofitami Salvinia
natans dwanaście było opornych na stężenie rtęci wynoszące 0,15 mgHg/dm3 oraz
osiem szczepów opornych na stężenie rtęci wynoszące 0,30 mgHg/dm3 (tabela 2).
Tabela 2. Wybrane cechy szczepów bakteryjnych współistniejących z makrofitem Salvinia natans
G +/-
Kształt
komórek
bakteryjnych
Oporność na
0,15
mgHg/dm³
Oporność
na
0,30
mgHg/dm³
Homogenat roślinny
+
ziarniaki
+
+
2
Homogenat roślinny
+
ziarniaki
+
+
3
Liść rośliny 1
-
pałeczki
+
+
4
Liść rośliny 2
-
pałeczki
słaby wzrost
-
5
Korzeń rośliny1
-
płeczki
+
-
6
Korzeń rośliny 2
-
pałeczki
słaby wzrost
-
7
Materiał uzyskany za
pomocą ultradźwięku (w
roztworze fizjologicznym)
+
laseczki
słaby wzrost
-
8
Materiał uzyskany za
pomocą ultradźwięku
-
pałeczki
+
+
9
Liść rośliny 4
-
pałeczki
+
-
10
Liść rośliny 5
-
pałeczki
+
-
11
Korzeń rośliny 3
-
pałeczki
+
-
12
Korzeń rośliny 4
-
pałeczki
+
-
Numer
szczepu
Miejsce poboru
1
Barwienie Grama pokazało, że 22 % opornych szczepów stanowią bakterie Gramdodatnie (ziarniaki), pozostałe 88 % to bakterie Gram-ujemne (pałeczki).
Test przesiewowy Microtox był wykonany dla trzech stężeń rtęci: 0,15 mgHg/dm3,
0,20 mgHg/dm3 i 0,30 mgHg/dm3 w dwóch powtórzeniach. Uśrednione wyniki przedstawiono na rysunku 4.
Analiza wyników, uzyskanych przy zastosowaniu testu pozwoliła na określenie
procentu efektu toksycznego (PE) dla poszczególnych stężeń roztworów rtęci. Najwyższa wartość stężenia (0,30 mgHg/dm3) cechowała się największym procentem
efektu toksycznego (83,99 % po 5 minutach i 97,84 % po 15 minutach działania metalu). Najmniejsze badane stężenie (0,15 mgHg/dm3) spowodowało najmniejszy spadek
Epifity bakteryjne z salvinia natans eksponowane na rtęć
153
luminescencji (procent efektu toksycznego wyniósł 27,07 % po 5 minutach i 27,12 %
po 15). Wyniki testu potwierdzają fakt inhibicji enzymów życiowo ważnych dla metabolizmu i w wyniku tego zmniejszenia ilości emitowanego światła przez komórki
bakteryjne Vibrio fischeri w zależności od stężenia rtęci. Wraz ze wzrostem stężenia
zwiększa się toksyczność badanego metalu ciężkiego.
Rys. 4. Procent efektu toksycznego (PE) dla roztworów rtęci uzyskane w teście przesiewowym
W tekstach polskojęzycznych należy liczbę całkowitą od dziesiętnej oddzielać
przecinkiem (nie kropką).
Miana od wartości liczbowej należy oddzielać spacją, z wyjątkiem %.
W przypadku zbiegnięcia się dwóch elementów, przed i po których występują dodatkowe odległości (wzór i tabela, rysunek i tabela, tytuły I i II rzędu), proszę usunąć
światło po pierwszym elemencie.
Jeżeli na stronie nie mieści się dalszy ciąg tekstu łącznie z rozpoczynającym go tytułem, proszę umieścić go od góry następnej strony, bez odstępu przed nim.
3. WNIOSKI
1. Wyizolowano szczepy współistniejące z makrofitami Salvinia natans najlepiej
rosnące na agarze odżywczym wykazały się opornością na azotan rtęci (II).
154
V. FILYAROVSKAYA, T.M. TRACZEWSKA
2. Z testowanych trzech pożywek bakteriologicznych najlepszym wzrostem bakterii
cechował się agar odżywczy, lecz ze względu na obecność białka w pożywce, do
dalszych badań wybrano podłoże mineralne z 0,5% glukozy.
3. Minimalne stężenie rtęci hamujące wzrost bakterii wynosiło 0,30 mg Hg/dm3.
4. Wyizolowano 12 szczepów bakteryjnych opornych na stężenia rtęci w zakresie
od 0,15 mgHg/dm3 do 0,30 mgHg/dm3.
Praca wykonana w ramach projektu MNiSW pod tytułem "Ocena skuteczności fitoremediacji wód skażonychj rtęcią (II)przez pleustofity Dolnego Śląska" Nr N N523
612139.
LITERATURA
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
Analiza kosztów i korzyści dla zdrowia ludzkiego i środowiska związanych z redukcją emisji rtęci
w Polsce. Etap I, 2009, Katowice.
HUTCHISON A.R. and ATWOOD D.A., Mercury pollution and remediation: the chemist’s response to a global crisis Journal of chemical crystallography, 2003, vol.33, 631-645.
KABATA-PENDIAS A., PENDIAS H., Biogeochemia pierwiastków śladowych, Wydawnictwo
Naukowe PWN, Warszawa, 1999, 170-184.
OSTROVSKII D.N., LYSAK E.I., DEMINA G.R., BINIUKOV V.I., Interaction of Bacteria with
Mercuric Compounds, Mikrobiologiia, 2000, vol.69(5), 516-523.
SCHLEGEL H.G, Mikrobiologia ogólna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2008, 79-86.
SILVER S., PHUNG L.T., A bacterial view of periodic table: genes and proteins for toxic inorganic
ions, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2005, Vol.32, 587-605.
TRACZEWSKA T.M., Biologiczne metody oceny skażenia środowiska, Oficyna Politechniki Wrocławskiej, Wrocław, 2011, 56-61.
ZAHIR F, RIZWI SJ, HAQ SK, KHAN RH, Low dose mercury toxicity and human health , 2005,
vol. 20(2), 351–360.
BACTERIAL EPIPHYTES FROM SALVINIA NATANS EXPOSED TO MERCURY
The global interest in mercury is connected to its physico-chemical properties and its high toxicity.
This heavy metal is one of the most toxic elements that don’t perform any biological functions in living
organisms, and once introduced into the environment it’s staying in it forever forever. To determine the
toxicity of mercury Microtox screening test was used. Microflora (bacteria and fungi) is actively involved
in the transformation of mercury compounds in the environment. Besides the ability to methylation (eg,
Pseudomonas spp), certain strains have properties that can reduce the mercury compounds to volatile
form. Given detoxification system encoded by the mer operon is recognized in both Gram-positive and
Gram-negative bacteria. In preliminary studies was presented results of bacterial resistance to mercury
nitrate. In order to determine the toxicity of mercury was applied screening-test Microtox.