Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce
Transkrypt
Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce
diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2012 • Volume 48 • Number 1 • 25-31 Praca oryginalna • Original Article Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce sferocytozy wrodzonej Usefulness of laboratory diagnostics in hereditary spherocytosis Wioleta Żarlak1, Anna Adamowicz-Salach2, Olga Ciepiela1, Iwona Kotuła1, Anna Szmydki-Baran2, Urszula Demkow1 1 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego, Warszawski Uniwersytet Medyczny, 2Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny Streszczenie Wprowadzenie: Sferocytoza wrodzona (ang. HS) jest najczęstszą wrodzoną niedokrwistością hemolityczną w populacji północnoeuropejskiej i Ameryce Północnej. Przyczyną HS są zaburzenia ilościowe i/lub jakościowe białek cytoszkieletu krwinek czerwonych: α i β spektryny, ankyryny, białka prążka 4.2 i przezbłonowego białka prążka 3. Cel badań: Celem pracy było porównanie przydatności diagnostycznej testu EMA z użyciem cytometru przepływowego oraz testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu AGLT50w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej. Materiał i metody: Badania zostały wykonane we krwi pełnej u 77 pacjentów z podejrzeniem HS. U pacjentów oceniano ekspresję białek błonowych erytrocytów przy pomocy cytometrycznego testu EMA oraz oporność osmotyczną krwinek czerwonych testem AGLT50. Wyniki: W przeprowadzonych badaniach wykazano, że test EMA charakteryzuje się 92,86% czułością i 100% swoistością w porównaniu ze 100% czułością i 66,6% swoistością testu AGLT50. Wnioski: Na podstawie przeprowadzonych badań można stwierdzić, że test EMA lepiej spełnia warunki badania przesiewowego w kierunku sferocytozy wrodzonej niż test AGLT50. Summary Introduction: Hereditary spherocytosis (HS) is the most common inherited hemolytic anaemia in Northern Europe and Northern America. The molecular basis of spherocytosis is a quantitative or qualitative deficiency or dysfunction of one of the erythrocyte’s membrane proteins: α and β spectrin, ankyrin, protein 4.2 or transmembrane band 3 protein. Aim: The aim of the study was to compare diagnostic usefulness of the flow cytometric (FC) analysis of EMA (eosin-5-maleimide) and acidified glycerol lysis test (AGLT50) in diagnostics of hereditary spherocytosis. Materials and methods: The study was performed in peripheral blood (PB) from 77 patients suspected of HS. Expression of erythrocytes membrane proteins was analyzed by FC EMA dye method and osmotic fragility was measured with acidified glycerol lysis test. Results: The results of the studies indicate, that sensitivity of the EMA dye method is 92,86%, whereas specificity was 100%. Although, the sensitivity of AGLT50 was 100%, the specificity was only 66,6%. Conclusions: On the basis of obtained results it can be concluded, that the eosin-5-maleimide (EMA) binding dye test is more accurate screening test for hereditary spherocytosis than acidified glycerol lysis test (AGLT50). Słowa kluczowe:sferocytoza wrodzona, test EMA, test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) Key words:hereditary spherocytosis, the EMA test, acidified glycerol lysis test (AGLT50) Wstęp Sferocytoza wrodzona (ang. hereditary spherocytosis, HS), zwana chorobą Minkowskiego-Chauffarda, jest najczęściej rozpoznawaną wrodzoną niedokrwistością hemolityczną w populacji północnoeuropejskiej i Ameryce Północne. Występuje z częstością około 1 przypadek na 2000-5000 urodzeń [1, 2, 3, 4]. Choroba może ujawnić się w każdym wie- ku, najczęściej jest rozpoznawana w okresie niemowlęcym i wczesnodziecięcym [1, 5, 6]. Sferocytoza wrodzona jest uwarunkowana genetycznie i w około 80% przypadków występuje rodzinnie. W około 75% przypadków dziedziczy się autosomalnie dominująco. Pozostałe 25% dziedziczy się w sposób autosomalny recesywny i/lub jest wynikiem mutacji powstałych de novo [3, 4, 6, 7, 8]. 25 Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce sferocytozy wrodzonej HS jest spowodowana zaburzeniami w budowie błony komórkowej krwinek czerwonych, które są wynikiem anomalii ilościowych i/lub jakościowych białek błony i cytoszkieletu powstałych na skutek mutacji w genach kodujących te białka. Obserwuje się niedobór jednego lub kilku białek, najczęściej α i β spektryny, ankyryny, białka prążka 4.2 i białka prążka 3 [1, 2, 6, 7, 8]. W większości przypadków sferocytozy wrodzonej nie jest znany niedobór białka. Jest to spowodowane tym, że elektroforezę białek błon erytrocytów (SDS-PAGE) i badania genetyczne wykonuje się bardzo rzadko [3]. Niedobór białek błonowych i cytoszkieletu jest przyczyną nieprawidłowej budowy krwinek czerwonych. Cechują się one osłabieniem budowy cytoszkieletu, zmniejszeniem powierzchni erytrocyta, utratą dwuwklęsłego kształtu i przyjęciem postaci kulistego sferocyta. Takie krwinki mają mniejszą elastyczność i zdolność do odkształcania podczas przechodzenia przez drobne naczynia włosowate. Uszkodzone krwinki czerwone są zatrzymywane w układzie siateczkowośródbłonkowym śledziony i następnie niszczone [3, 6, 8, 9]. Przy rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej dziedziczonej autosomalnie dominująco ważną rolę pełni wywiad i obraz kliniczny, który potwierdza rodzinne występowanie choroby i skłonność do zażółcenia powłok skórnych i powiększenia śledziony. U pacjenta w badaniach laboratoryjnych stwierdza się niedokrwistość, która może być skompensowana, wzrost średniego stężenia hemoglobiny w krwinkach czerwonych (MCHC) oraz rozpiętość rozkładu objętości erytrocytów (RDW). W rozmazie krwi obwodowej stwierdza się anizocytozę i poikilocytozę, mogą być obecne mikrosferocyty. Liczba retykulocytów bywa niekiedy znacznie zwiększona. W ciężkiej i umiarkowanej postaci sferocytozy wrodzonej oporność osmotyczna krwinek czerwonych jest zmniejszona, w łagodnej prawidłowa [3, 6]. W badaniu fizykalnym dziecka stwierdza się mniej lub bardziej nasilone zażółcenie białkówek ocznych i skóry, czasem powiększenie śledziony, zwłaszcza w przebiegu kryzy hemolitycznej, rzadziej obecność kamieni w pęcherzyku żółciowym [1, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11]. W przypadku nietypowego przebiegu choroby konieczne jest wykluczenie niedokrwistości autoimmunohemolitycznej, zie krwi obwodowej nie wykrywa się mikrosferocytów lub są one pojedyncze [3]. Choroby Minkowskiego-Chauffarda nie można również rozpoznać tylko na podstawie obecności sferocytów w rozmazie krwi obwodowej, bo mogą się one pojawiać także w innych chorobach [2, 4, 14]. Badanie oporności osmotycznej metodą Daciego lub za pomocą testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) nie jest badaniem swoistym dla sferocytozy wrodzonej, choć wykonywanym od wielu lat podczas przesiewowej diagnostyki tej choroby. Badanie nie pozwala na rozpoznanie HS bez konieczności wykonywania innych testów, ponieważ nie różnicuje innych niedokrwistości hemolitycznych jak niedokrwistości autoimmunohemolitycznej czy niedokrwistości spowodowanych konfliktem serologicznym w układzie AB0, w przebiegu których są obecne sferocyty we krwi obwodowej [2, 3, 8, 9, 10, 12, 15]. Testem służącym do przesiewowej diagnostyki sferocytozy wrodzonej, który pozwala dość szybko ocenić czy istnieje niedobór jednego z białek błonowych czy cytoszkieletu krwinek czerwonych, jest test EMA z użyciem cytometru przepływowego. Charakteryzuje się on wysoką czułością i swoistością w rozpoznawaniu HS. Wprowadzenie tego testu, w 2000 roku przez M.JKing i wsp. poprawiło znacznie możliwości diagnostyczne u osób z łagodną postacią choroby [16]. W przypadku dużej grupy chorych HS nie była wykrywana przy pomocy badań stosowanych wcześniej, w tym u noworodków i niemowląt [1, 10, 12, 15]. Zaletą testu EMA jest niewielka ilość materiału potrzebna do wykonania badania oraz możliwość jego przeprowadzenia po upływie 3-7 dni od momentu pobrania krwi, ponieważ upływ czasu nie ma znaczącego wpływu na wynik badania i jego interpretację [8, 17]. Jest to bardzo ważne u noworodków i niemowląt, które często mają nasiloną hemolizę i wymagają natychmiastowej transfuzji krwi, a przyczyna niedokrwistości nie jest znana. Wówczas wykorzystuje się do wykonania testu EMA próbkę krwi pozostałą po wykonaniu badania morfologii krwi [8, 13, 16, 18]. Bardzo rzadko wykonuje się analizę składu białkowego błony erytrocytów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamido- hemoglobinopatii czy defektów enzymatycznych w krwince czerwonej (np. niedobór aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, kinazy pirogronianowej) [2, 3, 6, 12]. Znacznie trudniejsze w zdiagnozowaniu są łagodne i umiarkowane postacie choroby, oraz dziedziczone autosomalnie recesywnie. Pacjenci zwykle mają prawidłowe stężenie hemoglobiny i bilirubiny. Liczba retikulocytów może być tylko nieznacznie zwiększona, a w rozmazie krwi obwodowej można nie znaleźć mikrosferocytów. Diagnostyka sferocytozy wrodzonej u noworodków i niemowląt również jest bardzo trudna, a to ze względu na fizjologicznie skrócony czas przeżycia erytrocytów zawierających hemoglobinę płodową, zwiększoną oporność osmotyczną krwinek, fizjologicznie zwiększoną liczbę retykulocytów i osłabioną erytropoezę [2, 8, 9, 13]. U około 10% chorych na sferocytozę wrodzoną w rozma- wym (SDS-PAGE), która pozwala na jakościową i ilościową ocenę niedoborów białek w błonie, oraz badania genetyczne identyfikujące mutacje w genach kodujących białka cytoszkieletu. Diagnostykę tę wdraża się tylko w przypadku podejrzenia sferocytozy wrodzonej o nietypowym obrazie lub ciężkim przebiegu klinicznym [1, 2, 4, 6, 15]. 26 Cel pracy Celem pracy było porównanie przydatności diagnostycznej testu EMA i testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej. Materiały i metody Materiał do wykonanych badań stanowiła krew pełna pobierana z żyły łokciowej do probówek zawierających 34% roz- twór EDTA-K2. Test EMA każdorazowo wykonywano we krwi pełnej pacjenta i w 5 próbkach krwi dawców z prawidłowymi wynikami parametrów morfologicznych (próbki referencyjne). Krew pochodziła od dzieci hospitalizowanych w Klinice Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej, u których podejrzewano sferocytozę wrodzoną. Grupę badaną stanowiło 77 dzieci: 29 dziewczynek i 48 chłopców w wieku od 1 miesiąca do 18 lat. Mediana wieku wyniosła 10. Test EMA. W celu wykonania testu EMA dla każdego pacjenta i 5 próbek referencyjnych przygotowywano po dwie probówki wirówkowe typu eppendorf, jedną dla właściwej próbki badanej, a drugą dla odpowiedniej kontroli. Do każdej z nich dodawano 5 µl krwi i uzupełniano do 1 ml roztworem PBS (zbuforowany roztwór soli fizjologicznej). Zawartość probówki dokładnie mieszano i wirowano przez 30 sekund z prędkością 8500g na wirówce Mini spin (Eppendorf). Następnie odrzucano supernatant. Do peletki przepłukanych krwinek czerwonych (próbka badana) dodawano po 25 µl barwnika EMA o stężeniu 0,5 mg/ml i inkubowano przez 1 godzinę w ciemni w temperaturze pokojowej cały czas mieszając probówki na mieszadle. Do próbek kontrolnych, zamiast barwnika fluorescencyjnego, dodawano po 25 µl roztworu PBS i traktowano dalej tak jak próbki badane. Po upływie czasu inkubacji wszystkie próbki wirowano przy maksymalnej prędkości (8500g przez 30 sekund) i odciągano supernatant. Pozostałą w probówce peletkę krwinek czerwonych trzykrotnie przepłukiwano 1ml 0,5% roztworu FBS (surowica płodowa cielęca) w PBS i zawieszano w 500 µl 0,5% roztworu FBS w PBS. Do analizy cytometrycznej pobierano 100 µl zawiesiny wyznakowanych erytrocytów – próbka badana oraz 100 µl zawiesiny nietraktowanych barwnikiem krwinek czerwonych – odpowiednia próbka kontrolna, i dodawano je do 1,4 ml 0,5% roztworu FBS w PBS. Analizę wyznakowanych krwinek czerwonych przeprowadzano natychmiast. Pomiaru intensywności fluorescencji barwnika dokonywano przy fali wzbudzenia 495 nm i fali emisji 520 nm (fluorescencja zielona) w cytometrze przepływowym Cytomics FC 500 (Beckman Coulter). Analizowano 100 000 komórek w każdej próbce. Oceniano redukcję intensywności fluorescencji u osób chorych w stosunku do średniego wyniku z 5 próbek referencyjnych. Wyniki przedstawiano jako procent obniżenia średniej fluorescencji barwnika. Zmniejszenie emisji świecenia barwnika w stosunku do średniego wyniku uzyskanego w próbkach referencyjnych wskazuje na obniżenie zawartości białka prążka 3 w błonie komórkowej lub wtórnie innych białek [18]. Obniżenie wartości średniej fluorescencji w teście EMA poniżej 80% w stosunku do próbek referencyjnych pozwala na rozpoznanie sferocytozy wrodzonej, przy wartościach powyżej 80% należy wykluczyć niedokrwistość dyserytropoetyczną typu II (CDAII) [8]. Dokładna procedura przeprowadzanego testu została opisana przez autorów wcześniej [19]. Test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50). Test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu wykonywano wg modyfikacji Zanelli i wsp. Zasada metody polega na określeniu czasu wyrażonego w sekundach, jaki jest potrzebny do powstania 50% hemolizy krwinek czerwonych zawieszonych w zbuforowanym kwaśnym hipotonicznym roztworze NaCl z glicerolem. W celu wykonania badania sporządzano hemolizat - dodając 20 µl krwi pełnej do 5 ml wody destylowanej, oraz zawiesinę krwinek czerwonych w PBS - przez dodanie 20 µl krwi pełnej do 5 ml roztworu PBS (zbuforowany 0,9% roztwór NaCl o pH 6,85±0,01) i dokładnie mieszano. Następnie w celu przygotowania próby „ślepej” pobierano 1 ml hemolizatu, a w przypadku próby badanej 1 ml zawiesiny krwinek czerwonych w PBS i przenoszono do kuwet spektrofotometrycznych o pojemności 4 ml. Do kuwety z próbą „ślepą” dodawano 2 ml odczynnika glicerolowego (23 ml glicerolu i 300 ml roztworu PBS uzupełnione wodą destylowaną do 1 litra), dokładnie mieszano i wstawiano do spektrofotometru Semco S91E (Emco), celem ustawienia absorbancji światła dla tej próby. Do kuwety z próbą badaną dodawano 2 ml odczynnika glicerolowego, szybko mieszano i wstawiano do aparatu. Natychmiast włączano stoper i mierzono absorbancję wyjściową przy długości fali 625 nm. Następnie określano czas w sekundach, po upływie którego absorbancja wyjściowa zmniejszyła się o połowę (AGLT50). Prawidłowy wynik testu AGLT50 wynosi powyżej 1800 sekund. U osób ze sferocytozą wrodzoną, oraz cierpiących na inne niedokrwistości hemolityczne, jest znacznie skrócony i wynosi 25 – 150 sekund. Ocena wybranych parametrów morfologii krwi obwodowej. Na podstawie wyników rutynowych badań morfologii krwi obwodowej wykonanych w badanej grupie dzieci dokonano analizy wybranych parametrów takich jak: liczba krwinek czerwonych (RBC), stężenie hemoglobiny (HGB), wartość hematokrytu (HCT), średnia objętość krwinki czerwonej (MCV), średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej (MCH), średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej (MCHC) i rozpiętość rozkładu objętości erytrocytów (RDW). Morfologię krwi obwodowej wykonywano we krwi pełnej pobieranej z żyły łokciowej do probówek zawierających 34% roztwór EDTA-K2 przy pomocy 5-parametrowego („5-diff”) analizatora hematologicznego HMX (Beckman Coulter). Analiza statystyczna. Wyznaczono czułość i swoistość diagnostyczną testu EMA i AGLT50 wg następujących wzorów: Czułość = PD / (PD + FU) x 100%, Swoistość = PU / (PU + FD) x 100%, gdzie: PD – wyniki prawdziwie dodatnie, FU – wyniki fałszywie ujemne, PU – wyniki prawdziwie ujemne, FD – wyniki fałszywie dodatnie. Analizę statystyczną wyników testu EMA i testu hemolizy 27 Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce sferocytozy wrodzonej krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) oraz wybranych parametrów morfologii krwi obwodowej wykonano testem Manna Whitney’a U. Poziom istotności ustalono dla p<0,05. Korelację między wynikami testu EMA a wynikami testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu liczono za pomocą nieparametrycznego testu Chi-kwadrat. W celu wyliczenia punktu odcięcia dla wyników pozytywnych w teście EMA wykreślono krzywą ROC. Wyniki Test EMA. Test EMA wykonano u 77 pacjentów z podejrzeniem choroby Minkowskiego-Chauffarda. W 13 przypadkach (16,9%) potwierdzono kliniczne rozpoznanie sferocytozy wrodzonej, ponieważ średnia wartość fluorescencji krwinek czerwonych w stosunku do referencyjnych kontroli wyniosła poniżej 80%. U pozostałych 64 pacjentów (83,1%) uzyskany wynik nie pozwalał na rozpoznanie HS, gdyż średnia fluorescencja erytrocytów mieściła się w granicach wartości referencyjnych. U jednego z pacjentów, u którego wcześniej rozpoznano sferocytozą wrodzoną, nie stwierdzono obniżenia średniej fluorescencji względem wartości referencyjnych, co może być związane z postawionym wcześniej błędnym rozpoznaniem i wymaga dalszej analizy. Wartość średniej fluorescencji po wykonaniu testu EMA dla chorych na sferocytozę wrodzoną wynosiła 72,43 ± 6,40 MCF (jednostki średniej fluorescencji, ang. mean channel of fluorescence), a w przypadku pacjentów bez HS 98,67 ± 9,18 MCF, p< 0,001. (Ryc. 1). Czułość wykonanego testu EMA określono na 92,86%, a swoistość na 100%. * AUC = 0,9875 Rycina 2 Krzywa ROC dla testu EMA. AUC – pole pod krzywą. czona powyżej. Powierzchnia pod krzywą (AUC – ang. area under curie) wynosi 0,9875 przy p<0,0001. Test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50). Badanie oporności osmotycznej erytrocytów za pomocą testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) wykonano u 28 pacjentów z podejrzeniem sfero- cytozy wrodzonej. U 12 pacjentów (42,9%) wartość oporności osmotycznej erytrocytów mieściła się w zakresie 25 – 150 sekund, jak w sferocytozie wrodzonej. Jednak tylko u 4 pacjentów rozpoznanie HS potwierdził test EMA. U pozostałych 8 pacjentów pomimo obniżonej wartości oporności osmotycznej, nie potwierdzono HS. U 16 pacjentów (57,1%) test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu pozwalał na wykluczenie choroby, ponieważ wartość oporności osmotycznej była prawidłowa. Średnia wartość oporności osmotycznej krwinek czerwonych u pacjentów chorych na sferocytozę wrodzoną wynosiła 54,00 ± 6,63 sekundy, a u pacjentów bez sferocytozy 1034,5 ± 856,8 sekundy, p= 0,0453 ( Ryc. 3.). Czułość testu AGLT50 określono na poziomie 100%, jednak jego swoistość była bardzo niska, gdyż wynosiła tylko 66,6%. * Rycina 1 Wartość średniej fluorescencji erytrocytów wyznakowanych barwnikiem EMA z uwzględnieniem odchylenia standardowego (SD) u pacjentów chorych na sferocytozę wrodzoną i osób zdrowych. Gwiazdka (*) oznacza,że porównywane grupy wyników różnią się istotnie statystycznie. Wyznaczono również punkt odcięcia dla wyników pozytywnych w teście EMA, co obrazuje krzywa ROC przedstawiona na Ryc. 2. Czułość i swoistość testu EMA dla wyznaczonej wartości punktu odcięcia - 80,98% jest taka sama jak wyli28 Rycina 3 Średnia wartość oporności osmotycznej krwinek czerwonych z uwzględnieniem odchylenia standardowego (SD) dla określonych grup pacjentów: chorych na sferocytozę wrodzoną i zdrowych. Gwiazdka (*) oznacza, że porównywane grupy wyników różnią się istotnie statystycznie. Nie zaobserwowano korelacji pomiędzy wynikami testu EMA i testu AGLT50 w grupie pacjentów chorych na sferocytozę wrodzoną i zdrowych, p>0,05. Ocena wybranych parametrów morfologii krwi obwodowej u pacjentów z podejrzeniem sferocytozy wrodzonej. Ocenę liczby krwinek czerwonych i wybranych parametrów morfologii krwi obwodowej wykonano u 34 dzieci z podejrzeniem HS (9 dziewczynek i 25 chłopców). U 6 pacjentów wyniki sugerowały sferocytozę wrodzoną a u pozostałych 28 pozwoliły na wykluczenie tej choroby. Średnia liczba krwinek czerwonych u osób chorych na sferocytozę wrodzoną wynosiła 3,3±0,7 x 10^6/1µl i była niższa niż u pacjentów bez HS 3,7±0,8 x 10^6/1µl. Stężenie hemoglobiny u większości przebadanych osób chorych na sferocytozę wrodzoną i bez HS (25 pacjentów) było obniżone poniżej 11 g/dl. Stężenie HGB w grupie osób chorych wynosiło 9,4±2,0 g/dl i było niższe niż u pacjentów bez HS – 10,5±1,7 g/dl. Wartość hematokrytu u wszystkich osób z HS była obniżona i wynosiła 27,0±5,4 %. Średnia wartość hematokrytu u pacjentów bez HS również była obniżona i wynosiła 31,2±5,4 %. Średnia objętość krwinki czerwonej (MCV) w grupie osób chorych na HS mieściła się w zakresie wartości referencyjnych i wynosiła 82,7±10,1 fl, podobnie jak dla osób bez HS – 85,8±8,7 fl. Średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej (MCH) u osób chorych na HS wyniosła 28,6±3,1 pg, a u pacjentów bez HS 28,9±3,0 pg. Średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej (MCHC) u osób chorych na sferocytozę wrodzoną (HS) wynosiło 34,6±1,2 g/dl i było wyższe niż u pacjentów bez HS – 33,7±1,3 g/dl. Rozpiętość rozkładu objętości erytrocytów (RDW) dla grupy pacjentów z HS wynosiła 21,6±8,5 %, a dla pacjentów bez HS 15,7±3,8 % . Tabela I. Średnia wartość RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC i RDW u dzieci chorych na sferocytozę wrodzoną i bez HS. Badany parametr Dzieci chore na sferocytozę wrodzoną Dzieci bez sferocytozy wrodzonej RBC ± SD x 10^6/1µl 3,3 ± 0,7 3,7 ± 0,8 HGB ± SD [g/dl] 9,4 ± 2,0 10,5 ± 1,7 HCT ± SD [%] 27,0 ± 5,4 31,2 ± 5,4 MCV ± SD [fl] 82,7 ± 10,1 85,8 ± 8,7 MCH ± SD [pg] 28,6 ± 3,1 28,9 ± 3,0 MCHC ± SD [g/dl] 34,6 ± 1,2 33,7 ± 1,3 RDW ± SD [%] 21,6 ± 8,5 15,7 ± 3,8 HCT – hematokryt, HGB –stężenie hemoglobiny, HS – sferocytoza wrodzona, MCH – średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej, MCHC – średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej, MCV – średnia objętość krwinki czerwonej, RBC – liczba krwinek czerwonych, RDW – rozpiętość rozkładu objętości erytrocytów. Wyniki powyżej analizowanych parametrów morfologii krwi obwodowej nie różnią się istotnie statystycznie. Opisane dane dotyczące liczby krwinek czerwonych i pozostałych parametrów ocenianych podczas analizy morfologii krwi obwodowej u dzieci chorych na sferocytozę wrodzoną i bez HS zostały zebrane w Tabeli I. Dyskusja. Sferocytoza wrodzona należy do najczęściej występujących wrodzonych niedokrwistości hemolitycznych. Objawy kliniczne w przebiegu HS mogą być mało charakterystyczne, zwłaszcza w łagodnej i umiarkowanej postaci choroby, co dodatkowo sprawia trudności w rozpoznaniu. Stosowane do niedawna badania diagnostyczne, opierające się na wyniku morfologii krwi obwodowej i ocenie rozmazu oraz badaniu oporności osmotycznej, nie zawsze dają zadawalające wyniki i mogą być nieraz źródłem pomyłek w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej [1, 2, 3, 9]. Natomiast wprowadzenie testu EMA, jako badania o większej swoistości w stosunku do sferocytozy wrodzonej, pozwoliło na poprawę wykrywalności tej choroby [8, 12, 20]. Celem niniejszej pracy było porównanie przydatności diagnostycznej testu EMA i testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) w rozpoznawaniu choroby Minkowskiego-Chauffarda, oraz ocena wybranych parametrów morfologii krwi obwodowej. Test EMA jest badaniem pozwalającym ocenić czy istnieje niedobór jednego lub kilku białek błony i cytoszkieletu krwinek czerwonych. Zasada testu jest oparta na łączeniu się barwnika fluorescencyjnego – 5-maleimidu eozyny (EMA) z lizyną (Lys-430) zawartą w pętli zewnątrzkomórkowej białka prążka 3. Zmniejszenie intensywności świecenia barwnika w stosunku do kontroli w 75-95% przypadków wskazuje na niedobór jednego lub kilku białek błonowych. W pozostałych przypadkach może być spowodowany niedoborem innych białek, np. z układu Kell lub Rh, które wpływają na wiązanie barwnika z białkiem prążka 3 [8, 12, 18]. Zaletą testu EMA jest niewielka ilość materiału jaka jest potrzebna do wykonania badania (10μl - próbka pozostała po wykonaniu morfologii krwi) oraz możliwość przechowania próbki przez kilka dni, bez istotnego wpływu na ostateczny wynik (od 3 do 7 dni od momentu pobrania). Pozwala to na zabezpieczenie materiału do badania w przypadku konieczności wykonania w trybie pilnym transfuzji krwi i wykonanie testu EMA w późniejszym terminie. Taka możliwość wykonania badania w istotny sposób pomaga w postawieniu prawidłowej diagnozy [17]. Wadą testu EMA może być konieczność posiadania cytometru przepływowego do jego wykonania, oraz trudności w interpretacji wyniku testu, jeśli przeprowadza się go we krwi pobranej od wcześniaków, w której występują duże krwinki płodowe lub od osób z infekcją, ponieważ wówczas następuje wzrost wiązania barwnika EMA [8]. Przeprowadzone badania wykazały, że test EMA charakteryzuje się bardzo wysoką czułością (92,86%) i swoistością 29 Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce sferocytozy wrodzonej (100%) i dlatego jest wiarygodną metodą diagnostyczną w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej. Potwierdza to także King M J i wsp. oraz inni badacze [1, 8, 12, 16, 20]. W swoich pracach podkreślają, że wprowadzenie testu EMA jako badania przesiewowego w kierunku sferocytozy wrodzonej znacznie poprawi możliwości diagnostyczne, zwłaszcza u pacjentów z łagodną postacią choroby oraz noworodków i niemowląt. W przedstawionym materiale u jednego z pacjentów ze zdiagnozowaną wcześniej chorobą Minkowskiego-Chauffarda nie uzyskano obniżenia średniej fluorescencji względem wartości referencyjnych (wynik fałszywie ujemny). Wynik taki może być spowodowany przez zły dobór grupy kontrolnej, niezachowanie odpowiedniego odstępu od ostatniej transfuzji, wysoką retykulocytozą i obecność zwiększonej liczby dużych krwinek czerwonych czy infekcją wymagającą stosowania antybiotyków. Również znaczny niedobór ankiryny może mieć wpływ na wynik testu EMA [8, 15, 18, 20]. Bolton-Maggs P H B i wsp. wskazują, że obniżenie średniej wartości fluorescencji (dodatni wynik testu EMA) można uzyskać w rzadko występujących zaburzeniach erytrocytów takich jak wrodzona niedokrwistość dyserytropoetyczna typu II (CDA II), owalocytoza czy kriohydrocytoza [1, 12], ale obniżenie wartości MFI jest zwykle mniejsze niż u pacjentów ze sferocytozą [12]. Potwierdzają to również inne prace [10, 16]. Swoistość testu EMA na poziomie 100% uzyskano, gdyż brak było w grupie badanej wyników fałszywie dodatnich. Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano, że powszechnie wykonywany test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) nie jest tak swoistym badaniem przesiewowym w kierunku sferocytozy wrodzonej jak test EMA, ponieważ nie wykrywa łagodnych postaci choroby, a na jego wartość mają również wpływ czynniki niezwiązane z defektem białek cytoszkieletu erytrocytów [12]. Czułość wykonanego testu AGLT50 określono na 100%, jego swoistość była bardzo niska i wynosiła zaledwie 66,6%. Uzyskaną 100% czułość testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu dla HS potwierdzają wyniki otrzymane przez Zanellę i wsp., chociaż Rutherford i wsp. po- skiego-Chauffarda, ponieważ około 10–20% osób, z umiarkowaną lub łagodną HS, ma prawidłową wartość oporności osmotycznej erytrocytów [1, 8, 10, 12]. W analizowanym materiale negatywny wynik testu AGLT50 uzyskano u jednego pacjenta ze sferocytozą wrodzoną. Prawidłową wartość oporności osmotycznej krwinek czerwonych u osób z HS (wynik fałszywie ujemny) można także uzyskać w przypadku niedoboru żelaza, w hiperbilirubinemii pozawątrobowej oraz w fazie zdrowienia po kryzie aplastycznej, gdy we krwi obwodowej wykrywa się duży odsetek retikulocytów [1, 12]. Stoya G. i wsp. wskazują na silną korelację pomiędzy testem EMA i testem hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej. Postulują, aby oba testy były używane do wykrywania HS, pomimo różnych ich czułości, którą dla testu EMA i testu AGLT50 określono odpowiednio na 98% i 73% [20]. Przeprowadzone przez nas badania nie potwierdziły tego, gdyż nie obserwowano korelacji pomiędzy testem EMA i testem AGLT50. Test AGLT50 nie pozwala na pewne zdiagnozowanie sferocytozy wrodzonej bez wykonywania dodatkowych badań diagnostycznych, ponieważ na jego podstawie nie można odróżnić HS od innych niedokrwistości hemolitycznych, w przebiegu których obecne są sferocyty we krwi obwodowej [1]. Dotychczas uważano, że dzięki jego wysokiej czułości oraz temu, że jest szybkim, prostym i tanim badaniem, jest użytecznym testem przesiewowym służącym do diagnostyki sferocytozy wrodzonej [5]. Z przeprowadzonej analizy morfologii krwi obwodowej wynika, że liczba krwinek czerwonych oraz parametry czerwonokrwinkowe u chorych na sferocytozę wrodzoną mogą być prawidłowe. Sytuacja taka ma miejsce w przypadku skompensowanej niedokrwistości. Uzyskane wyniki świadczą zatem o tym, że ocena morfologii krwi obwodowej podobnie jak analiza rozmazu ręcznego pełnią tylko rolę pomocniczą w rozpoznawaniu choroby Minkowskiego-Chauffarda. W sferocytozie wrodzonej o łagodnym przebiegu klinicznym nie zaobserwowano w morfologii krwi obwodowej istotnych odstępstw parametrów od zakresów wartości referencyjnych, dają, że czułość tego testu jest nieco niższa (92,3%) [5]. W wykonanych badaniach obniżoną wartość oporności osmotycznej odnotowano nie tylko u wszystkich chorych na sferocytozę wrodzoną, ale i u dzieci bez HS, u których nie można było wykluczyć innych chorób przebiegających z obecnością sferocytów we krwi obwodowej. Ponieważ obniżoną wartość wyników tego testu obserwuje się także u osób chorych na niedokrwistość autoimmunohemolityczną, ostre białaczki, przewlekłą białaczkę szpikową, mielofibrozę oraz u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek i u kobiet w ciąży, opierając się jedynie na jego wyniku nie można postawić ostatecznego rozpoznania [5]. W tym zakresie otrzymane wyniki potwierdzają doniesienia innych badaczy [11, 14]. Prawidłowa wartość testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu nie wyklucza choroby Minkow- co potwierdza badanie wykonane przez Bolton-Maggsa P H B i wsp. [1]. Badaną grupę stanowiły dzieci z medianą wieku = 10, dla której nie udało się wykazać charakterystycznych dla sferocytozy wrodzonej znaczących zmian wartości wskaźników czerwonokrwinkowych (wzrost wartości MCHC i RDW). Wyniki takie są zwykle stwierdzane w grupie dorosłych chorych z HS [1, 9]. Przeprowadzone badania upoważniają do wyciągnięcia wniosku, że najlepszym badaniem przesiewowym w kierunku sferocytozy wrodzonej jest test EMA. Zdecydowanym ograniczeniem w stosowaniu tej metody w rutynowej diagnostyce są niestety wysokie wymagania sprzętowe (cytometr przepływowy z laserem argonowym, umożliwiający odczyt fali o długości 520 nm). Uzyskane wyniki pozwalają również stwierdzić, że prawidłowe postawienie diagnozy powinno opierać się nie tylko na dodatnim wyniku testu EMA, 30 ale przede wszystkim na dobrze zebranym wywiadzie klinicznym, badaniu fizykalnym pacjenta oraz wynikach dodatkowych badań diagnostycznych obejmujących morfologię krwi obwodowej z rozmazem, oceną liczby retykulocytów i stężenia bilirubiny. Wnioski 1. Test EMA jest lepszym testem przesiewowym w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej niż test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50). 2. Wprowadzenie testu EMA do rutynowej diagnostyki sferocytozy wrodzonej znacznie poprawiło jej rozpoznawanie, szczególnie u pacjentów z łagodną postacią choroby oraz u noworodków i niemowląt. 3. Test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) nie jest swoisty dla sferocytozy wrodzonej i nie pozwala na zróżnicowanie jej od innych niedokrwistości przebiegających z obecnością sferocytów. 4. W morfologii krwi obwodowej u pacjentów ze sferocytozą wrodzonej można nie znaleźć nieprawidłowości poszczególnych parametrów czerwonokrwinkowych. 13. Adamowicz-Salach A, Zdebska E, Matysiak M, GołębiowskaStaroszczyk S. Postępy w diagnostyce wrodzonych niedokrwistości hemolitycznych u niemowląt i dzieci w Polsce. Fam Med Prim Care Rev 2007; 9: 589-591. 14. Kłopocka J, Jabłońska-Skwiecińska E. Wstępna ocena znaczenia diagnostycznego próby hemolizy w zakwaszonym glicerolu. Diagn Lab 1993; 29: 315-318. 15. Bogusławska DM, Heger E, Sikorski AF. Molekularny mechanizm dziedzicznej sferocytozy. Merkuriusz Leki 2006. XX: 112116. 16. King MJ, Behrens J, Rogers C, et al. Rapid flow cytometric test for the diagnosis of membrane cytoskeleton-associated hemolytic anemia. Br J Hematol 2000; 111: 924-933. 17. Szmydki-Baran A, Adamowicz-Salach A, Gołębiowska-Staroszczyk S i wsp. Ocena wpływu długości przechowywania próbki krwi na wynik testu EMA. Doniesienie wstępne. Pediatr Pol 2009; 84: 423-425. 18. King MJ, Smythe JS, Mushens R. Eosin-5-maleimide binding to band 3 and Rh relatedproteins forms the basis of a screening test for hereditary spherocytosis. Br J Hematol 2004; 124: 106-113. 19. Potapińska O, Kotuła I, Zalewska W i wsp. Test EMA w diagnostyce sferocytozy wrodzonej. Diagn Lab 2008; 44: 389-399. 20. Stoya G, Gruhn B, Vogelsang H, et al. Flow ����������������������� cytometry as a diagnostic tool for hereditary spherocytosis. Acta Haematol 2006; 116: 186-191. Piśmiennictwo 1. Bolton-Maggs PHB, Stevens RF, Dodd NJ, et al. Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis. Br J Haematol 2004; 126: 455-474. 2. Christensen RD, Henry E. Hereditary Spherocytosis in Neonates with Hyperbilirubinemia. Pediatrics 2010; 125: 120-125. 3. Mariani M, Barcellini W, Varcellati C, et al. ������������������ Clinical and hematologic features of 300 patients affected by hereditary spherocytosis grouped according to the type of the membrane protein defekt. Haematologica 2008; 93: 1310-1317. 4. Webb D. Disorders of the red cell membrane. ��������������� Current Paediatrics 2005; 15: 40-43. 5. Apel D, Mariańska B, Maj S. Wartość diagnostyczna testu lizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT) we wrodzonej niedokrwistości sferocytowej i wybranych zespołach hematologicznych. Acta Haematol Pol 1993; 44: 267-271. 6. Iolascon A, Avvisati RA. Genotype/phenotype correlation in hereditary spherocytosis. Haematologica 2008; 93: 1283-1288. 7. Adamowicz-Salach A, Matysiak M, Albrecht-Stanisławska K. Niedokrwistości hemolityczne związane z wrodzonym niedoborem białek błony komórkowej krwinek czerwonych – diagnostyka i leczenie. Klin Pediatr 2005; 13: 327-332. 8. Adamowicz-Salach A, Szmydki-Baran A, Gołębiowska-Staroszczyk S i wsp. Przydatność cytometrycznej analizy białek cytoszkieletu i błon erytrocytów (test EMA) w diagnozowaniu wrodzonych niedokrwistości hemolitycznych u dzieci. Pediatr Pol 2009; 84: 419-422. 9. Adamowicz-Salach A. Sferocytoza wrodzona. Onkologia i hematologia dziecięca. Chybicka A, Sawicz-Birkowska K (red.). Wydawnictwo Lekarskie PZWL Warszawa 2008: 884-889. 10. Adamowicz-Salach A, Zdebska E, Spychalska J i wsp. Postępy w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej u niemowląt i dzieci w Polsce. Pediatr Pol 2006; 81: 347-250. 11. Adamowicz-Salach A. Standardy rozpoznawania wrodzonych niedokrwistości hemolitycznych. Onkohematologia dziecięca – co nowego? Kowalczyk JR (red.), Cornetis Wrocław 2009: 5766. 12. Kar R, Mishra P, Pati P. Evaluation of eosin-5-maleimide flow cytometric test in diagnosis of hereditary spherocytosis. Int Jnl Lab Hem 2010; 32: 8-16. Zaakceptowano do publikacji 17.01.2012 Adres do korespondencji: mgr Wioleta Żarlak Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego 00-576 Warszawa, ul. Marszałkowska 24 tel/fax. (22) 6296517 wiola. [email protected] 31