Piotr Juszczyk, Marek Szołtysik, Agata Czajgucka, Barbara

Acta Sci. Pol., Biotechnologia 13 (2) 2014, 17-26
ISSN 1644–065X (print) ISSN 2083–8654 (on-line)
AKTYWNOŚĆ HYDROLITYCZNA DROŻDŻY IZOLOWANYCH
Z SERÓW ROKPOL1
Piotr Juszczyk, Marek Szołtysik, Agata Czajgucka, Barbara Żarowska,
Xymena Połomska, Maria Wojtatowicz, Józefa Chrzanowska
Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Streszczenie. Przedmiotem badań była ocena zdolności 113 szczepów drożdży wyizolowanych z polskich serów z przerostem pleśni do produkcji zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych enzymów proteolitycznych i lipolitycznych. Hodowle drożdży należących do 7 gatunków: Candida famata, C. sphaerica, C. intermedia, C. kefyr, Geotrichum penicillatum,
Yarrowia lipolytica i Saccharomyces kluyveri prowadzono metodą wstrząsaną w podłożu
zawierającym ekstrakt drożdżowy-kazeinę-glukozę (YCG). Oznaczano zewnątrzkomórkową aktywność endopeptydazową w pH 3,0 i 7,5, odpowiednio wobec kwasowo zdenaturowanej hemoglobiny i kazeiny jako substratów. Obok zewnątrzkomórkowej aktywności
proteolitycznej badano także aktywność wewnątrzkomórkową. Ocenie poddano również
aktywność karboksypeptydazową, di-, tripeptydazową oraz aminopeptydazową drożdży.
Aktywność zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych lipaz oznaczano metodą studzienkową.
Słowa kluczowe: drożdże, aktywność proteolityczna, aktywność lipolityczna, ser Rokpol
Wykazano duże zróżnicowanie w poziomie aktywności zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych enzymów lipolitycznych i proteolitycznych zależne nie tylko od gatunku, ale
także od szczepu drożdży, w obrębie gatunku. Wszystkie drożdże produkowały zewnątrz-komórkowe lipazy, a ich aktywność kształtowała się od 7 U·mg-1 (dla przedstawiciela
gatunku C. famata) do 90 U·mg-1 (dla reprezentanta gatunku Y. lipolytica). Wewnątrzkomórkową aktywność lipolityczną oznaczono u wszystkich badanych drożdży (z wyjątkiem dwóch szczepów z gatunku: C. famata i C. intermedia), a maksymalny poziom
78 U·mg-1 wykazywały szczepy reprezentujące gatunek Y. lipolytica i C. sphaerica.
Szczepy reprezentujące gatunek Y. lipolytica charakteryzowały się wysoką aktywnością
zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych enzymów proteolitycznych aktywnych wobec kazeiny (odpowiednio maksymalnie 47 i 93 U·mg-1) oraz najwyższą zewnątrzkomórkową
aktywnością proteaz degradujących hemoglobinę (417–457 U·mg-1). Jednocześnie wykazywały wysoką aktywność egzo-, di- i tripeptydazową.
© Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Adres do korespondencji – Corresponding author: Piotr Juszczyk, Katedra Biotechnologii
i Mikrobiologii Żywności, Wydział Nauk o Żywności, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu,
ul. J. Chełmońskiego 37/41, 51-630 Wrocław, e-mail: [email protected]
18
P. Juszczyk i in.
WSTĘP
Drożdże są ważnym składnikiem mikroflory niemal wszystkich typów serów [Alessandria i in. 2010, Gardini i in. 2006, Kołakowski i in. 2012, Mirzaei 2011, Roostita i Fleet
1996, Wojtatowicz i in. 2001]. Stanowią one tzw. mikroflorę niestartową, która wykazuje
duże zróżnicowanie tak pod względem liczebności jak i składu gatunkowego w zależności od jakości surowca użytego do produkcji sera, mleczarni, a także od miejsca pobrania
próbki (powierzchnia czy wnętrze sera) [Fleet i Mian 1987, Fleet 1990, Macedo i in.
1996, Rohm i in. 1992, Wojtatowicz i in. 2001]. Istotny wpływ na wielkość i różnorodność populacji drożdży w serach wywierają stosowane w procesie technologicznym
zabiegi i czynniki utrwalające [Viljoen 1998]. Występowanie drożdży w serach związane
jest również z ich wymaganiami żywieniowymi, aktywnością enzymów i zdolnością do
wzrostu w niskich temperaturach przy niskim pH i podwyższonym stężeniu soli [Kołakowski i in. 2013, Wojtatowicz i in. 2001, Zinjarde 2014].
Duża zawartość drożdży w serach nie jest obojętna dla przebiegu procesu ich dojrzewania [Jakobsen i Narvhus 1996, Rossi i in. 1997]. Rozwój drożdży może być zarówno
przyczyną wady serów, jak i pozytywnie oddziaływać na proces ich dojrzewania poprzez
udział w przemianach biochemicznych [Bockelmann 2010, Jakobsen i Narvhus 1996,
Price i in. 2014, Sørensen i in. 2011]. Ze względu na swoje specyficzne uzdolnienia fizjologiczne oraz biochemiczne, szczególnie zdolność do syntezy enzymów hydrolitycznych
(proteolitycznych i lipolitycznych), drożdże mogą wpływać pozytywnie na kształtowanie
cech sensorycznych gotowego produktu [Gori i in. 2012, Gardini i in. 2006, Kołakowski
i in. 2013].
Celem pracy była ocena aktywności enzymów proteolitycznych i lipolitycznych drożdży wyizolowanych z sera Rokpol oraz wskazanie gatunków, wśród których należy poszukiwać szczepów do drożdżowych szczepionek wspomagających pierwotne kultury
startowe w procesie dojrzewania serów.
MATERIAŁ I METODY
Drożdże
W pracy wykorzystano 113 szczepów drożdży należących do 7 gatunków, w tym 61
szczepów Candida famata (forma anamorficzna Debaryomyces hansenii), 20 szczepów
C. sphaerica (forma anamorficzna Kluyveromyces lactis), 14 szczepów Geotrichum penicillatum, 5 szczepów C. kefyr (forma anamorficzna Kluyveromyces marxianus), 5 szczepów Yarrowia lipolytica oraz 4 szczepy C. intermedia i 4 szczepy Saccharomyces kluyveri. Drożdże zostały wyizolowane z serów z przerostem pleśni Rokpol (Wojtatowicz
i in. 2001) i zdeponowane w kolekcji własnej Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii
Żywności UP we Wrocławiu. Izolaty przechowywano w +4°C na skosach agaru YM
(g·l-1): glukoza (POCH) (10,0); pepton bakteriologiczny (Difco) (5,0); ekstrakt drożdżowy (Difco) (3,0); ekstrakt maltozowy (Difco) (3,0), agar (15,0).
Hodowle drożdży i przygotowanie preparatów enzymatycznych
Hodowle drożdży prowadzono na wstrząsarce rotacyjnej przy 160 rpm w temp. 28ºC
przez 48 godz. w kolbach stożkowych o poj. 250 cm3 zawierających 50 cm3 podłoża YCG
Acta Sci. Pol.
Aktywność hydrolityczna drożdży...
19
(g·l-1): ekstrakt drożdżowy (1,7), kazeina (2,0) i glukoza (10,0). Po 48 godzinach hodowlę
wirowano przy 7000 g przez 15 min, w temp. 4°C. Supernatant stanowił preparat enzymów zewnątrzkomórkowych.
Osad komórek drożdży dwukrotnie przemywano 50 mM buforem fosforanowym
o pH 7.0 i zawieszano w 10 ml tego samego buforu (warunki wirowania jw.). Komórki
sonifikowano w temp. +4°C przez 16 min. w aparacie Ultrasonic Desintegrator VD-11
(Techpan P1), a następnie wirowano przy 15 000 g przez 20 min w temp. 4°C. Supernatant filtrowano i stosowano jako preparat enzymów wewnątrzkomórkowych.
Oznaczanie aktywności enzymatycznych
Aktywność lipolityczna. Zdolność drożdży do produkcji pozakomórkowych i wewnątrzkomórkowych enzymów lipolitycznych badano przy użyciu płytkowego testu dyfuzyjnego, stosując jako substrat 1% tributyrynę (1,2,3-tributyryloglicerol, Sigma) w podłożu
o pH 7,5. Do studzienek (Ø = 5 mm) nanoszono 0,1 cm3 zewnątrz- lub wewnątrzkomórkowego ekstraktu Płytki inkubowano w temp. 37°C. Po 72 godzinach dokonywano
pomiaru strefy przejaśnień wokół studzienek. Poziom aktywności lipolitycznej określano na podstawie krzywej standardowej sporządzonej dla lipazy z Candida cylindracea
(Sigma) o aktywności 5390 U·mg-1 [Sztajer i in. 1988].
Aktywność proteolityczną oznaczano w zewnątrzkomórkowych ekstraktach drożdżowych wobec kazeiny i hemoglobiny odpowiednio w pH, 7,5 i 3,0 zgodnie z metodyką
opisaną przez Chrzanowską i Kołaczkowską [1998]. Aktywność wewnątrzkomórkową
enzymów proteolitycznych określano wobec kazeiny w pH 7,5.
Aktywność karboksypeptydazową i di-, tripeptydazową oznaczano odpowiednio
wobec substratów: Z-Glu-Tyr (Sigma) i Ala-Pro, Ala-Gly-Gly (Sigma) wg El Soda
i Desmazeaud [1982]. Próby inkubowano w 0,1 M buforze Tris-HCl (pH 8,0) w temp.
37°C przez 60 minut.
Aktywność aminopeptydazową oznaczano wobec nitroanilidowych pochodnych aminokwasów takich jak: Ala-pNA, Pro-pNA i Leu-pNA (Sigma) wg El Soda i Desmazeaud
[1982]. Próby inkubowano w 0,2 M buforze Tris-HCl (pH 8,0) w temp. 37°C przez 60
minut.
Za jednostkę aktywności przyjęto taką ilość enzymu, która powoduje przyrost absorbancji ΔA = 0,01 przy długości fali λ = 280, 570 i 405 nm, odpowiednio dla aktywności
proteinaz, karboksy-, di-, tripeptydaz i aminopeptydaz. Aktywność proteinazowa i peptydazowa została wyrażona w jednostkach w przeliczeniu na mg białka.
Eksperymenty wykonano w dwóch powtórzeniach, a prezentowane dane są średnią
z uzyskanych wyników.
Oznaczenie zawartości białka
Białko oznaczano metodą wg Lowry’ego i in. [1951]. Zawartość białka odczytywano
z krzywej wzorcowej sporządzonej dla albuminy surowicy krwi wołowej (BSA, Sigma).
OMÓWIENIE WYNIKÓW
Za wykształcenie właściwego profilu smakowo-zapachowego serów odpowiedzialne
są enzymy hydrolityczne degradujące tłuszcz i białka występujące w masie serowej.
Źródłem tych enzymów, obok enzymów rodzimych mleka i preparatu koagulującego,
Biotechnologia 13 (2) 2014
20
P. Juszczyk i in.
są drobnoustroje obecne w serze. Wyróżnić tu należy mikroflorę startową w postaci bakterii kwasu mlekowego oraz startery wspomagające bakterie mlekowe, jak i mikroflorę
niestartową, którą często stanowią obecne w serach drożdże. Ocena aktywności lipolitycznej i proteolitycznej 113 izolatów drożdży z serów z przerostem pleśni reprezentujących 7 gatunków wskazała jednoznacznie, że zdolność do produkcji enzymów była cechą
nie tylko gatunkową, ale również zależała od szczepu drożdży.
Wszystkie badane drożdże przejawiały zdolność do produkcji zewnątrzkomórkowych
lipaz, a ich aktywność kształtowała się na poziomie 7–90 U·mg-1 (tab. 1). Dwa szczepy
reprezentujące gatunki C. famata i C. intermedia nie produkowały wewnątrzkomórkowych enzymów lipolitycznych, a dla pozostałych aktywność ta przyjmowała wartości
w zakresie 7–78 U·mg-1.
Najwyższą aktywność zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych enzymów lipolitycznych,
odpowiednio 90 U·mg-1 i 78 U·mg-1, oznaczono dla przedstawicieli gatunku Yarrowia lipolytica. Aktywności lipolityczne drożdży Y. lipolytica, izolowanych z serów, potwierdzili również w swoich badaniach Akpinar i Uçar [2013], Gardini i in. [2006], Yalcin
i Uçar [2009], Padilla i in. [2014] oraz Tempel i Jakobsen [1998, 2000]. Lipazy produkowane przez te drożdże wykazywały wysoką aktywność w stosunku do triacylogliceroli,
nie tylko syntetycznych, takich jak tributyryna czy estry kwasów oleinowego (Tween
80), ale także naturalnych, np. oliwa z oliwek, tluszcz mleka [Gardini i in. 2006, Tempel
i Jakobsen 1998, 2000, Yalcin i Uçar 2009]. Jednak Padilla i in. [2014] nie zaobserwowali
w swoich badaniach aktywności wobec estrów kwasu palmitynowego i tylko nieznaczną
wobec estrów kwasu stearynowego.
W badaniach własnych najniższą aktywność lipolityczną odnotowano u przedstawicieli gatunku Candida famata, a jej wartość nie przekraczała 21 U·mg-1 i 15 U·mg-1,
odpowiednio dla zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych enzymów (tab. 1). Różnica pomiędzy aktywnością zewnątrz- i wewnątrzkomórkową może wynikać z faktu, że sekrecja,
a tym samym aktywność pozakomórkowych lipaz ściśle związane są z warunkami hodowli (np. temperaturą inkubacji) [Corbaci i in. 2012]. Zdolność do produkcji lipaz przez
przedstawicieli tego gatunku zaobserwowali również Corbaci i in. [2012], Fadda i in.
[2010], Padilla i in. [2014], Tempel i Jakobsen [1998] oraz Yalcin i Uçar [2009]. Badania przeprowadzone przez Tempel i Jakobsen [2000] wskazały na niską aktywność lipaz
produkowanych przez drożdże C. famata. Natomiast Gardini i in. [2006] oraz Roostita
i Fleet [1996] wykazali w swych badaniach brak aktywności lipolitycznej tych drożdży,
niezależnie od substratu stosowanego do jej oznaczania.
W dyskutowanej pracy duże zróżnicowanie w poziomie biosyntezy pozakomórkowych enzymów proteolitycznych obserwowano pomiędzy gatunkami oraz szczepami reprezentującymi ten sam gatunek (tab. 2). Wszystkie drożdże należące do gatunku
Y. lipolytica (n = 5), jako jedyne, wykazywały aktywność zewnątrzkomórkowych proteaz
kwaśnych oraz zasadowych jak i wewnątrzkomórkowych enzymów kazeinolitycznych.
Aktywność protezowa preparatu tych drożdży, w pH 3,0, osiągała najwyższą wartość
w zakresie 417–457 U·mg-1, natomiast kazeinolityczne enzymy działające w pH = 7,5
przejawiały aktywność w przedziale 31–47 U·mg-1. Zdolność tych drożdży do degradacji
kazeiny potwierdzają także inni autorzy, np. Padilla i in. [2014], Roostita i Fleet [1996],
Tempel i Jakobsen [2000] czy Yalcin i Uçar [2009]. W badaniach realizowanych przez
De Wit i in. [2005] wykazano, że aktywność proteolityczna drożdży Y. lipolytica skierowana jest bardziej wobec frakcji β aniżeli αs1 kazeiny. Dla pozostałych gatunków drożdży
Acta Sci. Pol.
Aktywność hydrolityczna drożdży...
21
aktywność zewnątrzkomórkowych proteaz kwaśnych i zasadowych zawierała się w przedziale, odpowiednio 5–152 U·mg-1 i 6–77 U·mg-1.
Tabela 1. Aktywność lipolityczna drożdży wobec tributyryny jako substratu
Table 1. Activity of yeast lipases towards tributyrate as a substrate
Aktywność lipolityczna – Lipase activity
[U·mg-1]
Zewnątrzkomórkowa
Extracellular
Gatunki
Species
Częstotliwość
Occurence
frequency
Wewnątrzkomórkowa
Intracellular
Zakres – Range
[U·mg-1]
Częstotliwość
Occurence
frequency
Zakres – Range
[U·mg-1]
C. famata
61/61
7–21
60/61
7–15
C. sphaerica
20/20
24–66
20/20
15–78
G. penicillatum
14/14
10–56
14/14
16–47
C. kefyr
5/5
32–53
5/5
22–48
Y. lipolytica
5/5
46–90
5/5
53–78
C. intermedia
4/4
13–35
3/4
9–18
S. kluyveri
4/4
22–49
4/4
44–48
Tabela 2. Aktywność proteolityczna szczepów drożdży wobec kazeiny (pH 7,5) oraz hemoglobiny
(pH 3,0) jako substratów
Table 2. Activity of yeast strains towards casein (pH 7.5) and hemoglobin (pH 3.0) as substrates
Aktywność proteolityczna – Proteolytic activity
Zewnątrzkomórkowa
Extracellular
Gatunek
Species
pH 7,5
Wewnątrzkomórkowa
Intracellular
pH 7,5
pH 3,0
Częstotliwość
Occurence
frequency
Zakres
Range
[U·mg-1]
Częstotliwość
Occurence
frequency
Zakres
Range
[U·mg-1]
Częstotliwość
Occurence
frequency
Zakres
Range
[U·mg-1]
C. famata
25/61
6–77
17/61
5–9
45/61
5–35
C. sphaerica
10/20
9–18
12/20
7–152
10/20
7–45
G. penicillatum
5/14
6–13
2/14
15–16
9/14
6–46
C. kefyr
2/5
18–28
2/5
6–11
4/5
17–43
Y. lipolytica
5/5
31–47
5/5
417–457
5/5
13–93
C. intermedia
1/4
10
1/4
11
4/4
57–99
S. kluyveri
4/4
11–14
1/4
10
4/4
18–46
W licznych badaniach potwierdzono aktywność pozakomórkowych endopeptydaz
u drożdży C. famata [Bintsis i in. 2003, Yalcin i Uçar 2009, Padilla i in. 2014]. Podobne wyniki uzyskali Tempel i Jakobsen [2000], stwierdzając równocześnie, że drożdże
te są zdolne do syntezy pozakomórkowych peptydaz, ale tylko w temperaturze 25°C.
Biotechnologia 13 (2) 2014
22
P. Juszczyk i in.
Izolaty z serów należące do gatunków C. famata i C. intermedia badane przez Gardini
i in. [2006] oraz Tempel i Jakobsen [1998] nie wykazywały zewnątrzkomórkowej aktywności peptydazowej.
W badaniach własnych najwyższą aktywność wewnątrzkomórkowych proteaz
degradujących kazeinę oznaczono dla szczepu z gatunku C. intermedia (100 U·mg-1)
i Y. lipolytica (93 U·mg-1), a najmniejszą dla przedstawicieli gatunku C. famata i G. penicillatum, odpowiednio 5 i 6 U·mg-1 (tab. 2).
W procesie dojrzewania serów istotną rolę przy usuwaniu tzw. gorzkich peptydów
odgrywają uwalniane podczas autolizy drożdży wewnątrzkomórkowe enzymy, w tym
aminopeptydazy, di-, tripeptydazy i karboksypeptydazy [Rossi i in. 1997].
W naszych badaniach wewnątrzkomórkowe aminopeptydazy badanych drożdży
przejawiały zróżnicowaną aktywność w zależności od szczepu i zastosowanego substratu
(tab. 3). Drożdże reprezentujące gatunek G. penicillatum charakteryzowały się najwyższą aktywnością, na poziomie 309 U·mg-1 wobec substratu Ala-pNA. Wysoką aktywność
alanyloaminopeptydazową i leucyloaminopeptydazową stwierdzono u przedstawicieli
gatunku Y. lipolytica (odpowiednio, 186 i 325 U·mg-1) i C. sphaerica (odpowiednio, 199
i 131 U·mg-1). Najniższą aktywność aminopeptydazową badanych szczepów, nieprzekraczającą 48 U·mg-1, osiągały ich prolyloaminopeptydazy (tab. 3).
Tabela 3. Aktywność aminopeptydazowa szczepów drożdży wobec nitroanilidowych pochodnych
aminokwasów: Ala-pNA, Pro-pNA i Leu-pNA
Table 3. Aminopeptidase activity of yeast strains towards aminoacid-p-nitroanilides: Ala-pNA,
Pro-pNA and Leu-pNA
Aktywność aminopeptydazowa
Aminopeptidase activity
Gatunek
Species
Ala-pNA
Częstotliwość
Occurence
frequency
Pro-pNA
Leu-pNA
Zakres
Range
[U·mg-1]
Częstotliwość
Occurence
frequency
Zakres
Range
[U·mg-1]
Częstotliwość
Occurence
frequency
Zakres
Range
[U·mg-1]
C. famata
61/61
3–87
45/61
3–42
59/61
8–77
C. sphaerica
20/20
3–199
15/20
2–48
20/20
6–131
G. penicillatum
14/14
10–309
14/14
5–48
14/14
8–49
C. kefyr
5/5
6–43
3/5
6–13
2/5
13–17
Y. lipolytica
5/5
23–186
5/5
5–37
5/5
137–325
C. intermedia
4/4
28–40
2/4
5–6
4/4
27–68
S. kluyveri
4/4
19–27
1/4
6
4/4
<5
Z badań prowadzonych przez Bintsis i wsp. [2003] wynika, że drożdże Debaryomyces hansenii (forma teleomorficzna Candida famata) wytwarzają aminopeptydazy alanylowe oraz prolylowe. Nie posiadają natomiast aktywności leucyloaminopeptydazowej,
co pozostaje w sprzeczności z wynikami uzyskanymi w niniejszej pracy. Inni autorzy,
Karasu-Yalcin i in. [2012] oraz Tempel i Jakobsen [2000], dokonali oceny aktywności
leucyloaminopeptydazowej izolatów drożdży z serów na podstawie testu APIZYM (Biomerieux). Wykazali, że wszystkie badane szczepy drożdży z gatunku C. famata, C. lipolytica i C. kefyr były zdolne do syntezy aminopeptydazy leucynowej.
Acta Sci. Pol.
Aktywność hydrolityczna drożdży...
23
W dyskutowanej pracy aktywność karboksypeptydaz aktywnych wobec Z-Glu-Tyr
była szczepozależna i kształtowała się w szerokim zakresie od 8 U·mg-1 (dla reprezentanta
gatunku C. famata) do 278 U·mg-1 (dla przedstawiciela C. sphaerica) (tab. 4).
Tabela 4. Aktywność karboksypeptydazowa i di-, tripeptydazowa drożdży
Table 4. Carboxypeptidase, dipeptidase and tripeptidase activity of yeast strains
Gatunek
Species
[U·mg-1]
Aktywność peptydazowa
Peptidase activity
Dipeptydazowa
Dipeptidase
Ala-Pro
Częstotliwość
Zakres
Occurence
Range
frequency
[U·mg-1]
Tripeptydazowa
Tripeptidase
Ala-Gly-Gly
Częstotliwość
Zakres
Occurence
Range
frequency
[U·mg-1]
Częstotliwość
Occurence
frequency
Zakres
Range
[U·mg-1]
C. famata
58/61
8–100
58/61
5–42
61/61
12–178
C. sphaerica
17/20
11–278
18/20
3–76
20/20
17–159
G. penicillatum
11/14
11–143
14/14
8–58
14/14
56–264
C. kefyr
5/5
16–81
14/14
25–81
5/5
33–139
Y. lipolytica
5/5
78–104
5/5
90–190
5/5
73–111
C. intermedia
4/4
27–133
4/4
9–22
4/4
59–120
S. kluyveri
4/4
48–75
4/4
68–77
4/4
110–136
Zdolność drożdży Debaromyces hansenii izolowanych z sera feta do produkcji karboksypeptydaz zaobserwował również Bintsis i in. [2003], badając aktywność tych enzymów wobec N-CBZ-glicylo-tyrozyny, N-CBZ-glicylo-fenyloalaniny i N-benzoyloglicylo-argininy. Wspomniani autorzy oceniali także aktywność dipeptydazową tych
drożdży wobec 5 substratów: Leu-Gly, Lys-Leu, Lys-Phe, Pro-Leu oraz Ala-Phe i wykazali, że drożdże te wykazywały aktywność enzymatyczną tylko wobec dipeptydu ProLeu. Pozostaje to w sprzeczności z wynikami uzyskanymi w badaniach własnych (tab.
4), w których dowiedziono, że zdecydowana większość szczepów produkuje dipeptydazy o aktywności wobec Ala-Pro w zakresie od 3 U·mg-1 (dla przedstawiciela gatunku
C. sphaerica) do nawet 190 U·mg-1 (dla szczepu z gatunku Y. lipolytica). Jednocześnie
wszystkie badane drożdże wykazały bardzo zróżnicowany poziom aktywności tripeptydazowej, w przedziale od 12 U·mg-1 (dla szczepu C. famata) do 264 U·mg-1 (dla szczepu
Geotrichum penicillatum).
WNIOSKI
1. Wykazano duże zróżnicowanie w poziomie wszystkich analizowanych aktywności
hydrolitycznych, tak między gatunkami, jak i między szczepami w obrębie każdego gatunku drożdży.
2. Wszystkie badane drożdże przejawiały zdolność do produkcji zewnątrzkomórkowych enzymów lipolitycznych, a najwyższe aktywności tych enzymów stwierdzono
u przedstawicieli gatunku Y. lipolytica. Wewnątrzkomórkowe lipazy produkowane były
Biotechnologia 13 (2) 2014
24
P. Juszczyk i in.
przez niemal wszystkie badane drożdże, a ich maksymalną aktywnością charakteryzowały się szczepy reprezentujące gatunek Y. lipolytica i C. sphaerica.
3. Szczepy reprezentujące gatunek Y. lipoltica odznaczały się wysoką aktywnością
zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych enzymów proteolitycznych aktywnych wobec kazeiny (pH 7,5) oraz zewnątrzkomórkowych degradujących hemoglobinę (pH 3,0). Jednocześnie wykazywały wysoką aktywność egzo-, di- i tripeptydazową.
4. Biorąc pod uwagę ocenę właściwości hydrolitycznych (proteolitycznych i lipolitycznych) 113 izolatów drożdży z serów z przerostem pleśni reprezentujących 7 gatunków,
wskazano, że potencjalnymi kandydatami do drożdżowych szczepionek serowarskich,
wspierających pierwotne kultury startowe, powinni być reprezentanci gatunku Yarrowia
lipolytica oraz C. sphaerica ze względu na ich uzdolnienia proteolityczne i lipolityczne.
Interesujące wydają się być także drożdże C. famata o umiarkowanych aktywnościach
lipolitycznych, produkujące aktywne amino- i karboksypeptydazy.
PIŚMIENNICTWO
Akpinar O., Uçar F.B., 2013. Molecular characterization of Yarrowia lipolytica strains isolated
from different environments and lipase profiling. Turk. J. Biol., 37, 249–258.
Alessandria V., Dolci P., Rantsiou K., Pattono D., Dalmasso A., Civera T., Cocolin L., 2010. Microbiota of the Planalto de Bolona: an artisanal cheese produced in uncommon environmental
conditions in the Cape Verde Islands. World J. Microbiol. Biotechnol., 26, 2211–2221.
Bintsis T., Vafopoulou-Mastrojiannaki A., Litopoulou-Tzanetaki E., Robinson R.K., 2003. Protease, peptidase and esterase activities by lactobacilli and yeast isolates from Feta cheese brine.
J. Appl. Microbiol., 95 (1), 68–77.
Bockelmann W., 2010. Secondary cheese starter cultures [in:] Technology of Cheesemaking (eds.
Law B.A., Tamime A.Y.). Wiley–Blackwell Chichester.
Chrzanowska J., Kołaczkowska M., 1998. Production of extracellular proteolytic enzymes by
Beauveria bassian. Acta Mycologica, 33, 277–285.
Corbaci C., Uçar F.B., Yalcin H.T., 2012. Isolation and characterization of yeasts associated with
Turkish-style homemade dairy products and their potential as starter cultures. Afr. J. Microbiol.
Res., 6 (3), 534–542.
De Wit M., Osthoff G., Viljoen B.C., Hugo A., 2005. A comparative study of lipolysis and proteolysis in Cheddar cheese and Yeast-inoculated Cheddar cheese during ripening. Enzym. Microbiol.
Technol., 37, 606–616.
El Soda M., Desmazeaud M.J., 1982. Les peptide-hydrolases des lactobacilles du groupe Thermobacterium: I. Mise en evidence de ces activites chez Lactobacillus helveticus, L. acidophilus,
L. lactis et L. bulgaricus. Can. J. Microbiol., 28, 1181–1188.
Fadda M.E., Viale S., Deplano M., Pisano M.B., Cosentino S., 2010. Characterization of yeast
population and molecular fingerprinting of Candida zeylanoides isolated from goat’s milk collected in Sardinia. Int. J. Food Microbiol., 136 (3), 376–380.
Fleet G.H. and Mian M.A., 1987. The occurence and growth of yeasts in dairy products. Int. J. Food
Microbiol., 4, 145–155.
Fleet G., 1990. Yeast in Dairy Products – a Review. J. Appl. Bacteriol., 68, 199–211.
Gardini F., Tofalo R., Belletti N., Iucci L., Suzzi G., Torriani S., Guerzoni M.E., Lanciotti R., 2006.
Characterization of yeasts involved in the ripening of Pecorino Crotonese cheese. Food Microbiol., 23, 641–648.
Acta Sci. Pol.
Aktywność hydrolityczna drożdży...
25
Gori K., Sørensen L.M., Petersen M.A., Jespersen L., Arneborg N., 2012. Debaryomyces hansenii
strains differ in their production of flavor compounds in a cheese-surface model. Microbiol.
Open, 1, 161–168.
Jakobsen M., Narvhus J., 1996. Yeasts and their possible beneficial and negative effects on the quality of dairy products. Int. Dairy J., 6, 755–768.
Karasu-Yalcin S., Senses-Ergul S., Yesim Ozbas Z., 2012. Identification and enzymatic characterization of the yeasts isolated from Erzincan tulum cheese. Mljekarstvo, 62 (1), 53–61.
Kołakowski P., Kowalska M., Sędrowska-Ćwiek J., 2013. Mikroflora serów dojrzewających.
Innowacyjne Mleczarstwo, 1, 6–13.
Kołakowski P., Podolak R., Kowalska M., 2012. Lactic acid bacteria and yeast profile in Polish
ripened cheeses. Milchwissenschaft, 67, 285–288.
Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr, A.L., Randall R.J., 1951. Protein measurement with the Folinphenol reagent. J. Biol. Chem., 193, 265–275.
Macedo A.C., Luz Costa M., Malcata X., 1996. Changes in the Microflora of Serra cheese: evolution throughout ripening time, lactation period and axial location, Int. Dairy J., 6, 79–94.
Mirzaei H., 2011. Microbiological changes in Lighvan cheese throughout its manufacture and ripening. African J. Micro-biol. Res., 5, 1609–1614.
Padilla B., Manzanares P., Belloch C., 2014. Yeast species and genetic heterogeneity within
Debaryomyces hansenii along the ripening process of traditional ewes’ and goats’ cheeses.
Food Microbiol., 38, 160–166.
Price E.J., Linforth R.S.T., Dodd C.E.R., Phillips C.A., Hewson L., Hort J., Gkatzionis K., 2014.
Study of the influence of yeast inoculum concentration (Yarrowia lipolytica and Kluyveromyces
lactis) on blue cheese aroma development using microbiological models. Food Chem., 145,
464–472.
Rohm H., Eliskases-Lechner F., Bräuer M., 1992. Diversity of yeasts in selected dairy products.
J. Appl. Bacteriol., 72, 370–376.
Roostita R., Fleet G.H., 1996. The occurence and growth of yeasts in Camembert and Blue-veined
cheese. Int. J. Food Microbiol., 28, 393–404.
Rossi J., Gobbetti M., Buzzini P., Corsetti A., Smacchi E., De Angelis M., 1997. Yeast in dairy.
Annali di Microbiologia Ed Enzimologia, 47, 169–183.
Sørensen L.M., Gori K., Petersen M.A., Jespersen L., Arneborg N., 2011. Flavour compound
production by Yarrowia lipolytica, Saccharomyces cerevisiae and Debaryomyces hansenii in
a cheese-surface model. Int. Dairy J., 21, 970–978.
Sztajer H., Maliszewska I., Wieczorek J., 1988. Production of exogenous lipases by bacteria, fungi,
and actinomycetes. Enzym. Microbiol. Technol., 10, 492–497.
Tempel T., Jakobsen M., 1998. Yeast associated with Danablu. Int. Dairy J., 8, 25–31.
Tempel T., Jakobsen M., 2000. The technological characteristics of Debaryomyces hansenii and
Yarrowia lipolytica and their potential as starter cultures for production of Danablu. Int. Dairy
J., 10, 263–270.
Viljoen B.C., 1998. The ecological diversity of yeasts in dairy products, in: Jakobsen M., Narvhus J.
and Viljoen B. C. (editors), “Yeasts in the Dairy Industry: Positive and Negative Aspects”, Proceedings of IDF Symposiumm , 1996, Copenhagen, Denmark, 71–77.
Wojtatowicz M., Chrzanowska J., Juszczyk P., Skiba A., Gdula A., 2001. Identification and biochemical characteristics of yeast microflora in Rokpol cheese. Int. J. Food Microbiol., 69,
135–140.
Yalcin H.T., Uçar F.B., 2009. Isolation and characterization of cheese spoiler yeast isolated from
Turkish white cheeses. Ann. Microbiol., 59, 477–483.
Zinjarde S., 2014. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem., 152, 1–10.
Biotechnologia 13 (2) 2014
26
P. Juszczyk i in.
HYDROLYTIC ACTIVITY OF YEAST ISOLATED
FROM ROKPOL CHEESE
Abstract. The object of this study was to evaluate the ability of 113 yeast strains isolated
from Polish blue-veined cheese for the production of extracellular and intracellular proteolytic and lipolytic enzymes. Examined yeast strains belonged to 7 species: Candida famata, C. sphaerica, C. intermedia, C. kefyr, Geotrichum penicillatum, Yarrowia lipolytica
and Saccharomyces kluyveri. The cultivation was performed in the shake-flasks experiment
in medium YCG containing yeast extract – glucose – casein. Extracellular proteolytic activity was determined at pH 3.0 and pH 7.5 towards hemoglobin and casein, respectively. The
activities of carboxypeptidase, di- and tripeptidase and aminopeptidase were tested as well.
In addition, extracellular lipolytic activity was investigated by well-diffusion test.
It was demonstrated that differences in the extracellular and intracellular activity of lipolytic and proteolytic enzymes depended not only on the species, but also on yeast strain
within a species. All the yeast species under evaluation produced extracellular lipases
and their activity ranged from 7 U·mg-1 (for C. famata) to 90 U·mg-1 (for Y. lipolytica).
Intracellular lipolytic activity was observed for all yeast strains (with the exception of
two belonging to C. intermedia and C. famata species) however, the maximum level
of 78 U·mg-1 was obtained for Y. lipolytica and C. sphaerica strains. Y. lipolytica strains
showed comparatively high activities of extra- and intracellular proteases active towards
casein (47 and 93 U·mg-1, respectively) and the highest activities of extracellular proteases
hydrolyzing hemoglobin (417–457 U·mg-1). Moreover, Y. lipolytica yeast strains had a high
carboxy-, di and tripeptidase activities.
Key words: yeast, proteolytic activity, lipolytic activity, Rokpol cheese
Zaakceptowano do druku – Accepted for print: 30.06.2014
Do cytowania – For citation: Juszczyk P., Szołtysik M., Czajgucka A., Żarowska B.,
Połomska X., Wojtatowicz M., Chrzanowska J., 2014. Aktywność hydrolityczna drożdży
izolowanych z serów Rokpol. Acta Sci. Pol. Biotechnol., 13 (2), 17–26.
Acta Sci. Pol.