streszczenie(PL)

STRESZCZENIE
Wirus grypy typu A stanowi przyczynę corocznych epidemii. W wyniku powikłań
powstałych podczas przebiegu infekcji umiera rocznie ponad 250 – 500 tys. ludzi. Jak dotąd
nie stworzono skutecznej terapii przeciw temu patogenowi. Jeden z nurtów obecnych badań
proponuje jako cel leków antywirusowych segmentowany genom RNA wirusa. Uwagę
naukowców skupia głównie terapia antysensowa (oligonukleotydy, rybozymy, DNazymy,
RNAi) nakierowana na konserwatywne sekwencje vRNA oraz mRNA. Niewiele natomiast
wiadomo o strukturze vRNA wirusa grypy typu A oraz o jej potencjalnym znaczeniu w
regulacji cyklu replikacyjnego. Istnieją jednak przesłanki wskazujące iż struktura
drugorzędowa, zarówno mRNA jak i vRNA odgrywa istotną rolę w wielu procesach
kluczowych dla namnażania i poprawnego funkcjonowania wirusa.
Celem prezentowanych badań było określenie struktury drugorzędowej segmentu 7
vRNA wirusa grypy typu A (vRNA7) szczepu A/VietNam/1203/2004 (H5N1). Dodatkowo,
podjęto próbę wskazania, które z motywów strukturalnych proponowanej struktury
drugorzędowej vRNA7 są konserwatywne dla typu A wirusa grypy i mogą być zaangażowane
w interakcje międzycząsteczkowe. Zachowawcze i stabilne termodynamicznie motywy
strukturalne mogą stanowić element rozpoznawalny dla czynników białkowych lub innych
vRNA w procesie składania wirionów.
W toku przeprowadzonych badań zaproponowano model struktury drugorzędowej
pełnej długości (1027 nukleotydów) segmentu 7 vRNA wirusa grypy (SM-vRNA7). W
generowaniu modelu SM-vRNA7 posłużono się danymi eksperymentalnymi uzyskanymi w
wyniku mapowania chemicznego metodą SHAPE i z użyciem siarczanu dimetylu (DMS).
Dane wprowadzono do programu RNAstructure 5.3. W modelu struktury drugorzędowej
vRNA7 wyróżniono sześć domen z licznymi motywami strukturalnymi, w tym strukturę
panhandle opisywaną w literaturze.
Analiza bioinformatyczna 15946 niepowtarzalnych sekwencji vRNA7, pochodzących z
bazy NCBI, wskazała na wysoki stopień możliwości zachowania proponowanej struktury
drugorzędowej
vRNA7
w
pozostałych
szczepach.
Konserwatywność
strukturalna
przedstawionego modelu dla typu A wirusa grypy wynosi 91,4%.
W celu weryfikacji przedstawionego modelu struktury drugorzędowej vRNA7 oraz
wskazania
w
cząsteczce
miejsc
dostępnych
dla
potencjalnych
oligonukleotydów
wykorzystano metodę mapowania mikromacierzowego. Potwierdzonymi miejscami wiązania
sond (środek rejonu komplementarnego) były: 674, 692, 699, 700, 941, 953, 954. Dodatkowo,
metodą selektywnej hydrolizy rybonukleazą H wykazano bardzo wysoką dostępność miejsc w
domenie II vRNA7 (98, 99, 220, 313, 314), domenie III (345, 346, 347, 365, 414, 415, 417,
428, 433, 437), domenie IV (464, 580), domenie V (684, 685, 689, 702, 732, 791, 816, 819)
oraz domenie VI (926, 927, 943, 953, 955).
Postuluje się, że podczas pakowania ośmiu segmentów vRNA do wirionu istotne
mogą być oddziaływania pomiędzy segmentami vRNA. Dla określenia potencjalnych miejsc
oddziaływań vRNA7 z pozostałymi segmentami zastosowano program BLAST. Poszukiwano
fragmentów sekwencji vRNA7 komplementarnych do innych vRNA. Niektóre z rejonów
komplementarnych do różnych vRNA pokrywały się ze sobą. Obszar 186 – 223
charakteryzował się obecnością miejsc komplementarnych do czterech segmentów: vRNA3,
vRNA4, vRNA5, vRNA6. W rejonie 161 – 177 znaleziono sekwencje komplementarne do
trzech segmentów: vRNA3, vRNA5, vRNA8. Określono dwanaście rejonów, w których
lokalizowały się sekwencje komplementarne do dwóch segmentów a dwanaście innych
wykazywało komplementarność do pojedynczego segmentu.
Szeroki zakres danych uzyskanych w wyniku mapowania mikromacierzowego,
selektywnej hydrolizy RNazą H oraz mapowania chemicznego wskazywał na rejony dostępne
w cząsteczce vRNA7. Dodatkowo, informacje dotyczące prawdopodobieństwa występowania
określonych motywów strukturalnych wśród innych szczepów wirusa grypy oraz
umiejscowienie sekwencji komplementarnych do pozostałych segmentów badanego szczepu
pozwalały
wnioskować
o
ich
istotności
dla
potencjalnych
oddziaływań
międzycząsteczkowych. Na podstawie uzyskanej wiedzy zaprojektowano 24 oligonukleotydy
antysensowe. Podczas testów na liniach komórkowych MDCK, infekowanych szczepem
A/California/04/2009
(H1N1),
oceniano
skuteczność
antywirusową
proponowanych
oligonukleotydów. Cztery spośród badanych oligomerów (28A, 313A, para 313A/298A)
obniżały namnażanie wirusa do 50%, względem reakcji kontrolnej (100%). Sześć
oligonukleotydów powodowało spadek ilości wirionów w komórkach poniżej 20%, co
klasyfikowano jako istotny wpływ przeciwwirusowy. Para oligonukleotydów 346A oraz
360A (rejon wiązania: 341 – 369) wykazywała największą skuteczność, obniżając
namnażanie wirusa do 7%. Oligomer 428A (423 – 433) zmniejszał namnażanie wirionów do
19%. Oligonukleotydy 686A i 701A (678 – 706), działając w tandemie, ograniczały ilość
cząstek wirusowych w komórkach do 19%, podobnie oligomer 940A (936 – 946), który
jednocześnie wykazywał uniwersalność sekwencyjną odnośnie badanych szczepów podtypu
H5N1 oraz H1N1. Gapmer G686A (678 – 695) powodował zahamowanie namnażania wirusa
do 17%.
W modelu struktury drugorzędowej vRNA7 wyszczególniono kilka motywów
strukturalnych, w celu pełniejszego zbadania ich struktury i potwierdzenia dostępnych
rejonów vRNA7: A7 (domena III, rejon 320 - 458), F7 (część domeny V, rejon
668 – 756), R7 (domena VI, rejon 858 - 962). Motywy te zawierały miejsca komplementarne
do skutecznych oligonukleotydów antysensowych i mogły pełnić istotne funkcje w
namnażaniu wirusa. Modelowe fragmenty RNA badano przy zastosowaniu takich technik jak:
mapowanie chemiczne (DMS, SHAPE), mapowanie mikromacierzowe, ograniczona
hydroliza RNA indukowana jonami ołowiu. Otrzymane modele struktury drugorzędowej SM
– A7, SM –F7, SM – R7 potwierdziły możliwość tworzenia się zbliżonych lub identycznych
struktur w kontekście całej cząsteczki vRNA7. Dzięki wynikom uzyskanym dla A7 oraz F7
rozważono i zaproponowano alternatywne pofałdowanie domeny trzeciej i domeny piątej
struktury vRNA7.
Informacje dotyczące oddziaływań vRNA/vRNA, uzyskane dla segmentu siódmego
pochodzącego
ze
szczepu
A/VietNam/1203/2004
(H5N1),
pomogły
wskazać
miejsca istotne z punktu widzenia interakcji międzysegmentowych a więc być może
zasadnicze dla pakowania genomu tego szczepu. Stwierdzono, że vRNA7 może tworzyć
kompleks z pięcioma innymi vRNA: vRNA7/vRNA1, vRNA7/vRNA3, vRNA47vRNA4,
vRNA7/vRNA5,
vRNA7/vRNA8.
Procentowe
zaangażowanie
cząsteczek
RNA
w
formowanie kompleksu określono jako 23% dla segmentów 1 i 7, 18% dla segmentów 3 i 7,
25% dla segmentów 4 i 7, 34% dla segmentów 8 i 7 oraz 50% dla segmentów 5 i 7.
W celu poznania sposobu działania oligonukleotydów antysensowych, których
skuteczność wykazano podczas badań na liniach komórkowych, przeprowadzono
eksperyment in vitro określający wpływ poszczególnych oligomerów na tworzenie
kompleksów vRNA/vRNA. Stwierdzono, że oligonukleotyd 360AV hamował tworzenie
kompleksu
vRNA7/vRNA8
a
oligonukleotyd
346AV
ograniczał
oddziaływania
vRNA7/vRNA5. Jednocześnie para 360AV/346AV promowała powstawanie kompleksu
vRNA7/vRNA4. Oligonukleotyd 428AV wpływał hamująco na oddziaływania pomiędzy:
vRNA7 i vRNA3, vRNA7 i vRNA4 oraz vRNA7 i vRNA8. Oligonukleotyd 940AV
inhibował
powstawanie
kompleksów
vRNA1/vRNA7,
jednocześnie
stabilizując
oddziaływania vRNA4/vRNA7. Zauważono, że wiązanie oligomerów 360AV i 940AV
zaburzało strukturę RNA udostępniając nowe rejony i promując dalsze oddziaływania
vRNA/vRNA, co może być dowodem na wieloetapowy proces składania genomu. Para
oligonukleotydów 686A/701A nie wpływała znacząco na oddziaływania między segmentami
a zatem jej skuteczność przeciwwirusową wiąże się z inną funkcją regulatorową vRNA.