czytaj PDF - Endokrynologia Pediatryczna

Vol. 2/2003 Nr 4(5)
Endokrynologia Pediatryczna
Pediatric Endocrinology
Czynniki genetyczne i immunologiczne a ryzyko zachorowania rodzeństwa
dzieci chorych na cukrzycę typu 1
Genetic and immunological factors and risk of diabetes mellitus type 1 of
siblings of diabetic children
1
Joanna Brett-Chruściel, 1Elżbieta Piontek, 1Daniel Witkowski, 2Barbara Piątosa, 3Roman Janas
Oddział Diabetologii Kliniki Pediatrii Instytutu „Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka”
Pracownia Zgodności Tkankowej Instytutu „Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka”
3
Zakład Radioimmunologii Instytutu „Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka”
1
2
Adres do korespondencji: Joanna Brett-Chruściel, Klinika Pediatrii Instytutu „Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa,
Al. Dzieci Polskich 20
Słowa kluczowe: cukrzyca typu 1, predyspozycja genetyczna, ryzyko zachorowania, markery genetyczne, predysponujące allele, markery immunologiczne
Key words: diabetes type 1, genetic predisposition, risk of diabetes, predisposing allels, genetic markers, immunologic markers
STRESZCZENIE/
STRESZCZENIE/ABSTRACT
Wstęp. Kontynuowano badania prowadzone od 9 lat nad związkiem między występowaniem cukrzycy typu 1
a niektórymi haplotypami genów umiejscowionych w okolicy głównego układu zgodności tkankowej (MHC) i
obecnością w surowicy przeciwciał przeciwko fosfatazie tyrozyny IA-2 i przeciwciał przeciwko dekarboksylazie
kwasu glutaminowego – anty GAD
Materiał i metody. Grupę badaną stanowiło 105 dzieci i młodzieży w wieku 2–18 lat, rodzeństwa dzieci chorych
na cukrzycę. Badanie dotyczyło 65 rodzin wielodzietnych. Grupę kontrolną stanowiła grupa 39 dzieci i młodzieży
w wieku 2-32 lat, zdrowych, niespokrewnionych z pozostałymi grupami. Oznaczano allele HLA jako markery
genetyczne. Przeciwciała anty IA-2 i anty GAD oznaczano metodą radioimmunologiczną RIA. U tych badanych,
u których stwierdzono podwyższone poziomy markerów immunologicznych oraz predyspozycję genetyczną do
zachorowania na cukrzycę, wykonywano dożylny test obciążenia glukozą z oznaczeniem piku wczesnego sekrecji
insuliny i peptydu C metodą RIA. Analizie zgodności poddano 23 pary rodzeństwa, w których jedno dziecko było
chore na cukrzycę, a drugie zdrowe, za pomocą testu McNemara dla obserwacji powiązanych (matched case-control
data). Badano korelację pomiędzy występowaniem podwyższonego poziomu przeciwciał anty IA2 oraz anty GAD,
a układem HLA, występowaniem czynników ryzyka oraz płcią i wiekiem dzieci. Wszystkie wykonane testy były
dwustronne.
Wyniki. Istotnie częściej stwierdzono współwystępowanie w grupie chorych obu obciążających haplotypów:
DRB1*04 DQA1*03011 DQB1*0302/DRB1*03 DQA1*05011 DQB1*0201.
W grupie chorych w porównaniu z grupą rodzeństwa stwierdzono znamiennie częstsze występowanie predysponujących
do cukrzycy alleli DRB1*04, DQB1*0302, DQA1*03011 oraz haplotypu DRB1*04 DQA1*03011 DQB1*0302.
Vol. 2/2003, Nr 4(5)
17
Praca oryginalna
Endokrynol. Ped., 2/2003;4(5):17-28
W grupie rodzeństwa badaniem par (case-control) stwierdzono u 6 (17%) badanych układ HLA identyczny, u 9 (26%)
półidentyczny. Allele ryzyka stwierdzono u 20 (57%) badanych. Allele HLA DRB1 DQA1 i DQB1 wykazały u 5
dzieci predyspozycję do zachorowania na cukrzycę.
U 14 na 105 (13,3%) probandów wykryto podwyższone w różnym stopniu markery immunologiczne cukrzycy.
Przedstawiono 5 przypadków z grupy rodzeństwa zagrożonych rozwinięciem cukrzycy typu 1.
Wnioski. Dla rodzin dzieci chorych na tę chorobę określenie stopnia ryzyka zachorowania pozostałych dzieci
na cukrzycę jest badaniem istotnym, gdyż dostarcza znaczących wskazówek do postępowania i umożliwia, przy
obecności wskazań, leczenie prewencyjne. Z konieczności ekonomicznej badania muszą być ograniczone do
krewnych pierwszego stopnia, a prospektywne badania wykonywane dla doradztwa rodzinnego muszą być sterowane
wyborami uwzględniającymi współczynnik koszt/korzyść. Wyniki potwierdzają potrzebę prowadzenia dalszych
badań genetycznych i immunologicznych. Informacje powinny być wykorzystywane w poradnictwie rodzinnym.
Wydaje się wysoce wskazane zorganizowanie poradni zajmujących się obiektywizacją poradnictwa rodzinnego w
cukrzycy typu 1.
Introduction. Research, conducted for 9 years, was continued. It concerned the relation between diabetes type 1
occurrence and some alells of genes located in the vicinity of the main system of conformability of tissues (MHC) and
the presence in serum of autoantibodies against phosphatase tyrosine IA-2, as well as antibodies against glutamic acid
decarboxylase – anti GAD.
Material and methods. Our data comprised 105 children and teenagers (2-18 years), brothers and sisters of diabetic
children. Analysis concerned 65 multichildren families. Control group consisted of 39 healthy, unrelated children
and young people (2-32 years of age). HLA allels were determined as genetic markers. Antibodies anti IA-2 and
anti GAD (RIA Assay Kit method) were determined. In probands with higher levels of immunological markers and
genetic predisposition to diabetes, intravenous glucose load test was performed. Pick of early insulin and peptide C
secretion was determined (RIA method). 23 pairs of siblings (one child diabetic, the other one healthy) were subjected
to concordance analysis applying MacNemar’s test for matched case-control data. Correlation of increased levels of
anti IA-2 and anti GAD antibodies and HLA haplotype, risk factors, gender and age of probands were evaluated. All
tests were two-sided.
Results. Concurrence in diabetic children group of both encumbering haplotypes: DRB1*04 DQA1*03011
DQB1*0302/DRB1*03 DQA1*05011 DQB1*0201 was statistically significant.
In the diabetic group, in comparison with their siblings more frequent occurrence of diabetes predisposing allels
DRB1*04, DQB1*0302, DQA1*03011 and haplotype DRB1*04 DQA1*03011 DQB1*0302 was statistically
confirmed. In brothers/sisters group case control study has shown in 6 (17%) probands HLA system identical, and in
9 (26%) cases haploidentical, with the sick child. Risk allels were found in 20 (57%) probands. Allels HLA DRB1
DQA1 and DQB1 have indicated in 5 children predisposition to diabetes.
In 14/105 (13.3%) probands increase of various degrees intensity of immunological diabetes markers was found.
Five cases of siblings of diabetic children were presented.
Conclusions. Qualification of the degree of diabetes risk of other children of the diabetic child family is important
for this family, providing significant indications for future behaviour(diagnosis) and enabling preventive treatment.
Economic reasons limit the assays to relatives of the first degree and prospective diagnostic investigations must take
account of the cost/outcome factor. Our results confirm the need of further genetic and immunological investigations.
Informations achieved should be applied in family consulting. Organizing of outpatients stations dealing with diabetic
family consulting seems to be highly recommended.
Wstęp
Cukrzyca typu 1 jest stanem przewlekłej hiperglikemii spowodowanej postępującą niewydolnością komórek β ?trzustki, występującym pod wpływem czynników środowiskowych u osobników genetycznie predysponowanych. Cukrzyca typu 1
ujawnia się najczęściej u dzieci i młodzieży i stanowi poważny problem społeczny.
Według raportu WHO liczba chorych ogółem na
cukrzycę na świecie wynosi 135 milionów, w tym ok.
10% stanowi cukrzyca typu 1. Szacuje się, że liczba
ta wzrośnie do 300 milionów ludzi w 2025 roku [1].
18
Częstość występowania cukrzycy typu 1 jest
zmienna w różnych strefach geograficznych. Tłumaczone jest to przewagą genów wrażliwości na
cukrzycę, dietą i innymi czynnikami środowiskowymi [2].
Stwierdzenie, że zniszczenie komórek? β ?trzustki jest zakończeniem długotrwałego procesu autoimmunologicznego, rozwijającego się na sprzyjającym podłożu genetycznym, stanowiło istotny krok
ku poznaniu etiologii cukrzycy typu 1 [3].
Cukrzyca jest procesem złożonym, poligenetycznym i wieloczynnikowym, w którym uczestni-
Brett-Chruściel J. i inni – Czynniki genetyczne i immunologiczne...
czą poza genem lub genami związanymi z układem
zgodności tkankowej (HLA) geny usytuowane na
innych chromosomach, działające wspólnie ze sobą
lub z czynnikami środowiskowymi [10].
Choroba rozwija się najczęściej u osobników
predysponowanych genetycznie, nierzadko jest
spowodowana działaniem pewnych czynników egzogennych (np. zakażenie wirusowe, czynniki toksyczne, pokarmowe).
Dotychczasowe badania wykazały związek pomiędzy występowaniem cukrzycy typu 1, a niektórymi haplotypami genów umiejscowionych w okolicy głównego układu zgodności tkankowej (MHC),
w szczególności w obrębie regionu HLA usytuowanego na ramieniu krótszym chromosomu 6. W obrębie tego regionu wyróżnia się 3 miejsca (loci), określane literami A, B, C, oraz odcinek D. W każdym
locus znajduje się u danego osobnika jeden z wielu alleli kodujących syntezę poszczególnych antygenów [4].
Niektóre allele HLA są markerami immunogenetycznymi o uznanym związku ze skłonnością do cukrzycy [5, 6]. Mają one istotne znaczenie zarówno
dla badań podstawowych mechanizmów cukrzycy,
jak i dla identyfikacji osobników, którzy ze względu
na posiadanie tych markerów są zagrożeni w większym stopniu ryzykiem ujawnienia choroby. Pod
tym względem rodziny dzieci chorych na cukrzycę typu I stanowią populację zwiększonego ryzyka,
ponieważ są nosicielami ryzyka ok. 5% wystąpienia
choroby [10].
Allele HLA DRB1*03, DRB1*04, DQB1*0302,
DQB1*0201, DQA1*03011 i DQA1*05011 uznawane są za markery skłonności usposabiające do
wystąpienia cukrzycy typu 1. Allele HLA-DRB1*03
i/lub HLA-DRB1*04 występują u 90-95% chorych
na cukrzycę typu 1 i u około 50-60% populacji ogólnej w rasie kaukaskiej.
Ryzyko względne wystąpienia choroby jest podwyższone przy jednoczesnym współwystępowaniu
haplotypu DRB1*03/DRB1*04. Taką kombinację
alleli ma 30-35% chorych na cukrzycę typu 1 i zaledwie 2% populacji ogólnej. Szczególnie wysokie
ryzyko względne cechuje osobników o haplotypach
DRB1*04 DQB1*0302 DQA1*03011 /DRB1*03
DQB1*0201 DQA1*0501 [7, 8].
Haplotypy DRB1*04 DQA1*0301 DQB1*0302
i DRB1*03 DQA1*0501 DQB1*0201 uznawane są za predysponujące do zachorowania na cukrzycę typu 1, podczas gdy haplotypy DRB1*15
DQA1*0102 DQB1*0602 mają znaczenie ochronne [9].
Uważa się, że zwiększone ryzyko zachorowania dotyczy rodzeństwa mającego 2 lub 1 haplotyp
HLA wspólny z dzieckiem chorym. Ustalono, że u
15-60% rodzeństwa identycznego oraz u 6-35% rodzeństwa „półidentycznego” pod względem HLA z
dzieckiem chorym rozwija się choroba [10]. Ryzyko
to jest również większe u najmłodszych dzieci spośród rodzeństwa oraz u tych, które są urodzone kolejno po dziecku chorym [11].
Stwierdzenie haplotypu identycznego z haplotypem dziecka chorego podwyższa ryzyko zachorowania z 5% do 16-20%, półidentycznego do 9%,
a stwierdzenie całkowicie różnych haplotypów obniża ryzyko do populacyjnego (< 1%). Najbardziej
zagrożone są bliźnięta jednojajowe – ryzyko zachorowania wynosi 40-50%, a gdy posiadają allele
DRB1*03/DRB1*04 – 70%.
U chorych na cukrzycę posiadających haplotyp DQA1*0301 DQB1*0302 częściej stwierdza
się obecność autoprzeciwciał insulinowych (IAA),
podczas gdy obecność przeciwciał przeciwko dekarboksylazie kwasu glutaminowego (anty GAD)
wykazuje związek z haplotypem DQA1*0501
DQB1*0201 [12].
Geny DR i DQ mogą wpływać na stopień odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom
β ?poprzez nadmierną odpowiedź immunologiczną,
która może uruchomić uszkodzenie komórki β ?lub
indukować skłonność do cukrzycy poprzez prezentację autoantygenów komórki? β ?w sposób niesprzyjający prawidłowej tolerancji immunologicznej.
W okresie przed klinicznym ujawnieniem cukrzycy można wykryć w surowicy obecność przeciwciał skierowanych przeciwko komórkom β wysp
trzustki. Do markerów immunologicznych należą: przeciwciała przeciwwyspowe ICA, autoprzeciwciała insulinowe IAA, przeciwciała przeciwko
dekarboksylazie kwasu glutaminowego anty GAD,
przeciwciała przeciwko fosfatazie tyrozyny anty
IA-2. Występują one na wiele miesięcy przed klinicznym ujawnieniem cukrzycy, są wyrazem humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom B wysp Langerhansa trzustki i uznawane
są za markery destrukcji komórek β trzustki [13].
W okresie poprzedzającym wystąpienie cukrzycy typu 1 pojawiają się swoiste zaburzenia metaboliczne. Pierwszym objawem dysfunkcji komórek?
β ?jest obniżone wydzielanie insuliny w odpowiedzi na podawaną dożylnie glukozę. Według badaczy
z Joslin Clinic Center najczulszym testem umożliwiającym ocenę czynności wewnątrzwydzielniczej
trzustki jest dożylny test obciążenia glukozą. Do19
Praca oryginalna
żylne podanie glukozy powoduje dwufazową odpowiedź insulinową, z której pierwsza tzw. pik wczesny jest uważana za czuły marker zaburzeń insulinosekrecji.
Obecnie cukrzyca typu 1 jest rozpoznawana dopiero w bardzo zaawansowanym stadium zniszczenia komórek β, ze śladowym wydzielaniem insuliny i peptydu C. Duże nadzieje wiąże się z możliwością rozpoznawania cukrzycy w fazie przedklinicznej, w której dopiero zaczyna się proces destrukcji
i komórki? β ?trzustki są jeszcze w niedużym stopniu zniszczone. Wielu badaczy zaobserwowało, że
obecność przeciwciał ICA, anty GAD i anty IA-2
jest czasowo związana z postępującym pogorszeniem się funkcji komórek β [13].
W wieloośrodkowym programie badawczym
„Baby-Diab” stwierdzono, że u potomstwa matek i
ojców chorych na cukrzycę typu 1 już od okresu niemowlęcego występowały przeciwciała ICA, GAD i
IAA. Dzieci, u których stwierdzano współwystępowanie różnych przeciwciał, w ciągu kilkunastu miesięcy zachorowały na cukrzycę typu 1 [14].
Materiał i metody
Grupę badaną stanowiło 105 dzieci i młodzieży
w wieku 2-18 lat (46 dziewcząt – 44% i 59 chłopców – 56%), będących rodzeństwem dzieci chorych
na cukrzycę, pozostających pod opieką Poradni Diabetologicznej IP CZD. Badanie dotyczyło 65 rodzin
wielodzietnych, w których co najmniej jedno dziecko było leczone z powodu cukrzycy.
W grupie rodzeństwa oznaczano allele HLA jako
markery genetyczne oraz badano przeciwciała anty
IA-2 i anty GAD jako markery immunologiczne.
W grupie chorych na cukrzycę oznaczano jednorazowo allele HLA. Typowanie alleli genów HLA:
DRB1, DQA1 i DQB1 wykonano metodą PCR-SSP
przy użyciu zestawów firmy Dynal.
Przeciwciała anty IA-2 i anty GAD oznaczano
metodą radioimmunologiczną RIA przy użyciu zestawu firmy CIS bio International. U tych badanych, u których stwierdzono podwyższone poziomy markerów immunologicznych oraz predyspozycję genetyczną do zachorowania na cukrzycę stwierdzaną badaniem haplotypów HLA, wykonywano dożylny test obciążenia glukozą z oznaczeniem
piku wczesnego sekrecji insuliny i peptydu C metodą RIA. Pik wczesny sekrecji insuliny i peptydu C
obliczano jako wartość sumy insulinemii i C-peptydemii w 1 i 3 minucie w trakcie dożylnego testu obciążenia glukozą.
20
Endokrynol. Ped., 2/2003;4(5):17-28
Grupę kontrolną stanowiła grupa 39 dzieci i młodzieży w wieku 2-32 lat, zdrowych, niespokrewnionych z pozostałymi grupami.
Metody statystyczne
Badano częstość występowania poszczególnych
alleli w grupie dzieci chorych i w grupie rodzeństwa. Ze względu na pokrewieństwo (tzw. obserwacje zależne) ocena zgodności występowania danych alleli w obu grupach jest możliwa jedynie dla
par dzieci chore–zdrowe (badanie typu case-control) [15]. Analizie zgodności poddano 23 pary rodzeństwa, w których jedno dziecko było chore na
cukrzycę, a drugie było zdrowe. Zgodność występowania wybranych alleli oraz ich kombinacji w grupie dzieci chorych i zdrowych oceniono za pomocą
testu McNemara [15] dla obserwacji powiązanych
(matched case-control data). W rodzinach wielodzietnych parę stanowiło dziecko wybrane losowo.
Dla zgodności pojedynczych alleli zastosowano poprawkę Bonferroniego dla wielokrotnych porównań
i przyjęto poziom istotności α = 0,01. [15].
Za pomocą dwustronnego testu χ2 lub odpowiednika, dokładnego testu Fishera, porównano częstość
występowania poszczególnych alleli w grupie dzieci chorych i ich rodzeństwa z danymi dostępnymi w
piśmiennictwie [7]. Ze względu na dużą liczbę wykonanych testów (21 porównań chore vs kontrola i
21 porównań rodzeństwo vs kontrola) jako poziom
istotności dla tych porównań przyjęto α = 0,001 (poprawka Bonferroniego).
W grupie rodzeństwa badano poziom przeciwciał anty IA2 i anty GAD. Zdefiniowano poziom
jako prawidłowy, gdy wartości wszystkich pomiarów były ≤ 1, jako podwyższony, jeżeli wartość
przynajmniej jednego z pomiarów była większa
niż 1. Badano korelację pomiędzy występowaniem
podwyższonego poziomu przeciwciał anty IA2 oraz
anty GAD a układem HLA (identyczny, półidentyczny), występowaniem czynników ryzyka oraz
płcią i wiekiem dzieci.
Wszystkie wykonane testy były dwustronne.
Jako ogólny poziom istotności, o ile nie podano inaczej, przyjęto α = 0,05. Obliczenia wykonano z wykorzystaniem programu STATA [15].
Wyniki
Haplotypy HLA analizowano u 27 dzieci chorych
na cukrzycę typu 1 i u 44 dzieci z grupy rodzeństwa.
Częstość występowania poszczególnych alleli HLA
w grupie chorych i rodzeństwa przedstawia tab. 1.
Brett-Chruściel J. i inni – Czynniki genetyczne i immunologiczne...
Tab. 1. Częstość występowania poszczególnych alleli
Table 1. Frequency of occurrence of particular allels
Dzieci zdrowe
Healthy children
N = 44
Dzieci chore
Sick chidren
N = 27
Kontrola
Control
N = 206
Rodzeństwo zdrowe
vs kontrola
Siblings vs control
Dzieci chore
vs kontrola
Sick vs control
DRB1*01
10 (23%)
6 (22%)
35 (17%)
p = 0,81
p = 0,50
DRB1*02
0
0
-
-
-
DRB1*03
20 (45%)
17 (63%)
22 (11%)
p < 0,0001
p < 0,0001
DRB1*04
17 (39%)
22 (81%)
29 (14%)
p = 0,0001
p < 0,0001
DRB1*05
0
0
-
-
-
DRB1*06
0
0
-
-
-
DRB1*07
7 (16%)
2 (7%)
29 (14%)
p = 0,75
p = 0,55*
DRB1*08
2 (5%)
0
4 (2%)
p = 0,29*
p = 1,0*
DRB1*09
0
0
-
-
-
DRB1*10
0
0
-
-
-
DRB1*11
14 (32%)
2 (7%)
22 (11%)
p = 0,0003
p = 1,0*
DRB1*12
2 (5%)
2 (7%)
3 (1%)
p = 0,21*
p = 0,10*
DRB1*13
7 (16%)
0
19 (9%)
p = 0,19
p = 0,14*
DRB1*14
2 (5%)
0
7 (3%)
p = 0,66
*
p = 1,0*
DRB1*15
1 (2%)
0
30 (15%)
p = 0,02
*
p = 0,03*
DRB1*16
4 (9%)
0
6 (3%)
p = 0,06
*
p = 1,0*
Allele
Allels
DQB1*02
2 (5%)
1 (4%)
-
-
-
DQB1*0201
18 (41%)
15 (56%)
46 (22%)
p = 0,01
p = 0,0002
DQB1*0202
5 (11%)
4 (15%)
-
-
-
DQB1*0203
1 (2%)
0
-
-
-
DQB1*03
1 (2%)
1 (4%)
-
-
-
DQB1*0301
17 (39%)
6 (22%)
41 (20%)
p = 0,008
p = 0,78
DQB1*0302
10 (23%)
18 (67%)
18 (9%)
p = 0,008
p < 0,0001
DQB1*0303
3 (7%)
0
6 (3%)
p = 0,20*
p = 1,0*
DQB1*0304
1 (2%)
0
-
-
-
DQB1*0305
3 (7%)
0
-
-
-
DQB1*0311
1 (2%)
1 (4%)
-
-
-
DQB1*0402
1 (2%)
0
2 (1%)
p = 0,44*
p = 1,0*
DQB1*05
6 (14%)
3 (11%)
DQB1*0501
5 (11%)
3 (11%)
35 (17%)
p = 0,36
p = 0,58*
DQB1*0502
2 (5%)
0
6 (3%)
p = 0,63*
p = 1,0*
DQB1*0503
1 (2%)
0
-
-
-
DQB1*06
5 (11%)
1 (4%)
-
-
-
DQB1*0601
1 (2%)
0
2 (1%)
p = 0,44*
p = 1,0*
DQB1*0602
1 (2%)
0
28 (14%)
p = 0,04*
p = 0,053*
DQB1*0604
1 (2%)
0
5 (2%)
p = 1,0
p = 1,0*
*
DQB1*0609
1 (2%)
0
-
-
-
DQA1*0101
10 (23%)
7 (26%)
-
-
-
DQA1*0102
6 (14%)
1 (4%)
-
-
-
DQA1*0103
5 (11%)
0
-
-
-
DQA1*0104
2 (5%)
0
-
-
-
DQA1*0201
9 (20%)
1 (4%)
-
-
-
DQA1*03011
13 (30%)
19 (70%)
-
-
-
DQA1*0302
1 (2%)
0
-
-
-
DQA1*0303
0
4 (15%)
-
-
-
DQA1*0304
1 (2%)
0
-
-
-
DQA1*0401
1 (2%)
0
-
-
-
0
1 (4%)
-
-
-
DQA1*0501
19 (43%)
15 (56%)
-
-
-
DQA1*0504
1 (2%)
1 (4%)
-
-
-
DQA1*0505
14 (32%)
2 (7%)
-
-
-
DQA1*05
21
Praca oryginalna
Endokrynol. Ped., 2/2003;4(5):17-28
Allele DRB1*03 i DRB1*04 stwierdzono znamiennie częściej, zarówno w grupie chorych, jak i w
grupie rodzeństwa, w porównaniu z grupą kontrolną.
Allele DQB1*0302 i DQB1*0201 występowały
znamiennie częściej w grupie chorych w porównaniu z grupą kontrolną.
Allel DRB1*11 stwierdzono istotnie częściej w
grupie rodzeństwa w porównaniu z grupą kontrolną.
Wśród 23 analizowanych par dzieci badano występowanie haplotypów predysponujących do cukrzycy
typu 1: DRB1*04, DQA1*03011, DQB1*0302 lub
DRB1*03, DQA1*05011, DQB1*0201 lub ich jednoczesne współwystępowanie.
W 9 (39%) przypadkach kombinacja alleli
DRB1*04 DQA1*03011 DQB1*0302 nie występowała ani u chorego, ani u rodzeństwa. W 6 (26%)
przypadkach ta kombinacja występowała u obojga dzieci. W 8 (35%) przypadkach znaleziono daną
kombinację alleli u dziecka chorego, a nie znaleziono jej u jego rodzeństwa. W sumie daną kombinację
stwierdzono u 14 (61%) dzieci chorych i u 6 (26%)
dzieci z grupy rodzeństwa. Różnica jest istotna statystycznie (p = 0,0047; tab. 2).
Wśród wszystkich (23) analizowanych par dzieci
w 8 (35%) przypadkach kombinacja alleli DRB1*03
DQA1*05011 DQB1*0201 nie występowała ani u
chorego, ani u rodzeństwa. W 6 (26%) przypadkach
występowała u obojga dzieci. W 7 (30%) znaleziono daną kombinację alleli u dziecka chorego i nie
stwierdzono jej u jego rodzeństwa. W 2 (9%) przypadkach tę kombinację wykryto w grupie rodzeństwa, natomiast nie znaleziono jej w grupie chorych.
W sumie znaleziono ją u 13 (57%) dzieci chorych i u
8 (35%) dzieci z rodzeństwa. Różnica nie jest istotna
statystycznie (p = 0,1; tab. 3).
Wśród wszystkich (23) analizowanych par dzieci
w 14 (61%) przypadkach predysponujące haplotypy
DRB1*04 DQA1*03011 DQB1*0302 i DRB1*03
DQA1*05011 DQB1*0201 nie występowały ani u
chorego, ani w grupie rodzeństwa. W 2 (9%) przypadkach dana kombinacja występowała u obojga
dzieci. W 7 (30%) przypadkach stwierdzono oba
haplotypy u dziecka chorego i nie znaleziono takiej
kombinacji u jego rodzeństwa. W sumie współwystępowanie obu predysponujących haplotypów znaleziono u 9 (39%) dzieci chorych i u 2 (9%) dzieci z
grupy rodzeństwa. Różnica jest istotna statystycznie
p = 0,008; (tab. 4.)
Znamiennie częściej występowały również allele predysponujące do cukrzycy: DQB1*0302,
Tab. 2. Zgodność występowania haplotypu DRB1*04 DQA1*03011 DQB1*0302
Table 2. Concordance of occurrence of haplotype DRB1*04 DQA1*03011 DQB1*0302
Chory na cukrzycę typu 1
Diabetes mellitus type 1
Rodzeństwo / Siblings
Nie występuje / Not occurring
Występuje / Occurring
Razem / Together
nie występuje
not occurring
występuje
occurring
razem
together
9 (39%)
8 (35%)
17 (74%)
0
6 (26%)
6 (26%)
9 (39%)
14 (61%)
23 (100%)
p = 0,0047
Tab. 3. Zgodność występowania haplotypu DRB1*03 DQA1*05011 DQB1*0201
Table 3. Concordance of occurrence of haplotype DRB1*03 DQA1*05011 DQB1*0201
Chory na cukrzycę typu 1
Diabetes mellitus type 1
nie występuje
not occurring
występuje
occurring
razem
together
Nie występuje / Not occurring
8 (35%)
7 (30%)
15 (65%)
Występuje / Occurring
2 (9%)
6 (26%)
8 (35%)
10 (43%)
13 (57%)
23 (100%)
Rodzeństwo / Siblings
Razem / Together
p = 0,10
22
Brett-Chruściel J. i inni – Czynniki genetyczne i immunologiczne...
Tab. 4. Zgodność występowania haplotypu DRB1*04 DQA1*03011 DQB1*0302 / DRB1*03 DQA1*05011 DQB1*0201
Table 4. Concordance of occurrence of haplotype DRB1*04 DQA1*03011 DQB1*0302 / DRB1*03 DQA1*05011 DQB1*0201
Chory na cukrzycę typu 1
Diabetes mellitus type 1
Rodzeństwo / Siblings
Nie występuje / Not occurring
Występuje / Occurring
Razem / Together
nie występuje
not occurring
występuje occurring
Razem
together
14 (61%)
7 (30%)
21 (91%)
0
2 (9%)
2 (9%)
14 (61%)
9 (39%)
23 (100%)
DQA1*03011 i DRB1*04. Allel DQB1*0302
stwierdzono u 7 (30%) dzieci w obu grupach: chorych i rodzeństwa. U 9 (39%) dzieci allel występował tylko w grupie chorych i nie stwierdzono jego
występowania w grupie rodzeństwa. U 6 (26%) badanych nie występował ani u chorego dziecka, ani u
jego rodzeństwa. U 1 (4%) występował tylko w grupie rodzeństwa i nie stwierdzono go w grupie chorych. W sumie allel DQB1*0302 znaleziono u 16
(70%) chorych i u 8 (35%) rodzeństwa. Różnica jest
istotna statystycznie (tab. 5).
Allel DRB1*04 stwierdzono u 12 (52%) dzieci w
obu grupach: chorych i rodzeństwa. U 6 (26%)
dzieci występował tylko w grupie chorych i nie
stwierdzono jego obecności w grupie rodzeństwa; u
5 (22%) nie występował ani u chorego dziecka, ani
u jego rodzeństwa. W sumie allel DRB1*04 znaleziono u 18 (78%) chorych i u 12 (52%) osób z grupy rodzeństwa. Różnica ta jest istotna statystycznie
(tab. 6).
Allel DQA1*03011 stwierdzono u 7 (30%)
dzieci w obu grupach: chorych i rodzeństwa.
p = 0,008
Tab. 5 Zgodność występowania allelu DQB1*0302
Table 5. Concordance of occurrence of allel DQB1*0302
Chory na cukrzycę typu 1
Diabetes mellitus type 1
nie występuje
not occurring
występuje occurring
razem
together
Nie występuje / Not occurring
6 (26%)
9 (39%)
15 (65%)
Występuje / Occurring
1 (4%)
7 (30%)
8 (35%)
Razem / Together
7 (30%)
16 (70%)
23 (100%)
Rodzeństwo / Siblings
p = 0,011
Tab. 6. Zgodność występowania allelu DRB1*04
Table 6. Concordance of occurrence of allel DRB1*04
Chory na cukrzycę typu 1
Diabetes mellitus type 1
Rodzeństwo / Siblings
Nie występuje / Not occurring
Występuje / Occurring
Razem / Together
nie występuje not occurring
występuje occurring
razem
together
5 (22%)
6 (26%)
11 (48%)
0
12 (52%)
12 (52%)
5 (22%)
18 (78%)
23 (100%)
p = 0,014
23
Praca oryginalna
Endokrynol. Ped., 2/2003;4(5):17-28
U 10 (44%) występował tylko w grupie chorych, nie
stwierdzono go zaś w grupie rodzeństwa; u 5 (22%)
nie występował ani u dziecka chorego, ani u jego rodzeństwa. W sumie allel DQA1*03011 znaleziono u
17 (74%) chorych i u 8 (35%) osób z grupy rodzeństwa. Różnica ta jest istotna statystycznie (tab. 7).
większe ryzyko zachorowania. Dzieci te należą do
grupy zwiększonego ryzyka zachorowania na cukrzycę. Rozpoznano u nich fazę prediabetes i włączono prewencyjnie insulinę o przedłużonym działaniu w dawce 2-3 j.m./dobę.
U jednego z dzieci (O.D.) poziomy przeciwciał
Tab. 7. Zgodność występowania allelu DQA1*03011
Table 7. Concordance of occurrence of allel DQA1*03011
Chory na cukrzycę typu 1
Diabetes mellitus type 1
nie występuje
not occurring
występuje occurring
razem
together
Nie występuje / Not occurring
5 (22%)
10 (44%)
15 (65%)
Występuje / Occurring
1 (4%)
7 (30%)
8 (35%)
Razem / Together
6 (26%)
17 (74%)
23 (100%)
Rodzeństwo / Siblings
p = 0,007
W analizie statystycznej stwierdzono w grupie
chorych w porównaniu z grupą rodzeństwa znamiennie częstsze występowanie predysponujących do cukrzycy alleli DRB1*04, DQB1*0302, DQA1*03011
oraz
haplotypu
DRB1*04
DQA1*03011
DQB1*0302. Istotnie częstsze było również współwystępowanie w grupie chorych obu obciążających
haplotypów: DRB1*04 DQA1*03011 DQB1*0302/
DRB1*03 DQA1*05011 DQB1*0201.
W grupie rodzeństwa badaniem par (case-control) stwierdzono u 6 (17%) badanych układ HLA
identyczny, u 9 (26%) półidentyczny. Allele ryzyka stwierdzono u 20 (57%) badanych. Badano korelację pomiędzy występowaniem układu HLA identycznego lub półidentycznego i czynnikami ryzyka
a podwyższonym poziomem markerów immunologicznych: anty GAD i anty IA-2. Różnicę istotną statystycznie stwierdzono jedynie w grupie z układem
HLA półidentycznym, a przeciwciałami anty GAD.
U 81 osób z badanej grupy rodzeństwa (105
osób) nie stwierdzono obecności przeciwciał anty
GAD i anty IA-2 w badanych surowicach. U 14
dzieci występowały markery immunologiczne, u 7
badanych w podwyższonych mianach, w tym u 4
stwierdzono współwystępowanie przeciwciał anty
IA-2 i anty GAD w wysokich mianach. Oznaczone allele HLA DRB1 DQA1 i DQB1 wykazały u
5 z 7 osób predyspozycje do zachorowania na cukrzycę, u jednego badanego neutralnie kojarzyły się
z cukrzycą. Ponadto układ HLA był identyczny (w
1 przypadku) lub półidentyczny (w 4 przypadkach)
z dzieckiem chorym, co dodatkowo wskazuje na
24
narastały i w trakcie obserwacji stwierdzono obniżenie insulinosekrecji. Poziomy przeciwciał anty
IA2 i anty GAD w kolejnych oznaczeniach, co 6-12
miesięcy, przedstawia tab. 8. U tego dziecka stwierdzono obecność alleli HLA predysponujących do
cukrzycy, dodatkowo ryzyko zwiększa występowanie układu HLA półidentycznego z dzieckiem chorym. Chłopiec ten otrzymuje insulinę o przedłużonym działaniu w dawce 3 j.m./dobę. W ciągu ostatniego roku obserwacji badania markerów immunologicznych wykazały narastanie poziomu anty GAD
i anty IA-2. Test obciążenia glukozą wykazał obniżenie piku wczesnego sekrecji peptydu C. Chłopiec
wymaga dalszej obserwacji i monitorowania parametrów w czasie (tab. 8).
U drugiego dziecka (K.M.) poziomy przeciwciał
anty GAD i IA-2 utrzymywały się istotnie podwyższone przez sześcioletni okres obserwacji, chociaż
po włączeniu insuliny w dawce 2-4 j.m./dobę przeciwciała anty GAD wykazywały tendencję spadkową, natomiast IA-2 wzrostową (tab. 8). U tego
dziecka stwierdzono układ haplotypów półidentyczny z dzieckiem chorym. W trakcie obserwacji następowało obniżenie piku wczesnego insuliny i peptydu C i stopniowy łagodny wzrost zapotrzebowania na insulinę. W lipcu 2002 r. ujawniła się klinicznie cukrzyca, co wymagało włączenia insulinoterapii w dawkach leczniczych. Poziomy przeciwciał
IA-2, anty GAD wynosiły wtedy odpowiednio: 16,9
i 19,8 UI (tab. 8).
Rodzice trzeciego dziecka nie wyrazili zgody na
zastosowanie prewencyjnych dawek insuliny. Dziew-
Brett-Chruściel J. i inni – Czynniki genetyczne i immunologiczne...
Tab. 8. Wyniki badań w grupie zwiększonego ryzyka wystąpienia cukrzycy
Table 8. Results of research in the group of increased susceptibility to diabetes
czynka (N.M.) jest w trakcie obserwacji od 9 lat. W
okresie tym poziomy przeciwciał anty IA-2 i anty
GAD są stale podwyższone (tab. 8). Pik insulinosekrecji, początkowo znacznie obniżony, następnie ulegał poprawie, podobnie jak pik Peptydu C. W ciągu
ostatniego roku obserwacji stwierdzono stopniowe
narastanie poziomu przeciwciał i utrzymywanie się
insulinosekrecji na stałym poziomie. U dziewczynki
występują haplotypy HLA silnie kojarzące się z za-
chorowaniem na cukrzycę, jednocześnie układ HLA
jest identyczny z HLA chorego brata (tab. 8).
U czwartego z badanych (S.J.), u którego występowały podwyższone poziomy obu markerów immunologicznych (tab. 8) w czasie 3-letniej obserwacji, stwierdzono również predyspozycję genetyczną.
Pik sekrecji insuliny i peptydu C był obniżony. Rodzice chłopca nie wyrazili zgody na prewencję insuliną (tab.8).
25
Praca oryginalna
U 14 dzieci stwierdzono podwyższenie jednego z badanych parametrów immunologicznych, u 7
był to wzrost incydentalny, który nie potwierdził się
w trakcie wieloletniej obserwacji. U 2 dzieci (S.W.
i T.D.) podwyższenie poziomu przeciwciał anty
GAD lub IA-2 było znamienne i narastające w czasie. U jednego z nich (S.W.) stwierdzono półidentyczny układ HLA i haplotyp predysponujący do
zachorowania na cukrzycę; insulinosekrecja była w
granicach prawidłowych. U T.D. stwierdzono istotny spadek sekrecji insuliny i peptydu C (tab. 8). Rodzice badanego nie wyrazili zgody na prewencję insuliną (tab. 8). U kolejnego badanego (B.K.) z grupy rodzeństwa, stwierdzono podwyższony poziom
przeciwciał anty Gad, który znormalizował się w
kolejnych badaniach, spadek sekrecji insuliny i
układ HLA półidentyczny. W rodzinie tej już dwoje
dzieci choruje na cukrzycę typu 1 (tab. 8).
Badania immunologiczne rodzeństwa dzieci
chorych na cukrzycę z rodzin wielodzietnych, pozostających pod opieką naszej Poradni umożliwiły
wykrycie u 14 na 105 badanych dzieci i młodzieży
podwyższonych w różnym stopniu markerów immunologicznych cukrzycy. Stanowi to około 13,3%
badanej populacji.
Interpretacja wyników i dyskusja
Dla rodzin dzieci chorych na cukrzycę określenie stopnia ryzyka zachorowania pozostałych dzieci na tę chorobę jest badaniem istotnym, a stwierdzenie ryzyka, zwłaszcza ryzyka wysokiego stopnia dostarcza znaczących wskazówek dla trybu postępowania, umożliwia przy obecności ścisłych wskazań leczenie prewencyjne, mające zahamować lub zwolnić proces destrukcji komórek
β wysp Langerhansa trzustki. Na podstawie opisanych przypadków można stwierdzić, że prewencyjne leczenie insuliną wymaga jeszcze dalszych
badań dla wyciągnięcia klinicznie znaczących
wniosków.
Wszystkie badane rodziny pozostają nadal w
kontakcie z programem, a dzieci ze stwierdzonymi patologicznymi parametrami immunologicznymi pozostają pod opieką Poradni Diabetologicznej.
W 1994 roku ukazał się raport grupy WHO [16],
który zaleca dokonywanie badań identyfikujących
osoby zwiększonego ryzyka wśród rodzeństwa
dzieci chorych na cukrzycę, poprzez określanie haplotypów HLA, przeciwciał ICA, IA-2, przeciwciał
anty GAD oraz markerów metabolicznych ocenianych w dożylnym teście obciążenia glukozą.
26
Endokrynol. Ped., 2/2003;4(5):17-28
Zgodnie jednak z ostatnim raportem WHO i doniesieniami innych autorów, nie ustalono dotychczas swoistego markera ani grupy markerów, które jednoznacznie przesądzałyby o nieuchronnym
ryzyku wystąpienia choroby. Żaden z markerów
HLA lub ich kombinacja nie wykazuje swoistości
dla choroby. Tylko niewielu spośród istniejącej dużej grupy w populacji ogólnej nosicieli predysponujących alleli rozwinie chorobę.
Stwierdzono, że u wielu osobników przeciwciała „swoiste” dla cukrzycy występowały nawet na
10 lat przed ujawnieniem choroby. Czy farmakoprofilaktykę należy stosować u wszystkich? Wykonanie identyfikujących badań jest bardzo kosztowne. Wyjaśnia to, dlaczego badań przesiewowych
całej populacji nie można wykonywać (stosunek
kosztu do korzyści byłby niewspółmiernie wysoki). Badania tego typu na większą skalę, obejmującą szeroko populację rodzeństwa chorych na cukrzycę typu 1, są wykonywane wyłącznie w krajach najbogatszych.
Istotne jest zaproponowanie skutecznych schematów farmakoprewencji pozbawionych działań
ubocznych. Grupa osobników o zwiększonym ryzyku musiałaby zaakceptować wieloletnią farmakoprofilaktykę. Obecnie można tylko stosować ogólne
zalecenia profilaktyczne dla dzieci zagrożonych.
Należy nadal poszukiwać markerów immunologicznych i genetycznych, których pojawienie się
jest sygnałem do rozpoczęcia określonego pakietu działań z zakresu prewencji pierwotnej czy też
wprowadzenia zasad postępowania i zaostrzonych
rygorów prewencji wtórnej. Nie jest przecież obojętne dla małego pacjenta i jego rodziny, czy rozpoczyna się modyfikację środowiskowych i behawioralnych czynników ryzyka postępowaniem interwencyjnym, czy też zaleca tylko wskazówki ogólne, co do których wykonania stopień akceptacji małego pacjenta jest zazwyczaj wątpliwy. W postępowaniu interwencyjnym nie jest też obojętne, czy
rozpoczyna się terapię farmakologiczną, czy też
działanie niefarmakologiczne, zmniejszające istniejące zawsze niebezpieczeństwo wystąpienia szkodliwych działań ubocznych leków. W obu przypadkach postępowania interwencyjnego celem jest poprawa i/lub utrzymanie prawidłowej czynności komórek? β ?trzustki [17].
Z konieczności ekonomicznej badania muszą
być ograniczone do krewnych pierwszego stopnia,
a wykonywane dla doradztwa rodzinnego – sterowane wyborami uwzględniającymi współczynnik
koszt/korzyść.
Brett-Chruściel J. i inni – Czynniki genetyczne i immunologiczne...
Nie jest możliwe wykonywanie takich badań dla
całej populacji ani objęcie całego rodzeństwa dzieci chorych na cukrzycę typu 1 pełnym zestawem
badań, zwłaszcza, że nie zidentyfikowano jedynego, najważniejszego, czułego i swoistego markera
zwiastującego cukrzycę insulinozależną typu I. Należy pogodzić się ze stwierdzeniem, że wszystkie
elementy „łamigłówki” biologicznej prowadzącej
do rozwinięcia choroby nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Udało się ustalić, że osobników posiadających określony haplotyp HLA i określone markery immunologiczne dotyczy istotnie większe prawdopodobieństwo zachorowania. Należy pamiętać,
że istnieje duża zapewne grupa osób z opisanymi cechami, w której nigdy nie rozwinie się choroba. Część chorych na cukrzycę nie ma „kompletu”
markerów lub nawet jakiegokolwiek z nich. Zagadka etiologii cukrzycy nadal nie jest rozwiązana, niemniej poznane już fakty wskazują na potrzebę prowadzenia dalszych badań genetycznych i immunologicznych oraz wykorzystywania uzyskiwanych
informacji w poradnictwie rodzinnym.
Wysoce wskazane wydaje się zorganizowanie
poradni zajmujących się obiektywizacją poradnictwa rodzinnego w cukrzycy typu 1. Stosowanie w
jak najszerszym, ekonomicznie możliwym i uzasadnionym zakresie pełnego „uniwersalnego pakietu badań” lub też w przypadku powziętych w wyniku obserwacji klinicznych podejrzeń istnienia wyraźnych czynników ryzyka genetycznego rutynowych badań laboratoryjnych dla ustalenia obecno-
ści „markerów” decydujących o podjęciu działań
prewencyjnych jest uzasadnione merytorycznie już
na obecnym etapie wiedzy o praktycznych aspektach patogenezy i przebiegu cukrzycy typu 1.
Wnioski
Dla rodzin dzieci z cukrzycą określenie stopnia
ryzyka zachorowania rodzeństwa na tę chorobę jest
badaniem istotnym, a stwierdzenie ryzyka, zwłaszcza ryzyka wysokiego stopnia, dostarcza znaczących wskazówek dla trybu postępowania, umożliwia przy obecności ścisłych wskazań leczenie prewencyjne, mające zahamować lub zwolnić proces
destrukcji komórek β wysp Langerhansa trzustki.
Konieczność ekonomiczna sprawia, że badania muszą być ograniczone do krewnych pierwszego stopnia, a wykonywane dla doradztwa rodzinnego zakładać wyboru uwzględniające współczynnik
koszt/korzyść.
Przedstawione wyniki badań wskazują na potrzebę prowadzenia dalszych badań genetycznych i
biochemicznych oraz wykorzystywania uzyskiwanych informacji w poradnictwie rodzinnym.
Wysoce wskazane wydaje się zorganizowanie
poradni zajmujących się obiektywizacją poradnictwa rodzinnego w cukrzycy typu 1.
Praca wykonana w ramach grantu IP CZD S/68/99.
(Endnotes)
PIŚMIENNICTWO/REFERENCES
[1]
[2]
The World Health Report 1997. Wld. Hlth. Org., 1997, 6.
Virtanen S.M., Saukkonen T., Savilahti E. et al.: Diet, cow milk protein antibodies and the risk of IDDM in Finnish children.
Diabetologia, 1994:37, 381-387.
[3] Atkinson M.A., Maclaren N.K.: The pathogenesis of IDDM. N. Engl. J. Med., 1994:331, 1428-1436.
[4] Field L.L.: Genetic linkage and association studies of Type 1 diabetes: challenges rewards. Diabetologia, 2002:45 (1),
21-35.
[5] Reijonen H., Ilonen J., Knip M. et al.: HLA-DQ beta-chain restriction fragment length polimorphism as a risk marker in Type I
diabetes mellitus: a Finnish family study. Diabetologia, 1990:33, 357-362.
[6] Vallet-Colom I., Levy-Marchal C., Zarrouk D. et al.: HLA-DQB1 codon 57 and genetic susceptibility to type I diabetes mellitus
in French children. Diabetologia, 1990 :33, 174-176.
[7] Młynarski W.; Kubryk i.; Heinrich A.: Związek alleli genów HLA klasy II z rodzinnym występowaniem cukrzycy typu 1. Przegląd
Pediatryczny, 2003:33, 2, 145-148.
[8] Kukko M., Kimpimaki T., Kupila A.: Signs of beta-cell autoimmunity and HLA-defined diabetes succeptibility in the Finnish
population: the sib kohort from the Type 1 Diabetes prediction and prevention study. Diabetologia, 2003:46 (10), 65-70.
[9] Krokowski M., Bodalski J., Bratek A. et al.: HLA class II-associated predisposition to insulin-dependent diabetes mellitus in a
Polish population. Human Immunology, 1998:59, 7, 451-455.
[10] Deschamps I., Robert J.J., Hors J.: Le conseil genetique pour les diabetiques. Diabete et Metabolisme (Paris), 199016,
160-171.
[11] Czyżyk A.: Patofizjologia i klinika cukrzycy. PZWL, Warszawa 1995.
27
Praca oryginalna
Endokrynol. Ped., 2/2003;4(5):17-28
[12] Kimpimaki T., Kulmala P., Savola K. et al.: Natura history of beta-cell autoimmunity in young children wyith increased genetic
succeptibility to type 1 diabetes recruited from general population. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2002:87, 9100, 4572-4579.
[13] Mrena S., Savola K., Kulmala P.: Genetic modification of pisk assessment based on staging of preclinical type 1 diabetes in
siblings of affected children. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2003:88 (6), 2682-2689.
[14] Roll U., Christie M.R., Fuchtenbusch M. et al.: Perinatal autoimmunity in offspring of diabetic parents. The German multicenter
Baby-Diab study: Detection of humoral immune responses to islet antigens in early childhood. Diabetes, 1996:45, 967-973.
[15] Stata Statistical Software: Release 7.0, College Station, TX, Stata Corporation.
[16] Prevention of Diabetes Mellitus. Report of a WHO Study Group. WHO Technical Report Series nr 844, WHO, Geneva 1994, 3.
[17] Implementing National Diabetes Programmes. Report of a WHO Meeting. WHO, Geneva 1995.
28