laboratorium 2.

LABORATORIUM 2.
Temat: OTRZYMYWANIE WYBRANYCH PREPARATÓW
BIOCHEMICZNYCH.
Zadanie 1. Krystaliczna albumina jaja.
Wykonanie:
· Białko 1 jaja po oddzieleniu od żółtka umieścić w plastikowym cylindrze miarowym
(w celu zmierzenia objętości) i przelać do plastikowego pojemniczka (zlewka nr1),
- w innym plastikowym cylindrze miarowym odmierzyć taką samą objętość
nasyconego roztworu siarczanu amonu i dodać do zlewki nr 1wlewając go cienkim
strumieniem równocześnie mieszając szklaną bagietką. Zamknąć pojemnik i
wymieszać.
· Wypada osad globulin, który należy odsączyć na miękkim, bibułowym sączku
fałdowanym zbierając przesącz do szklanego cylindra miarowego.
· Zmierzyć za pomocą szklanego cylindra miarowego objętość przesączu i przelać go do
plastikowego pojemniczka (zlewka nr 2).
- dodać na każde 100 ml. przesączu 14,4 g drobno sproszkowanego siarczanu
amonowego (UWAGA ! - 1 płaska łyżeczka to ok. 1,44 g siarczanu amonu).
Siarczan amonowy dodawać małymi porcjami stale mieszając bagietką. Powstaje osad.
· Powstały osad przesączyć do kolbki ssawkowej przez miękki sączek, korzystając z
lejka Büchnera i pompy wodnej.
· Osad zebrać z sączka za pomocą plastikowej łyżeczki do zlewki szklanej (szklanej
probówki),
- rozpuścić w możliwie małej objętości wody
- i roztwór doprowadzić do pH 4,7 za pomocą 4 % kwasu octowego korzystając z pHmetru, stale mieszając.
· Roztwór przesączyć do kolbki ssawkowej przez miękki sączek, korzystając z lejka
Büchnera i pompy wodnej.
· Przelać przesącz do plastikowego pojemniczka (zlewki nr 3 – „albumina”),
- do klarownego przesączu dodać przy stałym mieszaniu pojedynczymi kroplami
nasycony roztwór siarczanu amonowego aż do powstania trwałego, delikatnego
zmętnienia.
· Próbę pozostawić w lodówce. W ciągu 2 dni wypadają z zawiesiny kryształy albuminy
jaja w formie igieł.
Wypreparowane białko posłuży do realizacji dalszych ćwiczeń.
Zadanie 2. Izolowanie glikogenu z wątroby - metoda Osterna
Wykonanie:
·
Wątrobę (25 g) pociąć za pomocą nożyczek na drobne kawałki,
-
rozetrzeć w moździerzu z 1 łyżeczką piasku, czyli homogenizować (piasek
dodawać porcjami).
1
·
Odmierzyć do plastikowego cylindra miarowego 10 ml. homogenatu.
-
do innego plastikowego cylindra miarowego odmierzyć10 objętości
(czyli100 ml.) 5 % kwasu trójchlorooctowego,
-
przelać homogenat i kwas do plastikowego pojemnika (zlewka nr 1)
i wymieszać (wstrząsając zlewką),
·
odstawić na 3 min.
Ciecz znad osadu przesączyć do szklanego cylindra miarowego przez miękki
sączek bibułowy w celu zmierzenia objętości.
-
w innym szklanym cylindrze miarowym odmierzyć taką samą objętość 95
% etanolu.
·
Do plastikowego pojemnika (zlewki – przesącz z glikogenem) przelać przesącz
i dodawać, stale mieszając 95 % etanol.
·
Zamknąć zlewkę, wymieszać i oddać prowadzącemu.
Wytracony glikogen po odsączeniu będzie wykorzystany w kolejnych ćwiczeniach.
Zadanie 3. Izolacja kwasów nukleinowych z komórek bakterii.
Wykonanie:
·
Do probówki Eppendorfa dodać:
-
0,1 ml gęstej zawiesiny bakterii (E. Coli)
-
0,4 ml r-ru lizującego: 3 % SDS w buforze TRIS 50 mM o pH 12,6
·
„eppendorfkę” umieścić w łaźni wodnej o temp. 55 OC na 10 ¸ 20 minut,
·
następnie dodać :
-
·
0,5 ml mieszaniny odbiałczającej: chloroform – fenol 1:1,
odwirować próbę w temp. 4 OC (wirówka Eppendorfa umieszczona w lodówce)
przy 6000 obrotów przez 5 minut.
·
Wytrącone DNA nawinąć na bagietkę i przenieść do nowej probówki Eppendorfa.
Uzyskany materiał zostanie zamrożony i posłuży do dalszych badań (elektroforeza).
2
Zadanie 4. Otrzymywanie preparatu inwertazy z drożdży.
Wykonanie:
·
5 g drożdży rozcierać w moździerzu z piaskiem,
-
przez 5 min dodać około 25 ml. wody i ponownie dokładnie rozetrzeć.
·
Odwirować w temp. 200C, przez 10 min. przy 6 000 obr/min., lub przesączyć.
·
Zmierzyć za pomocą szklanego cylindra miarowego objętość supernatantu
(cieczy nadosadowej),
·
Do innego szklanego cylindra miarowego odmierzyć 5-krotną objętość acetonu
-
przelać do plastikowej zlewki nr 1.
·
Supernatant też przelać do zlewki nr 1 (tej, w której jest już aceton).
·
Zakręcić pojemnik i wymieszać. Wytrąca się osad.
·
Próbę należy przesączyć na miękkim sączku bibułowym.
·
Na sączku osadza się osad, który następnie należy zebrać za pomocą plastikowej
łyżeczki do plastikowego pojemnika (zlewki nr 2)
·
Osad w zlewce nr 2 należy rozpuścić w 20 ml. wody destylowanej dodawanej
porcjami.
·
Sączyć na miękkim sączku bibułowym do plastikowego pojemnika (zlewki inwertaza z drożdży).
Uzyskany przesącz zawierający enzym można przechowywać w lodówce przez kilka
tygodni. Inwertaza po 50-krotnym rozcieńczeniu będzie wykorzystywana w dalszych
ćwiczeniach do badań nad aktywnością enzymatyczną.
3