Identyfikacja wirusów ludzkich brodawczaków (HPV) w stanach

Identyfikacja wirusów ludzkich brodawczaków (HPV)
w stanach zapalnych i nowotworach uszu
Identification of human papilloma viruses (HPV)
in inflammatory states and ear neoplasms
Bogdan Rydzewski1,2, Anna Goêdzicka-Józefiak3,
Jerzy Sokalski2, Monika Matusiak1,2, ¸ukasz Durzyƒski2
Oddzia∏ Otolaryngologiczny Szpitala im. F. Raszei w Poznaniu
Ordynator: prof. dr hab. med. B. Rydzewski
2
Katedra i Klinika Chirurgii Stomatologicznej AM w Poznaniu
Kierownik: prof. AM dr hab. med. J. Sokalski
3
Zak∏ad Wirusologii Molekularnej Uniwersytetu AM w Poznaniu
Kierownik: prof. dr hab. A. Goêdzicka-Józefiak
1
F
Summary
Introduction. Human Papilloma Virus has a strong relation to oropharyngeal mucosa and is considered to be responsible
for a wide range of upper respiratory tract pathologies, like laryngeal papilloma. There’s a hypothesis, that it plays a significant role in middle ear chronic inflammations and neoplasm’s. Material and methodic. The examination was carried
on a group of 53 patients, 39 of which was suffering from granulation tissue chronic otitis media, 7-cholesteatomatous otitis media, 6 – middle ear malignant neoplasm, and 1 middle and/or external ear benign neoplasm. The control group consisted of 5 patients operated on: otosclerosis – 4 cases and post-traumatic tympanic membrane perforation – 1 case. The
material was postoperative tissue, like polyps, inflammatory granulation tissue, cholesteatoma masses and malignant neoplasm’s tissue. Results. In the whole group of 53 examined cases, HPV DNA was confirmed in 22 cases (41,5%), in that
group oncogenic types 16 or 18 in 12 cases (22,6%), and in 14 cases (26,4%) types 6 or 11. In a group of chronic granulomatous otitis media DNA characteristic for Papilloma was identified in 12 cases (25,6%), in it in 9 cases DNA HPV type
6 or 11 was confirmed, and in 7 cases type 16 or 18. Among cholesteatomatous chronic otitis media HPV DNA types 6 or
11 was identified in 70%. In every case of middle ear malignant neoplasm a presence of high-risk DNA Papilloma types
16 or 18 was confirmed. In any case of control group HPV DNA was detected. Conclusions. The results has been compared
with other authors examinations and it is claimed that they confirm the observation, that Human Papilloma Viruses may
be a factor, that might play an important role in pathology of chronic otitis media and ear neoplasm’s. It is concluded, that
differences in percentages of HPV presence in chronic inflammations (70%) and ear neoplasm’s may be explained by viral
co-infection during bacterial c. o. m. Viral infection probably evolves carcinogenesis, which leads to a neoplastic growth.
H a s ∏ a i n d e k s o w e : przewlek∏e zapalenie ucha Êrodkowego, wirus brodawczaka ludzkiego (HPV), nowotwory ucha
K e y w o r d s : otitis media chronica, human papilloma virus (HPV), ear, neoplasm
Otolaryngol Pol 2007; LXI (2): 137–141
© 2007 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów G∏owy i Szyi
F
WST¢P
Ludzkie wirusy brodawczaka (Human Papilloma Virus – HPV) nale˝à do rodziny Papovaviridae.
Wirus ten ma pozbawiony otoczki kapsyd w kszta∏cie dwudziestoÊcianu, który zawiera dwuniciowe,
koliste DNA zbudowane z 7900 par zasad. Patogen
ten wykazuje szczególnie wysokie powinowactwo
Autorzy nie zg∏aszajà konfliktu interesów.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 2
137
B. Rydzewski i inni
do b∏ony Êluzowej dróg oddechowych i narzàdów
p∏ciowych. Znane sà ró˝ne jego typy, które wykazujà odmienne w∏aÊciwoÊci onkogenne – wysoki
potencja∏ onkogenny majà typy 16 i 18, identyfikowane np. w rakach szyjki macicy [7, 8], natomiast
typy 6 i 11 wyst´pujà przede wszystkim w drogach
oddechowych i majàc niski potencja∏ onkogenny
wywo∏ujà jedynie ∏agodne procesy rozrostowe, np.
brodawczaki krtani wieku dzieci´cego.
Typy 16 i 18 wykrywane sà tak˝e w zmianach
z∏oÊliwych jamy ustnej, zatok i nosa, krtani, prze∏yku oraz ucha Êrodkowego. Dane z piÊmiennictwa
dowodzà, i˝ przypadki raka p∏askonab∏onkowego
ucha Êrodkowego w wysokim odsetku poprzedzone sà jego przewlek∏ym zapaleniem (z.u.Ê.), o wieloletnim przebiegu [1, 5]. Wyst´powanie wirusów
HPV typu 16 i 18, w materiale pooperacyjnym uzyskanym od chorych na nowotwór ucha, wskazuje
na zwiàzek pomi´dzy kancerogenezà a obecnoÊcià
tych wirusów [3, 6]. Typy 6 i 11 nie sà natomiast
wykrywane w zmianach z∏oÊliwych ucha Êrodkowego [1, 6], ale wyst´pujà wg Chao i wsp. w 36%
perlakowych zapaleƒ ucha Êrodkowego [2].
CEL PRACY
Podj´to prób´ ustalenia uczestnictwa wirusów
brodawczaka ludzkiego w etiopatogenezie przewlek∏ych zmian zapalnych i nowotworowych ucha
w populacji polskiej. Badania obejmowa∏y identyfikacj´ DNA typów 6, 11, 16 i 18 wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) w tkankach ucha z powy˝szymi schorzeniami. Równolegle postanowiono
przeprowadziç w tym samym materiale badania
identyfikujàce wirusy nab∏onkowe opryszczki
(HSV) i cytomegalii (CMV).
MATERIA¸ I METODY
Badaniami obj´to 53 chorych leczonych na Oddziale Otolaryngologicznym Szpitala Miejskiego
im. Fr. Raszei w Poznaniu w latach 2000–2005.
W grupie tej u 7 osób stwierdzano nowotwory
ucha Êrodkowego i/lub przewodu s∏uchowego zewn´trznego, a 46 by∏o leczonych z powodu ró˝nych typów przewlek∏ego zapalenia ucha Êrodkowego. Grup´ kontrolnà utworzono z chorych, których operowano z powodu otosklerozy – 4 przypadki, oraz pourazowej suchej perforacji b∏ony b´benkowej – 1 przypadek.
138
Materia∏em badaƒ by∏y wymazy z przewodu
s∏uchowego zewn´trznego, pobrane przed planowanà operacjà ucha za pomocà specjalnie przystosowanej do tego ezy, oraz fragmenty nab∏onka, mas
perlaka, polipów i ziarniny zapalnej z przewodu
s∏uchowego zewn´trznego i/lub ucha Êrodkowego,
pobrane z pomocà kleszczyków usznych w czasie
operacji. Pobrany materia∏ przechowywano i transportowano do badaƒ w niewielkiej iloÊci ˝elu,
w temp -20° C.
Odr´bnym materia∏em badawczym by∏y skrawki parafinowe, uzyskane z fragmentów guzów pobranych od pacjentów operowanych z powodu nowotworów ucha.
Z materia∏u klinicznego izolowano DNA metodà fenolowà – w sposób opisany przez Fife i wsp.
[4]. Przed przystàpieniem do izolacji DNA, skrawki odparafinowywano w ksylenie i alkoholu etylowym. Po wyizolowaniu DNA, czystoÊç preparatu
sprawdzano drogà elektroforezy w 1% ˝elu agarozowym. Dodatkowym testem by∏o powielanie
fragmentu genu beta-globiny w reakcji ∏aƒcuchowej polimeryzacji (PCR). Ca∏kowity DNA wykorzystywano jako matryc´ w reakcji PCR ze starterami – specyficznymi dla regionów oskrzydlajàcych fragmenty genomu wirusa HPV. Zestaw stosowanych w reakcji starterów jest przedstawiony
w tabeli II. Produkty PCR sprawdzano stosujàc
elektroforez´ w ˝elu agarozowym. Wybrane produkty DNA poddawano tak˝e automatycznemu
sekwencjonowaniu.
WYNIKI
Przeprowadzone badania wykaza∏y stosunkowo
cz´ste wyst´powanie DNA wirusa ludzkiego brodawczaka (HPV) w badanych chorobach ucha.
ObecnoÊç DNA charakterystycznego dla Papilloma
potwierdzono w 10 na 39 zbadanych przypadków
ziarninowego przewlek∏ego z.u.Ê (25,6%). WÊród
tych prób 9 zawiera∏o typ 6 lub 11, a u 7 wykryto
dodatkowo typ 16 HPV. DNA wirusów HPV-6
i HPV-11 zidentyfikowano tak˝e w 5 na 7 badanych próbek perlaka. ObecnoÊç DNA onkogennych
typów wirusa HPV-16 i -18 wykryto we wszystkich
próbach DNA, izolowanych z komórek nowotworów z∏oÊliwych ucha. W jednym przypadku rozpoznano u 75-letniego m´˝czyzny Verucca seborrhoica, gdzie zidentyfikowano HPV-6/11.
Wyniki przeprowadzonych badaƒ zestawiono
w tabeli III.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 2
Identyfikacja wirusów ludzkich brodawczaków
Tabela I. Charakterystka kliniczna badanych przypadków
Rozpoznanie
Liczba przypadków
Przewlek∏e z.u.Ê. ziarninowe
Przewlek∏e z.u.Ê. perlakowe
Nowotwory z∏oÊliwe ucha
Nowotwory niez∏oÊliwe ucha
Grupa kontrolna
– otoskleroza
– perforacja b∏ony b´benkowej
Wiek pacjentów
Leczenie
Operacyjne
Zachowawcze
39
7
6
1
5–81
9–48
41–75
–
27
7
6
1
12
–
–
–
4
1
16–51
5
–
Tabela II. Startery stosowane w ∏aƒcuchowej reakcji polimerazy
Nazwa startera
MY 09
MY 11
HPV16 P1
HPV 16 P2
HPV 18 P1
HPV 18 P2
HPV 18 ME 12
HPV 18 ME 50
PCO3
PCO4
Region
amplifikowany
Pozycja na mapie
genetycznej HPV
L1 33 typów
5939–5958
6165–6184
2361–2380
2503–2522
127–150
508–531
62202–62221
62292–62311
L1
E1
E6
gen ß-globiny
Sekwencja 5`–3`
WielkoÊç
produktu
CGTCCMARRGGAWACTGATC
GCMCAGGGWCATAAYAATGG
M=A+C, R=A+G, W=A+T, Y+C+T
GCCTGTGTAGGTGTTGAGGT
TGGATTTACTCCAACATTGG
GTGGACCAGCAAATACAGGA
TGCAACGACCACGTGTTGGA
CACGGCGACCCTACAAGCTACCTG
TGCAGCACGAATTGGCACTGGCCTC
ACACAACTGTGTTCACTAGC
CAACTTCATCCACGTTCACC
450pz
264pz
162pz
404pz
110pz
Tabela III. Wyst´powanie wirusa ludzkiego brodawczaka w zapaleniach przewlek∏ych i nowotworach ucha
Rozpoznanie
Liczba prób
n
Próby dodatnie
n
HPV 6/11Dodatnie
n (%)
HPV 16/18 Dodatnie
n (%)
Odsetek badanych
%
39
7
6
1
12
5
6
1
9 (23%)
5 (71,4%)
0 (0%)
1 (100%)
7 (17,9%)
0 (0%)
6 (100%)
0 (0%)
25,6%
9,4%
11,3%
1,8%
Przewlek∏e z.u.Ê. ziarninowe
Przewlek∏e z.u.Ê. perlakowe
Nowotwory z∏oÊliwe ucha
Nowotwory niez∏oÊliwe ucha
DYSKUSJA
Wirusy brodawczaka ludzkiego (HPV) odpowiedzialne sà za hiperplazj´ i brodawkowaty rozrost
nab∏onka p∏askiego, ale tak˝e za rozwój wywodzàcych si´ z niego nowotworów ∏agodnych i z∏oÊliwych [2]. Opierajàc si´ na danych z piÊmiennictwa
mo˝na uznaç, ˝e dla otolaryngologa najbardziej
istotne sà typy 6 i 11 HPV, odpowiedzialne za wyst´powanie ∏agodnych zmian nowotworowych
w górnych drogach oddechowych, ale prawdopodobnie tak˝e za rozwój perlaka w uchu Êrodko-
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 2
wym; opisali to Bergmann i wsp. [1] oraz Chao
i wsp. [2]. Typy 16 i 18 HPV obecne sà z kolei w nowotworach wywodzàcych si´ z komórek nab∏onkowych i oceniane jako wysoce kancerogenne. Sugeruje si´, ˝e wirusy te mogà byç równie˝ jednym
z czynników odpowiedzialnych za przed∏u˝anie
si´ procesu zapalnego oraz jego transformacj´ nowotworowà w uchu Êrodkowym [2]. Mechanizm
dzia∏ania wirusów mo˝e polegaç na bezpoÊrednim
uszkadzaniu komórek nab∏onka oraz na uruchamianiu kaskady reakcji zapalnych. Chao i wsp. sugerujà, i˝ aktywnoÊç prokancerogenna mo˝e byç efek-
139
B. Rydzewski i inni
tem synergistycznego dzia∏ania wirusów Papilloma
i wybranych czynników chemicznych oraz fizycznych, przypominajàc w ten sposób mechanizm
dzia∏ania genów supresorowych [2]. Zaka˝enie wirusowe w obr´bie ucha mo˝e wyst´powaç równoczeÊnie z koinfekcjà bakteryjnà, podtrzymujàc i nasilajàc objawy typowe dla bakteryjnego z.u.Ê. [5].
Przewlek∏y stan zapalny ucha, podtrzymywany
przez infekcj´ wirusowà, jest w stanie doprowadziç
do nieodwracalnych zmian w obr´bie nab∏onka
i zapoczàtkowaç kancerogenez´, co zosta∏o stwierdzone w pracy Jin i wsp. [5].
Z powy˝szych powodów nasze badania obj´∏y
chorych z populacji polskiej, u których stwierdzono kliniczne objawy przewlek∏ego ziarninowego
lub perlakowego z.u.Ê. oraz chorych z nowotworami z∏oÊliwymi ucha Êrodkowego i/lub przewodu
s∏uchowego zewn´trznego.
W ca∏ym materiale badaƒ obecnoÊç sekwencji
HPV stwierdzono w 24 przypadkach (41,4%). Wirusy onkogenne HPV typu 16 lub 18 zawiera∏o 13
prób (22,4%), natomiast 15 (25,9%) typu 6 lub 11.
Wyniki badaƒ potwierdzi∏y wyst´powanie we
wszystkich preparatach operacyjnych z rozpoznaniem nowotworu z∏oÊliwego (tj. w 6 przypadkach –
100%) wirusów Papilloma typu 16 lub 18, o wysokim potencjale onkogennym.
Podobne wyniki przynios∏y badania Jin i wsp.
[2], którzy potwierdzenie obecnoÊci HPV typu 16
lub 18 uzyskali w 11 na 14 (78%) przebadanych
przypadków nowotworu z∏oÊliwego ucha Êrodkowego, oraz badania Tsai i wsp. [8], którzy na podobnej grupie nowotworów z∏oÊliwych potwierdzili
obecnoÊç obydwu lub jednego z tych typów HPV
w 89%. Obydwaj autorzy podkreÊlajà, i˝ w wi´kszoÊci badanych przez nich przypadków nowotwór
z∏oÊliwy by∏ poprzedzony wieloletnim przewlek∏ym z.u.Ê. i wysuwajà wniosek, ˝e wysoki odsetek
onkogennych typów HPV w materiale badaƒ sugeruje aktywny ich udzia∏ w transformacji nowotworowej przewlek∏ego zapalenia.
W naszych badaniach obecnoÊç HPV typu 16
lub 18 potwierdzono w 17,9% przypadków przewlek∏ego ziarninowego i w 71,4% perlakowego z.u.Ê.
Porównujàc ten odsetek ze 100% obecnoÊcià HPV16 i HPF-18 w zbadanych przez nas preparatach
operacyjnych nowotworów ucha, nasuwa si´ przypuszczenie, ˝e w trakcie przewlek∏ego z.u.Ê. mo˝e
dojÊç do nadka˝enia powy˝szymi wirusami i transformacji nowotworowej, ale nie jest to regu∏à. Nieco odmienne wyniki uzyskali Bergmann i wsp. oraz
Chao i wsp. [1, 2]. Pierwszy z nich wykaza∏ obec-
140
noÊç wirusów w 36% badanych perlaków, a drugi
zaledwie w 1 przypadku na 32 badane preparaty
(3%). Przytoczeni autorzy pos∏ugiwali si´ t´ samà
metodà (opartà na reakcji PCR) co nasz zespó∏, a cechuje jà bardzo wysoka czu∏oÊç. Trudno jednoznacznie wyt∏umaczyç przyczyny tej rozbie˝noÊci
wyników, ale byç mo˝e jest ona spowodowana ró˝nymi okresami trwania przewlek∏ego z.u.Ê. Przemawia∏oby to za wysuni´tà wy˝ej mo˝liwoÊcià nadka˝ania zmienionych zapalnie tkanek ucha Êrodkowego przez wirusy HPV, które inicjujà kancerogenez´.
Wirusy opryszczki (HSV) i cytomegalii (CMV)
wykryto w niewielkim odsetku materia∏u badaƒ
(3,8%). UznaliÊmy, ˝e nie odgrywajà one ˝adnej roli w etiopatogenezie przewlek∏ego zapalenia ani te˝
nowotworów ucha Êrodkowego i nie analizowaliÊmy ich obecnoÊci w poszczególnych podgrupach
chorych.
WNIOSKI
1. Wyniki badaƒ wskazujà na udzia∏ wirusa
ludzkiego brodawczaka (HPV) w przewlek∏ym ziarninowym, jak i perlakowym z.u.Ê. oraz sugerujà jego udzia∏ w etiopatogenezie nowotworów.
2. W przewlek∏ym z.u.Ê wyniki badaƒ wirusologicznych mogà byç pomocne w prognozowaniu
przebiegu choroby, w tym okreÊleniu zagro˝enia
nowotworowego oraz w szybszym wdro˝eniu odpowiednich badaƒ diagnostycznych i leczenia.
3. Uzyskane wyniki zach´cajà do podj´cia badaƒ nad identyfikacjà innych wirusów, wykazujàcych powinowactwo do tkanek ucha Êrodkowego,
a mogàcych odgrywaç rol´ w etiopatogenezie przewlek∏ych zapaleƒ i nowotworów ucha.
PIÂMIENNICTWO
1. Bergmann K, Hoppe F, Yukai H, Helms J, Müller-Hermelink
HK, Stremlau A, i wsp. Papillomavirus infections – a major
cause of human cancer. Int J Cancer 1994; 59: 463–466.
2. Chao W-Y, Chang S-Y, Jin Y-T. Detection of human papillomavirus in cholesteatomas. Eur Arch Otorhinolaryngol 2000;
257: 120–123.
3. Dell G, Gaston K. Human papillomaviruses and their role in
cervical cancer. Cell Mol Life Sci 2001; 58: 1923–1942.
4. Fife KH, Rogers RE, Zwickl BW. Symptomatic and asymptomatic cervical infections with human papillomavirus during
pregnancy. J Infect Dis 1987; 156: 904–11.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 2
Identyfikacja wirusów ludzkich brodawczaków
5. Jin Y-T, Tsai S-T, Li C, Chang K-C, Yan J-J, Chao W-Y, i wsp.
Prevalence of human papillomavirus in middle ear carcinoma
associated with chronic otitis media. Am J Pathol 1997;
150(4): 1327–1333.
6. Kadish S, Kelley KF, Burk RD. Human papillomavirus infections and other risk factors for cervical neoplasia: A case-control study. Int J Cancer 1999; 6: 49–52.
7. Tsai S-T, Ching L, Jin Y-T, Chao W-Y, Su I-J. High prevalence
of human papillomavirus types 16 and 18 in middle ear carcinomas. Int J Cancer 1997; 71: 208–212.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 2
8. Zur Hausen H. Papillomavirus infections – a major cause of
human cancer. Biochim Biophys Acta 1996; 1288: F55–F78.
Adres autora:
ul. Chocimska 60
60-688 Poznaƒ
Prac´ nades∏ano: 7.11.2006 r.
141