trudności w interpretacji wyniku fish dla genu egfr oraz jego wartość

trudności w interpretacji wyniku fish dla genu egfr oraz jego wartość

Nowiny Lekarskie 2009, 78, 5–6, 296–299
KAMILA WOJAS-KRAWCZYK1, PAWEŁ KRAWCZYK1, OLGA JANKOWSKA1, RADOSŁAW MLAK1,
DOROTA KOCZKODAJ2, ELŻBIETA KOROBOWICZ3, JACEK WOJCIEROWSKI2, JANUSZ MILANOWSKI1, 4
TRUDNOŚCI W INTERPRETACJI WYNIKU FISH DLA GENU EGFR
ORAZ JEGO WARTOŚĆ PREDYKCYJNA W TERAPII ERLOTYNIBEM
NIEDROBNOKOMÓRKOWEGO RAKA PŁUCA
DIFFICULTIES IN INTERPRETATION OF FISH RESULTS AND THEIR PREDICTIVE VALUE
IN TKI-TREATMENT OF NON-SMALL CELL LUNG CANCER PATIENTS
1
Katedra i Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
Kierownik Katedry i Kliniki: prof. dr hab. n. med. Janusz Milanowski
2
Katedra i Zakład Genetyki Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
Kierownik Katedry i Zakładu: prof. dr hab. n. med. Jacek Wojcierowski
3
Katedra i Zakład Patomorfologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
Kierownik Katedry i Zakładu: prof. dr hab. n. med. Elżbieta Korobowicz
4
Instytut Medycyny Wsi im. Witolda Chodźki w Lublinie
Kierownik Instytutu: dr n. med. Andrzej Horoch
Streszczenie
Wprowadzenie. Większość guzów niedrobnokomórkowego raka płuc (NDRP) wykazuje nadekspresję receptora dla naskórkowego
czynnika wzrostu (EGFR). Receptor ten jest jednocześnie celem dla terapii inhibitorami kinazy tyrozynowej EGFR (TKI-EGFR).
Cel. Ocena wartości predykcyjnej wyników badania FISH i IHC dla EGFR w terapii drugiej linii pacjentów z NDRP za pomocą
erlotynibu.
Materiał i metody. Materiał tkankowy uzyskano od 22 pacjentów leczonych TKI-EGFR. W przygotowanych preparatach parafinowych wykorzystując technikę FISH oceniono liczbę kopii genu EGFR, natomiast przy użyciu techniki immunohistochemicznej
oceniono ekspresję białka EGFR.
Wyniki. W 8 przypadkach (36,4%) stwierdzono ponad 4 kopie genu EGFR w ponad 40% jąder komórkowych, a negatywny wynik
FISH u 7 chorych (31,8%). W 7 przypadkach preparaty nie nadawały się do oceny FISH z uwagi na destrukcję jąder lub zbyt małą
ich liczbę. Wynik badania FISH nie zależał od rozpoznania histopatologicznego. 7 guzów FISH-pozytywnych (87,5%) oraz 4 FISHnegatywne (57,1%) wykazywało także ekspresję białka EGFR. Odpowiedź na leczenie erlotynibem uzyskano u dwóch chorych
z guzami FISH-pozytywnymi (37,5%) i u jednego z guzem FISH-negatywnym (16,6%) (p = 0,31; χ2 = 1,03). Średni czas życia był
nieistotnie dłuższy u chorych z pozytywnym wynikiem FISH (8 ± 8,5 miesiąca) niż u chorych FISH-negatywnych (4,9 ± 3,5 miesiąca). Spektakularną odpowiedź na leczenie (częściowa remisja – 16 miesięcy) uzyskano jedynie u kobiety z rakiem gruczołowym
i najwyższą liczbą kopii genu EGFR wśród zbadanych tkanek (86% komórek z 4 lub więcej kopiami genu EGFR, amplifikacja genu).
Wnioski. Możliwość uzyskania miarodajnego wyniku FISH jest uzależniona od dostępności nieuszkodzonej tkanki nowotworowej.
Jedynie wysoka amplifikacja genu EGFR wydaje się warunkować dobrą reakcję na leczenie TKI-EGFR.
KEY WORDS: niedrobnokomórkowy rak płuca, erlotynib, EGFR.
Summary
Introduction. EGFR is over expressed in the majority of NSCLC tumours and it is an important target for EGFR tyrosine kinase
inhibitors (TKI-EGFR), e.g. erlotinib and gefitinib.
Aim. We estimated predictive value of results of FISH and IHC examination in second-line treatment of NSCLC patients with erlotinib.
Materials and methods. Paraffin-embedded neoplasm tissue was collected from 22 erlotinib-treated patients. The expression of
EGFR was determined by means of immunohistochemistry. We examined the EGFR gene copy number using fluorescence in situ
hybridization (FISH).
Results. We found that 8 cases (36.4%) were FISH-positive (4 or more EGFR gene copies, Fig. 1A) and 7 cases (31.8%) were FISHnegative. Due to the nucleus destruction or their low number in obtained tissue samples, we couldn’t evaluate the FISH results in
7 cases (31.8%). The FISH result wasn’t related to histopathological diagnosis of patients. 7 cases FISH-positive (87.5%) and 4 cases
FISH-negative (57.1%) had simultaneously expression of EGFR protein. The response to erlotinib-treatment was noted in 2 FISHpositive cases (37.5%) and in 1 FISH-negative case (16.6%) (p = 0.31; χ2 = 1.03). The survival time was insignificantly longer in
FISH-positive patients (8 ± 8.5 mo) than in FISH-negative patients (4.9 ± 3.5 mo). The most impressive response to erlotinibtreatment (partial remission – 16 months) was observed in a female with adenocarcinoma and with the highest number of EGFR gene
copies among all examined tissue samples (4 or more gene copies in 86% of nuclei, EGFR gene amplification).
Conclusions. The representative FISH results are mostly reliant on accessibility of undamaged tumor tissue. The response to TKIEGFR treatment may be determined by the amplification of EGFR gene.
KEY WORDS: non-small cell lung cancer, erlotinib, EGFR.
Trudności w interpretacji wyniku FISH dla genu EGFR oraz jego wartość predykcyjna w terapii erlotynibem …
297
Wprowadzenie
Materiał i metody
Większość guzów niedrobnokomórkowego raka płuca (NDRP) wykazuje nadekspresję receptora dla naskórkowego czynnika wzrostu (ang. epidermal growth factor
receptor – EGFR). Receptor ten jest jednocześnie celem
dla terapii inhibitorami kinazy tyrozynowej EGFR (ang.
tyrozine kinase inhibitor – TKI), takimi jak erlotynib czy
gefitynib. Możliwość uzyskania odpowiedzi na zastosowaną terapię zależy od klinicznych czynników predykcyjnych oraz od wystąpienia nieprawidłowości genetycznych, takich jak mutacje w genie EGFR czy zwiększenie
liczby kopii genu EGFR [1, 2, 3].
W badaniu BR.21 i badaniu TRUST, w których stosowano erlotynib po niepowodzeniu leczenia pierwszej
lub drugiej linii wykazano, że mediana czasu życia chorych z pozytywnym wynikiem badania FISH wynosi
blisko 9 miesięcy, podczas gdy u chorych FISH-negatywnych nie przekracza 7 miesięcy. W obu tych grupach
mediana przeżycia była jednak dłuższa niż u chorych
otrzymujących placebo [3, 4]. W badaniu IPASS wykazano, że w grupie chorych leczonych w I linii gefitynibem czas do progresji oraz odsetek odpowiedzi jest wyższy niż w grupie pacjentów leczonych karboplatyną i paklitakselem, jeżeli wynik badania FISH był pozytywny.
W przypadku negatywnego wyniku FISH takiego efektu
terapii gefitynibem nie odnotowano [2].
Metoda FISH napotyka jednak na duże trudności.
Istnieje problem dostępności do wysokiej klasy mikroskopu fluorescencyjnego, za pomocą którego wykonuje
się badanie. Ponadto preparaty poddawane analizie są
często zniszczone, a liczba jąder komórkowych, w których można jednoznacznie ocenić liczbę kopii genu jest
niewystarczająca do uzyskania miarodajnych wyników.
Dotyczy to zwłaszcza materiału uzyskanego z biopsji
wewnątrzoskrzelowej i biopsji cienkoigłowej. Odsetek
chorych z pozytywnym wynikiem FISH w populacji
kaukaskiej wynosi około 40% i jest znacznie wyższy niż
odsetek odpowiedzi uzyskanych w wyniku terapii TKIEGFR (około 10% chorych). Powielenie liczby kopii
genu EGFR koreluje z ekspresją EGFR na powierzchni
komórki, ale nie zawsze idzie w parze z wystąpieniem
mutacji w genie EGFR [5, 6, 7].
Od 22 pacjentów (średni wiek 60,8 lat) uzyskano następujący materiał tkankowy: 3 wycinki z przerzutowego
węzła chłonnego, 16 wycinków z biopsji wewnątrzoskrzelowej oraz 3 fragmenty guzów pobranych podczas
operacji. Ze wszystkich materiałów przygotowano preparaty parafinowe.
Liczbę kopii genu EGFR oceniono wykorzystując
technikę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z zastosowaniem sondy LSI dual color specyficznej dla genu
EGFR (SpectrumOrange) oraz dla centromeru chromosomu 7 – CEP7 (SpectrumGreen, Vysis). W celu odparafinowania i przygotowania preparatów parafinowych do
wybarwienia specyficzną sondą molekularną, użyto zestawu Paraffin Pretreatment Kit zgodnie z instrukcją producenta (Abbott Molecular Inc, USA). Reakcję FISH
oceniano zliczając ilość czerwonych sygnałów z sondy
dla EGFR oraz ilość zielonych sygnałów z sondy dla
CEP7 w co najmniej 100, nienakładających się jądrach
komórkowych. Obliczono również wskaźnik amplifikacji dla genu EGFR (ilość kopii EGFR/ilość sygnałów
CEP7). Na podstawie wcześniejszych publikacji [6, 7]
zastosowano następującą skalę podziału wyników badania FISH:
1) pacjenci FISH-negatywni – preparaty z ≤ 4 kopiami genu EGFR w > 60% komórek
2) pacjenci FISH-pozytywni – preparaty z wysoką
polisomią (≥ 4 kopie genu EGFR w ≥ 40% komórek) lub preparaty z amplifikacją genu (obecność
klastrów sygnałów z sondy czerwonej, lub wskaźnik amplifikacji ≥ 2, lub ≥ 15 kopii genu EGFR
w ≥ 10% analizowanych komórek).
Ekspresję białka EGFR oceniono wybarwiając preparaty techniką immunohistochemiczną (IHC) opartą
o przeciwciało monoklonalne anty-EGFR (EGFRpharmDx, DAKO). Badania przeprowadzone zostały przez
dwie niezależne osoby.
Cel pracy
Celem pracy była ocena wartości predykcyjnej wyników badania liczby kopii genu EGFR oraz ekspresji
białka EGFR w komórkach NDRP u pacjentów leczonych w drugiej lub trzeciej linii za pomocą erlotynibu.
Uzyskane wyniki badań molekularnych zostały skorelowane z niektórymi wynikami badań klinicznych, jak typ
histologiczny, średni czas życia, czas do progresji i uzyskana odpowiedź na zastosowane leczenie. Ponadto wykazano trudności w przeprowadzeniu badań molekularnych i interpretacji ich wyników.
Wyniki
Ocena wyników badania FISH i IHC
W badanym materiale stwierdzono 11 przypadków raka
gruczołowego (ang. adenocarcinoma – AC), 7 raka płaskonabłonkowego (ang. squamous cell cancer – SCC), 3 przypadki raka wielkokomórkowego (GCC) oraz 1 przypadek
raka niedrobnokomórkowego niskozróżnicowanego.
W badaniu FISH, w 8 przypadkach (36,4%) wykryto
ponad 4 kopie genu EGFR w ponad 40% jąder (5 przypadków AC – 45,5%, 2 SCC – 28,6% oraz 1 GCC).
Pozytywny wynik FISH występował nieistotnie częściej
w raku gruczołowym płuca.
Negatywny wynik FISH stwierdzono u 7 chorych
(31,8%, w tym 2 AC – 18,2%, 4 SCC – 57,1% oraz
1 niskozróżnicowany), nieistotnie częściej w raku płaskonabłonkowym płuca. W 7 przypadkach preparaty nie
nadawały się do oceny FISH z uwagi na destrukcję jąder
298
Kamila Wojas-Krawczyk i inni
lub zbyt małą ich liczbę (wycinki z biopsji wewnątrzoskrzelowej).
Ekspresję receptora dla EGF wykazywały komórki
z 15 guzów NDRP (68%). Siedem guzów FISH-pozytywnych (87,5%) oraz 4 FISH-negatywne (57,1%) wykazywało także ekspresję białka EGFR. Analizę wyników FISH i IHC w zależności od rozpoznania histopatologicznego przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1. Analiza wyników FISH i IHC u chorych z różnym
rozpoznaniem histopatologicznym
Table 1. FISH and IHC results in patients with different histopathological types of NSCLC
Wynik badania
molekularnego
Suma
FISH+
FISH–
FISH nieczytelny
IHC+
IHC–
FISH+/IHC+
FISH+/IHC–
FISH–/IHC+
FISH–/IHC–
FISH nieczytelny/IHC+
FISH nieczytelny/
IHC–
Rozpoznanie histopatologiczne
AC
SCC GCC
Niskozróżnicowany
11
5
2
4
9
2
4
1
2
0
7
2
4
1
4
3
2
0
2
2
3
1
0
2
2
1
1
0
0
0
1
0
1
0
0
1
0
0
0
1
3
0
1
0
1
1
1
0
Wynik badania FISH i IHC a odpowiedź kliniczna
na zastosowane leczenie
Kontrolę choroby w trakcie leczenia erlotynibem
(częściowa remisja lub stabilizacja) uzyskano u dwóch
chorych z guzami FISH-pozytywnymi (37,5%, rak gruczołowy i wielkokomórkowy płuca) i u jednego z guzem
FISH-negatywnym (16,6%, rak płaskonabłonkowy płuca) (p = 0,31; χ2 = 1,03). Uzyskano również 2 odpowiedzi na leczenie u chorych z GCC i AC, u których badanie
FISH było nieczytelne. Mediana i średni całkowity czas
życia były nieistotnie dłuższe u chorych z pozytywnym
wynikiem FISH (8 ± 8,5 miesiąca) niż u chorych FISHnegatywnych (4,9 ± 3,5 miesiąca).
Krótka molekularna charakterystyka pacjentki z odpowiedzią na terapię erlotynibem
Spektakularną odpowiedź na leczenie (częściowa
remisja – 16 miesięcy) uzyskano jedynie u 60-letniej
niepalącej kobiety z rakiem gruczołowym. Stwierdzono
u niej najwyższą liczbę kopii genu EGFR (86% komórek
z 4 lub więcej kopiami genu EGFR, amplifikacja genu)
wśród badanych chorych i bardzo silną reakcją w barwieniu IHC. Preparat do barwienia FISH i IHC uzyskano
w wyniku resekcji klinowej guza płata górnego płuca
lewego. Remisja dotyczyła zmian przerzutowych w obu
płucach oraz w kościach żeber. Czas leczenia erlotyni-
bem wynosił 69 tygodni, całkowity czas życia od rozpoczęcia terapii erlotynibem – 19 miesięcy.
Trudności metodologiczne w trakcie oceny amplifikacji genu EGFR
Nie stwierdziliśmy zależności pomiędzy rozpoznaniem
histopatologicznym a występowaniem nieczytelnego wyniku FISH. Trudności metodologiczne wynikały raczej z bardzo małej liczby jąder komórkowych w preparatach, co
uniemożliwiało wydanie miarodajnego wyniku FISH (poniżej 20 komórek) i pojawiały się w preparatach przygotowanych z wycinków pobranych podczas bronchoskopii.
Molecular Assay in NSCLC Working Group [8] rekomenduje wykonanie badania FISH w minimum 100 jądrach
komórkowych w trzech reprezentatywnych fragmentach
tkanki guza. Ponadto w niektórych preparatach dochodziło
do destrukcji jąder. Ponieważ analizie poddawano materiał
tkankowy zdarzała się również silna fluorescencja tła,
utrudniająca odczyt preparatu.
Wnioski
Występowanie dodatniego wyniku badania FISH
u chorych z różnym rozpoznaniem histopatologicznym
i z różną reakcją na leczenie TKI-EGFR przemawia za
hipotezą, że wartość predykcyjna takiego wyniku ogranicza się do chorych z bardzo wysoką polisomią genu
EGFR [4, 5]. Wynika to prawdopodobnie z faktu braku
pełnej korelacji między powieleniem kopii genu EGFR
a występowaniem mutacji w tym genie. Większość mutacji występuje u chorych FISH pozytywnych z wyraźną
amplifikacją genu EGFR. Natomiast około 30% chorych
z liczbą kopii genu ≤ 4 w 40–50% komórek nowotworowych nie wykazuje mutacji EGFR [8, 9]. W prospektywnym badaniu SATURN, poszukującym czynników
predykcyjnych w terapii erlotynibem, udowodniono
ponadto, że wartość predykcyjna badania FISH jest wyraźna w całej grupie osób leczonych TKI-EGFR. Jeśli
natomiast z analizy statystycznej wyeliminować chorych
z mutacją EGFR, to wartość predykcyjna wyniku FISH
u chorych z dzikim typem genu EGFR zanika. Ponadto
prawdopodobieństwo przeżycia chorych leczonych erlotynibem jest wprawdzie większe w grupie FISHpozytywnej niż FISH-negatywnej, nie mniej w obu grupach wykazano skuteczność erlotynibu w porównaniu do
placebo [9].
W kwalifikacji do leczenia II i III linii za pomocą erlotynibu nie ma wskazań do rutynowego wykonywania badania FISH. Wydaje się również, że wynik badania FISH nie
będzie przydatny w kwalifikacji do I linii leczenia TKIEGFR. Wybór pomiędzy chemioterapią a TKI-EGFR będzie w tym przypadku dokonywany na podstawie potwierdzenia obecności mutacji w genie EGFR i klinicznej predyspozycji do reakcji na leczenie [9].
Przedstawione badania stanowią wstępną analizę i oparte są na niewielkiej grupie chorych, jednakże pozwalają na
wyciągnięcie następujących wniosków:
1. Możliwość uzyskania miarodajnego wyniku FISH
jest uzależniona w dużej mierze od dostępności nieusz-
Trudności w interpretacji wyniku FISH dla genu EGFR oraz jego wartość predykcyjna w terapii erlotynibem …
kodzonej tkanki nowotworowej. W związku z tym 68%
preparatów możliwych do oceny FISH w tej pracy wydaje się wysokim odsetkiem.
2. Wysoka amplifikacja genu EGFR mogła mieć
związek z dobrą reakcję na leczenie TKI EGFR u jednej
z analizowanych pacjentek. W późniejszych analizach
udowodniono jednak, że komórki NDRP u tej chorej
wykazywały obecność delecji w egzonie 19 genu EGFR.
Piśmiennictwo
1. Hirsch F.R., Varella-Garcia M., Cappuzzo F. et al.:
Combination of EGFR gene copy number and protein
expression predicts outcome for advanced non-small-cell
lung cancer patients treated with gefitinib. Ann. Oncol.,
2007, 18(4), 752-760.
2. Mok T., Wu Y.L., Thongprasert S. et al.: Phase III,
randomised, open-label, first-line study of gefitinib (G) vs
carboplatin/ paclitaxel (C/P) in clinically selected patients
(pts) with advanced non-small-cell lung cancer (NSCLC)
(IPASS). Proc. ESMO. 2008, Abstract LBA 2.
3. Tsao M.S., Sakurada A., Cutz J.C. et al.: Erlotinib in lung
cancer – molecular and clinical predictors of outcome. N.
Engl. J. Med, 2006, 355, 133-144.
4. Schneider C.P., Heigener D., Schott von Romer K. et al.:
Epidermal growth factor-related tumor markers and clinical
outcomes with erlotynib in non-small cell lung cancer: an
analysis of patients from German canters in the TRUST
study. J. Thorac. Oncol., 2008, 3, 1446-1453.
299
5. Brugger W., Triller N., Błasinska-Morawiec M. et al.:
Biomarker analyses form the phase III placebo-controlled
SATURN study of maintence erlotynib following first-line
chemotherapy for advanced NSCLC. 2009 ASCO Annual
Meeting. J. Clin. Oncol., 2009, 27, Abstract 15.
6. Capuzzo F.: EGFR FISH versus mutation: different tests,
different end-points. Lung Cancer, 2008, 60, 160-165.
7. Zhang X., Chang A.: Molecular predictors of EGFR-TKI
sensitivity in advanced non-small cell lung cancer. Int. J.
Med. Sci., 2008, 5, 209-217.
8. Eberhard D.A., Giaccone G., Johnson B.E.: Biomarkers of
response to epidermal growth factor receptor inhibitors in
non–small-cell lung cancer working group: standardization
for use in the clinical trial setting. J. Clin. Oncol., 2008, 26,
983-994.
9. Soulieres D.: Is there a relationship between increased EGFR
gene copy numer and the presence of activating EGFR
mutations in advanced NSCLC? 13th World Coneference on
Lung Cancer, 2009, Abstract A3.6.
Adres do korespondencji:
Dr hab. n. med. Paweł Krawczyk
Klinika Pneumonologii, Onkologii i Alergologii
Uniwersytet Medyczny
ul. Jaczewskiego 8
20-954 Lublin
Tel. 81 724 42 93, 81 724 44 31
Fax. 81 724 48 23
e-mail: [email protected], [email protected]