Immunohistologia – odczyny dla antygenów związanych z komórką

MIKROBIOLOGIA
Tabela 17–1. Wybrane techniki immunologiczne
B
Technika
Cel
Przykłady zastosowania klinicznego
Podwójna immunodyfuzja wg
Ouchterlony’ego
Wykrywanie i porównywanie antygenów
i przeciwciał
Wykrywanie antygenów grzybów
Immunofluorescencja
Wykrywanie i lokalizacja antygenu
Wykrywanie antygenów wirusowych w bioptatach
(np. wirusów wścieklizny i opryszczki)
Metoda immunoenzymatyczna EIA
Podobnie jak immunofluorescencja
Podobnie jak immunofluorescencja
Cytometria przepływowa
Analiza antygenów komórkowych w populacji
Ocena zgodności tkankowej – immunofenotypowanie
Odczyn immunoenzymatyczny ELISA
Ocena ilościowa antygenów i przeciwciał
Wykrywanie antygenów wirusowych (np. rotawirusy)
i ocena poziomu przeciwciał (np. anty-HIV)
Western-blot
Wykrywanie przeciwciał swoistych dla różnych
frakcji antygenu
Potwierdzenie obecności przeciwciał w kierunku wirusa
HIV
Odczyn radioimmunologiczny RIA
Podobnie jak ELISA
Podobnie jak ELISA
Odczyn wiązania dopełniacza
Oznaczanie miana swoistych przeciwciał
Oznaczanie przeciwciał przeciwko różnym antygenom
bakterii i grzybów
Odczyn zahamowania hemaglutynacji
Oznaczanie poziomu przeciwciał antywirusowych i serotypów wirusów
Serokonwersja – stwierdzenie świeżej infekcji wirusem
grypy, identyfikacja wirusów grypy
Aglutynacja lateksowa
Identyfikacja i wykrywanie antygenów i przeciwciał
Oznaczanie czynnika reumatoidalnego, antygenów
grzybów, antygenów grupowych paciorkowców
Metoda podwójnej immunodyfuzji Ouchterlony’ego
używana jest natomiast do wyznaczania pokrewieństwa różnych antygenów, co przedstawiono na ryc. 17-1. W technice tej przeciwciało i antygen są umieszczane w oddzielnych
dołkach wyciętych w agarze i mogą wędrować w swoim kierunku, aby połączyć się w kompleks. Widoczna linia precypitacyjna pojawia się w miejscu, w którym stężenie antygenu
i przeciwciała się równoważy. Dzięki wzorowi linii precypitacyjnych metoda może również być użyta do określenia, czy
antygeny są identyczne, czy też mają wspólne tylko niektóre epitopy (są częściowo identyczne) lub są zupełnie różne.
Technika ta jest używana do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom grzybów (np. gatunki Histoplasma, Blastomyces i Coccidioides). W innych metodach immunodyfuzyjnych, antygen może być rozdzielony w agarze z użyciem
elektroforezy, a następnie reagować z przeciwciałem (immunoelektroforeza), może być wciśnięty w agar zawierający
przeciwciała z użyciem elektroforezy (elektroforeza rakietowa), lub antygen i przeciwciało mogą być umieszczone w oddzielnych dołkach naprzeciwko siebie i poruszać się dzięki
elektroforezie w przeciwnych kierunkach (immunoelektroforeza przeciwprądowa).
Immunohistologia – odczyny dla
antygenów związanych z komórką
Antygeny na powierzchni komórki lub w komórce mogą być
wykrywane za pomocą oznaczeń immunofluorescencyjnych
i immunoenzymatycznych (EIA).
W bezpośredniej immunofluorescencji cząsteczka fluorescencyjna jest kowalencyjnie połączona z przeciwciałem
wykrywającym antygen (np. królicze przeciwciała antywirusowe wyznakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)).
W immunofluorescencji pośredniej znakowane fluorescencyjnie jest drugie przeciwciało swoiste względem pierwszego (np. kozie przeciwciało antykrólicze wyznakowane
izotiocyjanianem fluoresceiny). Jest ono używane w celu wykrycia pierwszorzędowego przeciwciała przeciwwirusowego
i zlokalizowania antygenu (ryc. 17-2 i 17-3). W EIA enzym,
taki jak peroksydaza chrzanowa lub fosfataza alkaliczna, jest
przyłączony do przeciwciała. Wykrywanie antygenu polega
na tym, że po połączeniu ze znakowanym enzymem przeciwciałem, dodany substrat przekształca się w barwny związek.
Alternatywnie przeciwciało modyfikowane przez przyłączenie cząsteczki biotyny (witamina H) może być zlokalizowane
przez bardzo swoiste wiązanie cząsteczek awidyny lub streptawidyny. Cząsteczka fluorescencyjna lub enzym dołączony
do awidyny lub streptawidyny pozwala na detekcję. Metody
te są użyteczne w analizie próbek z biopsji tkanek, komórek
krwi i hodowli tkankowych.
Cytometria przepływowa może być używana do analizy
immunofluorescencji komórek w zawiesinie i jest szczególnie
użyteczna w identyfikacji i liczeniu limfocytów (immunofenotypowanie). W cytometrze przepływowym laser używany
jest do wzbudzenia fluorescencji przeciwciał przyłączonych
do komórek i do wyznaczenia rozmiaru komórek na podstawie rozpraszania światła. Komórki przepływają przez laser
z szybkością 5000 komórek na sekundę, a analiza jest przeprowadzana elektronicznie. Sorter komórek aktywowanych
fluorescencyjnie (FACS) jest cytometrem przepływowym,
który może również izolować swoiste subpopulacje komórek
na podstawie ich rozmiarów i fluorescencji w celu tworzenia
hodowli tkankowych.
166
165_172_R17_Mikrobiologia-med.indd 166
2011-09-22 17:41:24