pobierz

Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 2, str. 199–208
PRACA POGLĄDOWA – Review Article
KRZYSZTOF LEWANDOWSKI
Badanie mutacji kinazy tyrozynowej BCR-ABL w przewlekłej
białaczce szpikowej
Mutation study of BCR-ABL tyrosine kinase in patients with chronic
myeloid leukemia
Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego w Poznaniu
Kierownik: Prof. dr hab. med. Mieczysław Komarnicki
STRESZCZENIE
Mutacje onkogenu BCR-ABL u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową mogą prowadzić do
oporności na leczenie inhibitorami kinazy tyrozynowej BCR-ABL. Określenie rodzaju mutacji
onkogenu BCR-ABL daje moŜliwość modyfikacji strategii klinicznej (np. zwiększenie dawki,
zmiana rodzaju stosowanego IKT, podjęcie decyzji odnośnie przeszczepienia allogenicznych
komórek krwiotwórczych), a takŜe pełniejszej oceny związku pomiędzy obecnością defektu z
odpowiedzią kliniczną. Aktualnie stosuje się wiele technik laboratoryjnych pozwalających na
wykrywanie mutacji onkogenu BCR-ABL. NaleŜą do nich bezpośrednie sekwencjonowanie, subklonowanie z następowym sekwencjonowaniem, wysokosprawna chromatografia cieczowa w
warunkach denaturacyjnych (d-HPLC), fluoroscencyjny PCR z PNA clamping, PCR z uŜyciem
allelospecyficznych oligonukleotydów, SEQUENOM Mass Array, elektroforeza na podwójnym
gradiencie gęstości i denaturacyjnym (DG-DGGE) i ostatnio wprowadzona wysokorozdzielcza
analiza krzywych topnienia amplikonów (HRM). Niestety, jak dotąd nie osiągnięto konsensusu
co do metody referencyjnej wykonywania analizy i raportowania uzyskanych wyników. W praktyce jako test skryningowy zaleca się wykonywanie d-HPLC lub DG-DGGE, a w przypadku podejrzenia mutacji onkogenu BCR-ABL test potwierdzenia techniką sekwencjonowania.
SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka szpikowa – Mutacje onkogenu BCR-ABL – Techniki
laboratoryjne
SUMMARY
Mutations of BCR-ABL oncogene in patients with chronic myeloid leukemia may lead to BCRABL tyrosine kinase inhibitors treatment failure. Knowledge about the type of mutations present
allow to modify the treatment strategy (drug dose increase or change, decision about stem cell
transplantation) and to better understand the relation between mutation presence and response to
treatment. Recently, numerous different laboratory techniques are used to detect BCR-ABL oncogene mutations: direct sequencing, subcloning and sequencing, denaturing high-performance liquid chromatography (d-HPLC), PNA-based PCR clamping, allele-specific oligonucleoitide PCR,
SEQUENOM Mass Array, double gradient-denaturing gradient gel electrophoresis (DG-DGGE)
and high resolution genotyping by amplicon melting analysis (HRM). Unfortunately, there is no
consensus about the reference method of mutation detection, screening and data reporting. In
200 K. LEWANDOWSKI
practice, d-HPLC or DG-DGGE as a screening method is used, and when mutation presence is
suspected direct sequencing as a confirmatory test is performed.
KEY WORDS: Chronic myeloid leukemia – BCR-ABL gen mutations – Laboratory techniques
Przewlekłą białaczkę szpikową (PBSz) charakteryzuje obecność specyficznej aberracji genetycznej t(9;22)(q34;q11). Jej obecność skutkuje utworzeniem genu fuzyjnego
BCR-ABL i wysoką komórkową ekspresją kinazy BCR-ABL. Konsekwencją biologiczną wymienionych zaburzeń jest niekontrolowana proliferacja komórek macierzystych szpiku Ph(+) i rozwój objawów chorobowych. Postęp objawów choroby często
jest powiązany z ewolucją klonalną komórek Ph(+), a takŜe z nabywaniem przez
klon(y) białaczkowy(e) dodatkowych aberracji cytogenetycznych. Zjawiska te mogą
prowadzić do zmniejszenia efektywności leczenia PBSz za pomocą specyficznych
inhibitorów kinazy tyrozynowej BCR-ABL (IKT, m.in. imatynib, nilotynib, dasatynib), w tym m.in. do zmniejszenia odsetka uzyskiwanych odpowiedzi hematologicznych, cytogenetycznych, molekularnych, a takŜe skrócenia całkowitego przeŜycia pacjentów [1, 2, 3].
Mechanizm działania poszczególnych IKT róŜni się, co powiązane jest z róŜną ich
skutecznością w poszczególnych sytuacjach klinicznych. I tak, imatynib, lek 1-rzutu w
leczeniu chorych z PBSz, przyłącza się w sposób kompetytywny do miejsca wiązania
ATP na cząsteczce kinazy tyrozynowej BCR-ABL, uniemoŜliwiając przenoszenie
grupy fosforanowej z ATP na tyrozynę białka substratowego. Przyłączenie imatynibu
prowadzi do blokady przekazywania sygnału proliferacyjnego do jądra komórkowego i
apoptozy komórek białaczkowych. Wykazano, Ŝe imatynib łączy się jedynie z nieaktywną, zdefosforylowaną formą kinazy. Nilotynib, lek strukturalnie bardzo podobny do
imatynibu, wiąŜe się swoiście z kieszenią ATP kinazy BCR-ABL w konformacji nieaktywnej i efektywniej niŜ imatynib hamuje jej aktywność biologiczną (IC50 odpowiednio 20–60 nM i 120–470 nM) (4). Badania krystalograficzne kompleksu Nilotynib-Abl wykazały, Ŝe związek ten jest lepiej dopasowany do struktury przestrzennej
kinazy. Dzięki temu jest 10–25 razy silniejszym inhibitorem proliferacji komórek
BaF3 w porównaniu do imatynibu. Okazał się teŜ być skuteczny w przypadku niektórych mutacji opornych na imatynib [5]. Trzeci dostępny na polskim rynku IKT – dasatynib naleŜy do grupy tzw. „podwójnych inhibitorów”, czyli inhibitorów rodziny kinaz
Src. Pomimo słabszych oddziaływań z kieszenią katalityczną kinazy BCR-ABL, dasatynib w porównaniu do imatynibu hamuje jej aktywność juŜ przy stukrotnie niŜszym
stęŜeniu w osoczu. Związek ten wykazuje powinowactwo zarówno do aktywnej jak i
nieaktywnej postaci kinazy. Z wymienionych powodów jest skuteczny u większości
chorych z opornością na inne IKT.
NiemoŜność uzyskania odpowiedzi na leczenie IKT jest określana mianem oporności pierwotnej. W przypadku chorych którzy uzyskali odpowiedź po zastosowaniu IKT
(hematologiczną, cytogenetyczną, molekularną) a następnie ją utracili mówimy o oporności nabytej. Oporność pierwotna występuje niezwykle rzadko przed rozpoczęciem
terapii IKT i moŜe mieć zarówno charakter mutacyjny jak i nie mutacyjny. W przypadku oporności nabytej w około 50% przypadków powodem oporności jest obecność
Badanie mutacji kinazy tyrozynowej BCR-ABL w PBSz
201
mutacji onkogenu BCR-ABL. W pozostałych 40–50% przypadków ze zmniejszoną
wraŜliwością na IKT nie stwierdza się obecności mutacji onkogenu BCR-ABL. Przyczyna oporności w tych przypadkach nie jest w pełni poznana. MoŜliwe, Ŝe u podłoŜa
oporności w tych przypadkach leŜą m.in. nadekspresja COX-2 i MDR-1 [6], niezaleŜna
od BCR-ABL aktywacja Lyn [7] lub aktywacja szlaków sygnałowych poprzez kinazy
SRC [8]. W badaniu GIMEMA Co-operative Group oceniającym 297 chorych z PBSz
opornością stwierdzoną w trakcie leczenia IKT ogólną częstość mutacji określono na
43%. Częstość mutacji onkogenu BCR-ABL była róŜna w zaleŜności od fazy choroby.
I tak, obecność mutacji wykazano u 14% chorych we wczesnej fazie przewlekłej otrzymujących imatynib w 1-linii leczenia oraz aŜ u 83% u chorych z PBSz w okresie przełomu limfoblastycznego. Mutacje genu BCR-ABL dotyczyły częściej chorych z opornością wtórną niŜ pierwotną (57 vs 30%). W badaniu przesiewowym metodą chromatografii cieczowej wysokiej sprawności w warunkach denaturujących przeprowadzonym przez Soverini i wsp. mutacje domen kinazy tyrozynowej obecne były u 23%
chorych z PBSz z utratą odpowiedzi cytogenetycznej w trakcie leczenia IKT [9]. W innym badaniu grupy niemieckiej częstość mutacji BCR-ABL u chorych leczonych imatynibem ze wznową hematologiczną lub cytogenetyczną oceniono odpowiednio na 58
i 44%. Co ciekawe, u Ŝadnego z przedstawianych chorych w tym badaniu nie wykazano obecności mutacji przed rozpoczęciem terapii [10].
Lokalizacja mutacji onkogenu BCR-ABL u chorych z PBSz
Konsekwencje biologiczne substytucji aminokwasowych w obrębie domen kinazy
tyrozynowej są róŜnorodne. Mutacje punktowe w domenie odpowiedzialnej za wiązanie imatynibu, zmieniają jej konformację przestrzenną, utrudniając dostęp i przyłączenie leku [11]. Zmutowana domena kinazy tyrozynowej najczęściej nie traci zdolności
do wiązania cząsteczki ATP. Prowadzi to do zachowania funkcji biologicznych kinazy,
niewygaszania sygnału proliferacyjnego i selekcji klonalnej zmutowanych komórek
Ph(+). Część substytucji aminokwasowych będących wynikiem mutacji punktowych
onkogenu BCR-ABL, zlokalizowana jest poza centrum aktywnym. W celu zrozumienia
ich wpływu na rozwój oporności na imatynib konieczna jest dokładna analiza przestrzennej struktury białka BCR-ABL, procesu autoinhibicji kinazy oraz mechanizmów
prowadzących do jej aktywacji. Strukturę domen kinazy c-ABL w konformacji nieaktywnej i po aktywacji przedstawia Rycina 1.
Dla celów klasyfikacyjnych i lepszego zrozumienia konsekwencji biologicznych
obecności poszczególnych mutacji wyodrębniono 5 grup mutacji onkogenu BCR-ABL
[12]. Do grupy pierwszej naleŜą mutacje genu w obrębie sekwencji kodującej pętlę P
(między 244 i 255 aminokwasem). Region ten jest wysoce konserwatywny i odpowiada za wiązanie cząsteczki ATP. Do najczęstszych substytucji aminokwasowych w tym
obszarze naleŜą: Y253F, G250E, E255K oraz Q252H. Mutacje onkogenu BCR-ABL
prowadzące do substytucji w/w aminokwasów powodują około 100-krotne obniŜenie
wraŜliwości na imatynib i 10-krotne obniŜenie wydajności hamowania proliferacji
komórek in vitro. Obecność wymienionych substytucji aminokwasowych moŜe wywo-
202 K. LEWANDOWSKI
ływać takŜe zmiany konformacyjne w cząsteczce białka, prowadzące do przesunięcia
równowagi w kierunku dominacji postaci aktywnej, która nie jest wiązana przez imatynib.
A
B
N-lobe
Miejsce
wiązania
imatynibu
Pętla
aktywacyjna
C-lobe
Ryc. 1. Struktura domen kinazy c-ABL: A – konformacja nieaktywna, B – konformacja po aktywacji
Druga grupa obejmuje substytucje w regionie, nie mającym wpływu na wiązanie
ATP, ale istotnym dla powstawania wiązań stabilizujących pomiędzy kinazą tyrozynową BCR-ABL a cząsteczką imatynibu. Do tej grupy naleŜą substytucje aminokwasowe T315I i F317L. Tyrozyna w pozycji 315 tworzy wiązanie wodorowe z imatynibem. Zastąpienie tyrozyny izoleucyną, która ma rodnik polarny, uniemoŜliwia powstanie wiązania stabilizującego, co w konsekwencji obniŜa wraŜliwość na lek. Substytucja
F317L powoduje utratę oddziaływania hydrofobowego pomiędzy imatynibem i kinazą.
Z obserwacji klinicznych wynika, Ŝe obecność mutacji T315I oraz mutacji w obrębie
p-loop powiązana jest z szybką progresją objawów choroby.
Trzecia grupa mutacji dotyczy regionu genu kodującego centrum katalityczne kinazy (aminokwasy 351-359). Do najczęstszych substytucji aminokwasowych w tym
regionie naleŜą m.in. M351T, E355G i F359V. M351 uczestniczy w powstawaniu interakcji stabilizującej autoinhibicję kinazy.
Czwartą grupę stanowią substytucje nukleotydowe w obszarze kodującym sekwencję pętli aktywacyjnej (A-loop, activation loop) pomiędzy 381 i 402 aminokwasem.
TakŜe one mogą mieć wpływ na rozwój oporności na imatynib. Są one odpowiedzialne
za „rozwinięcie” pętli aktywacyjnej i przejście enzymu w konformację „otwartą”, czyli
niewraŜliwą na imatynib. NaleŜą do nich zmiany aminokwasowe: H396R, V379I oraz
L387M.
Badanie mutacji kinazy tyrozynowej BCR-ABL w PBSz
203
Ostatnią grupę defektów kinazy BCR-ABL stanowią substytucje aminokwasowe
rozproszone w całej cząsteczce białka. Mechanizm rozwoju oporności w tych przypadkach nie jest do końca poznany. Ich obecność nie ma bezpośredniego wpływu na proces przyłączania cząsteczki leku do kinazy BCR-ABL. Mogą one być jednak przyczyną zmniejszonej wraŜliwości na imatynib. Zwiększenie dawki leku w tych przypadkach zwykle doprowadza do przełamania lekooporności.
Uproszczony podział lokalizacji defektów onkogenu BCR-ABL uwzględnia jedynie
3 grupy: mutacje p-loop (aminokwas 244–343), domeny katalitycznej (aminokwas
351–359) oraz pętli aktywacyjnej (aminokwas 379–486).
Jak dotąd u pacjentów z PBSz zidentyfikowano ponad 70 róŜnych mutacji punktowych onkogenu BCR-ABL prowadzących do 50 substytucji aminokwasowych. Osiemdziesiąt pięć procent dotychczas opisanych mutacji prowadzi jedynie do piętnastu substytucji aminokwasowych, a aŜ w 66% przypadków mamy do czynienia z obecnością
mutacji jedynie w 7 lokalizacjach (G250, Y253, E255, T315, M351, F359, H396). W
tej samej lokalizacji moŜe dochodzić do róŜnych substytucji aminokwasowych (np.
F317C, F317L, czy teŜ F317V). Zjawisko to ma waŜne konsekwencje biologiczne bo
prowadzi do powstania mutantów o róŜnej wraŜliwości na imatynib. Wydaje się, Ŝe
obecność niektórych z mutacji częściej stwierdza się w określonych fazach choroby. I
tak, substytucje w pozycjach M244, L248, F317, H396 i S417 zwykle obecne są w
fazie przewlekłej, a Q252, Y253, E255, T315, E459 i F486 w bardziej zaawansowanych postaciach schorzenia [13].
Podobnie, niektóre z defektów wydają się występować częściej u pacjentów z
opornością pierwotną (M244V, Y253 F/H), M351T/V), a inne u pacjentów z opornością nabytą (np. G250E, E255K/V, T315I, F359V/I) [9]. NaleŜy takŜe jednak podkreślić, Ŝe metodą random mutagenezy in vitro u chorych z PBSz opornych na imatynib
zidentyfikowano około 90 moŜliwych miejsc mutacji onkogenu BCR-ABL [14, 15].
Metody wykrywania mutacji onkogenu BCR-ABL
Ocena obecności mutacji domen kinazy tyrozynowej BCR-ABL u chorych
opornych lub odpowiadających suboptymalnie na leczenie inhibitorami kinaz
tyrozynowych jest niezbędna dla prawidłowej oceny skuteczności prowadzonej terapii.
W 2006 roku opracowano wskazania do wykonywania badania u chorych z PBSz
(Tabela 1) [16].
Wskazówki dotyczące wykonywania badania opublikowano takŜe w języku
polskim [17].
Aktualnie stosuje się wiele technik laboratoryjnych pozwalających na wykrywanie
mutacji onkogenu BCR-ABL. NaleŜą do nich bezpośrednie sekwencjonowanie [18],
subklonowanie z następowym sekwencjonowaniem [19], wysokosprawna chromatografia cieczowa w warunkach denaturacyjnych [20], pyrosekwencjonowanie [21],
fluoroscencyjny PCR z PNA clamping [22], PCR z uŜyciem allelospecyficznych
oligonukleotydów [23, 24], SEQUENOM Mass Array [25] i ostatnio wprowadzona
wysokorozdzielcza analiza krzywych topnienia amplikonów (HRM) [26]. Niestety, jak
204 K. LEWANDOWSKI
dotąd nie osiągnięto konsensusu co do metody referencyjnej wykonywania analizy
i raportowania uzyskanych wyników [16]. Rodzaje technik laboratoryjnych stosowanych w diagnostyce obecności mutacji onkogenu BCR-ABL, ich czułość i specyficzność, a takŜe dostępność przedstawiono w Tabeli 2.
Tabela 1. Proponowane wskazania do badania w kierunku obecności mutacji domen kinazy tyrozynowej
BCR/ABL u chorych na przewlekłą białaczkę szpikową leczonych IKT
Chorzy w fazie akceleracji/przełomu
− w kaŜdym przypadku
− przy niepowodzeniu terapii IKT
− u chorych „odpowiadających” na IKT, u
których potwierdzono wzrost ilości kopii
onkogenu BCR-ABL o 1 log
Chorzy w fazie przewlekłej
– przy nieoptymalnej odpowiedzi na terapię IKT
a) brak CHR po 3 miesiącach
b) brak mCyR po 6 miesiącach
c) brak MCyR po 12 miesiącach
– u kaŜdego chorego z utratą odpowiedzi
– chorych „odpowiadających” na IKT, u
których potwierdzono wzrost ilości kopii
onkogenu BCR-ABL o 1 log
Skróty: IKT – inhibitor kinazy tyrozynowej, CHR – całkowita odpowiedź hematologiczna, mCyR –
mniejsza odpowiedź cytogenetyczna, MCyR – większa odpowiedź cytogenetyczna
Tabela 2. Techniki laboratoryjne stosowane w diagnostyce mutacji punktowych onkogenu BCR-ABL
Technika
Bezpośrednie sekwencjonowanie
Subklonowanie i sekwencjonowanie
d-HPLC, wysokosprawna chromatografia cieczowa w warunkach denaturacyjnych
Pirosekwencjonowanie
Elektroforeza na podwójnym gradiencie gęstości
i denaturacyjnym (double gradient-denaturing
gradient gel electrophoresis, DG-DGGE)
Fluoroscencyjny PCR i PNA clamping
(peptydowe kwasy nukleinowe, peptide nucleic
acids, PNA)
PCR z zastosowaniem allelo-specyficznych
oligonukleotydów (Allele-specific oligonucleotide PCR, ASO-PCR)
Czułość %
15–25
9
0,1–10
Specyficzność
++
+++
++
Dostępność
+++
++
++
5
5
++
++
+
+
0,2
++
+
0,01
++
+
W procesie podejmowania decyzji terapeutycznych u chorych z PBSz leczonych
IKT oprócz oceny ilościowej liczby kopii transkryptu genu BCR-ABL duŜe znaczenie
ma informacja dotycząca obecności i rodzaju mutacji onkogenu BCR-ABL. Z pośród
wymienionych metod dla celów potwierdzenia obecności defektu(ów) najczęściej
stosuje się technikę bezpośredniego sekwencjonowania, której czułość nie jest jednak
zbyt duŜa (Rycina 2).
Okazało się jednak, Ŝe cecha ta nie jest wadą tej metody ale jej zaletą. Decydujące
znaczenie dla przebiegu leczenia ma bowiem obecność mutanta w duŜym mianie.
Większość z wymienionych powyŜej technik, z powodu wyŜszej czułości wykrywa
Badanie mutacji kinazy tyrozynowej BCR-ABL w PBSz
Lokalizacja
mutacji
Wynik
sekwencjonowania
Substytucja
aminokwasowa
M244V
Domena
katalityczna
IC50 dla imatynibu (nM)
Komórkowe - 2000
Biochemiczne - 380
Y253H
Komórkowe - >10000
Biochemiczne - >5000
F317L
Komórkowe- 480
Biochemiczne – 775
M351T
Komórkowe- 930
Biochemiczne – 820
F359I
Komórkowe- bd
Biochemiczne – bd
V379I
Komórkowe- 1630
Biochemiczne – 800
E459K
Komórkowe- bd
Biochemiczne – bd
P-loop
205
Pętla
aktywacyjna
Ryc. 2. Przykłady mutacji w poszczególnych domenach kinazy tyrozynowej BCR-ABL u chorych opornych na leczenie imatynibem. Wyniki własne
Skróty: IC50 – połowa maksymalnego stęŜenia hamującego, bd – brak danych
206 K. LEWANDOWSKI
defekty, których obecność nie ma znaczenia klinicznego (zwykle „niewinny świadek”
ko-segregowany z nie mutacyjnym mechanizmem oporności). Z tego powodu wynik
badania na obecność mutacji ma tylko znaczenie w sytuacji stwierdzenia
korespondujących zmian w ocenie hematologicznej (oporność, progresja), cytogenetycznej (oporność, utrata odpowiedzi), molekularnej (nie uzyskanie większej odpowiedzi molekularnej). Dodatkową korzyścią wynikającą z potwierdzenia obecności
mutacji onkogenu BCR-ABL jest moŜliwość modyfikacji strategii klinicznej (np.
zwiększenie dawki, zmiana rodzaju stosowanego IKT, podjęcie decyzji odnośnie
przeszczepienia allogenicznych komórek krwiotwórczych), a takŜe pełniejszej oceny
związku pomiędzy obecnością defektu z odpowiedzią kliniczną.
Do metod skryningowych, które znalazły zastosowanie w wykrywaniu mutacji
onkogenu BCR-ABL naleŜą m.in. wysokosprawna chromatografia cieczowa w
warunkach denaturacyjnych (dHPLC) oraz technika elektorforezy na podwójnym
gradiencie gęstości i denaturacyjnym (DG-DGGE) [27].
Przykładowe obrazy DG-DGGE tworzących się produktów fragmentu 3' w przypadku obecności róŜnych mutacji oraz typu dzikiego (WT) onkogenu BCR-ABL przedstawiono na Rycinie 3.
Ryc. 3. Technika DG-DGGE. Obrazy tworzących się produktów fragmentu 3' w przypadku obecności
róŜnych mutacji oraz typu dzikiego (WT) onkogenu BCR-ABL. Część A – heterodupleksy produktów
uzyskanych po jednostopniowej amplifikacji, część B – jednorodne produkty uzyskane w wyniku nested
PCR, część C – produkty uzyskane w wyniku nested PCR z następowym tworzeniem heterodupleksów.
Odmienny obraz tworzących się heterodupleksów w przypadku tej samej substytucji aminokwasowej
F317L1 i F317L2 będących wynikiem odmiennych substytucji nukleotydowych (1098 C>A i 1096 T>C,
zgodnie z sekwencją referencyjną X16416). Wyniki własne
Badanie mutacji kinazy tyrozynowej BCR-ABL w PBSz
207
W przypadkach wykazania obecności defektu za pomocą testów skryningowych
zaleca się jednak powtórzenie badania techniką sekwencjonowania. Z uwagi na
stosunkowo wysoki koszt sekwencjonowania oraz nakład pracy wciąŜ jednak
poszukuje się tańszych i szybszych, a przede wszystkim szerzej dostępnych metod
badania mutacji onkogenu BCR-ABL.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
O’Dwyer ME, Mauro MJ, Blasdel C, et al. Clonal evolution and lack of cytogenetic response are
adverse prognostic factors for hematologic relapse of chronic phase CML patients treated with
imatinib mesylate. Blood 2004; 103: 451–55.
Cortes JE, Talpaz M, Giles F, et al. Prognostic significance of cytogenetic clonal evolution in patients
with chronic myelogenous leukemia on imatinib mesylate therapy. Blood 2003; 101: 3794–800.
Schoch C, Haferlach T, Kern W, et al. Occurrence of additional chromosome aberrations in chronic
myeloid leukemia patients treated with imatinib mesylate. Leukemia 2003; 17: 461–63.
Weisberg E, Manley PW, Breitenstein W et al. Characterization of AMN107, a selective inhibitor of
native and mutant Bcr-Abl. Cancer Cell. 2005; 7: 129-34.
von Bubnoff N, Manley PW, Mestan J, Sanger J, Peschel C, Duyster J. Bcr-Abl resistance screening
predicts a limited spectrum of point mutations to be associated with clinical resistance to the Abl
kinase inhibitor nilotinib (AMN107). Blood 2006; 108: 1328-1333.
Kimura S. Second generation Abl kinase inhibitors and novel compounds to eliminate the BcrAbl/T315I clone. Recent Patents Anticancer Drug Discov. 2006; 1: 347-55.
Wu J, Meng F, Lu H, Kong L, Bornmann W, Peng Z, Talpaz M, Donato NJ. Lyn regulates BCR-ABL
and Gab2 tyrosine phosphorylation and c-Cbl protein stability in imatinib resistant chronic myelogenous leukemia cells. Blood. 2008 Jan 30 [Epub ahead of print].
Li S, Li D. Stem cell and kinase activity-independent pathway in resistance of leukaemia to BCRABL kinase inhibitors. J Cell Mol Med. 2007; 11: 1251-62.
Soverini S, Colarossi S, Gnani A, Rosti G, Castagnetti F, Poerio A, Iacobucci I, Amabile M,
Abruzzese E, Orlandi E, Radaelli F, Ciccone F, Tiribelli M, di Lorenzo R, Caracciolo C, Izzo B, Pane
F, Saglio G, Baccarani M, Martinelli G; GIMEMA Working Party on Chronic Myeloid Leukemia.
Contribution of ABL kinase domain mutations to imatinib resistance in different subsets of Philadelphia-positive patients: by the GIMEMA Working Party on Chronic Myeloid Leukemia. Clin Cancer
Res. 2006; 12: 7374-9.
Ernst T, Erben P, Müller MC, Paschka P, Schenk T, Hoffmann J, Kreil S, La Rosée P, Hehlmann R,
Hochhaus A. Dynamics of BCR-ABL mutated clones prior to hematologic or cytogenetic resistance
to imatinib. Haematologica 2008; 93: 186-92.
Gambacorti-Passerini CB, Gunby RH, Pizza R, Galietta A, Rostagno R, Scapozza L. Molecular
mechanisms of resistance to imatinib In Philadelphia-chromosome-positive leukaemias. Lancet
Oncol. 2003: 4: 75-85.
Barańska M, Lewandowski K. Mutacje punktowe onkogenu BCR-ABL prowadzące do zmniejszenia
wraŜliwości na terapię imatinibem. Acta Hemat. Pol. 2005; 38: 303-316.
Apperley JF: Part I: Mechanisms of resistance to imatinib in chronic myeloid leukemia. Lancet Oncol. 2007; 8: 1018–29.
Weisberg, P.W. Manley, S.W. Cowan-Jacob, A. Hochhaus and J.D. Griffin, Second generation inhibitors of BCR-ABL for the treatment of imatinib-resistant chronic myeloid leukaemia, Nat. Rev.
Cancer 2007; 7: 345–356.
Volpe G, Panuzzo C, Ulisciani S, Cilloni D. Imatinib resistance in CML. Cancer Lett. 2009; 274: 1-9.
Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, Branford S, Radich J, Kaeda J, et al. Monitoring CML patients
responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: reviewand recommendations for harmonizing
208 K. LEWANDOWSKI
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 2006; 108: 28–37.
Sacha T, Lewandowski K, Foryciarz K et al. Recommendations for analysis of BCR-ABL tyrosine
kinase domain gene mutations in patients with chronic meylogenous leukemia: experts opinion accepted by Polish Adult Leukemia Group. Acta Haemat. Pol. 2008; 39: 119-123.
Shah NP, Nicoll JM, Nagar B, Gorre ME, Paquette RL, Kuriyan J, Sawyers CL. Multiple BCR-ABL
kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib
(STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2002; 2: 99-102.
Shah NP, Nicoll JM, Nagar B, et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal
resistance to the tyrosine kinase inhibitor Imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic
myeloid leukemia. Cancer Cell. 2002; 2: 117-125.
Deininger MW, McGreevey L, Willis S, Bainbridge TM, Druker BJ, Heinrich MC. Detection of ABL
kinase domain mutations with denaturing high-performance liquid chromatography. Leukemia 2004;
18: 864–71.
Khorashad JS, Anand M, Marin D, Saunders S, Al-Jabary T, Iqbal A, et al. The presence of a BCRABL mutant allele in CML does not always explain clinical resistance to imatinib. Leukemia 2006;
20: 658–63.
Kreuzer KA, le Coutre P, Landt O, Na IK, Schwarz M, Schultheis K, et al. Preexistence and evolution
of imatinib mesylate-resistant clones in chronic myelogenous leukemia detected by a PNA-based
PCR clamping technique. Ann Hematol 2003; 82: 284–96.
Roche-Lestienne C, Soenen-Cornu V, Grardel-Duflos N, La¨ı JL, Philippe N, Facon T, et al. Several
types of mutations of the ABL gene can be found in chronic myeloid leukemia patients resistant to
STI571, and they can pre-exist to the onset of treatment. Blood 2002; 100: 1014–8.
Willis S, Lange T, Demehri S, Otto S, Crossman L, Niederwieser D, et al. High sensitivity detection
of BCR-ABL kinase domain mutation in imatinib-naive patient: correlation with clonal cytogenetic
evolution but not response therapy. Blood 2005; 106: 2128–37.
Vivante A, Amariglio N, Koren-Michowitz M, Ahur-Fabian O, Nagler A, Rechavi G, et al. Highthroughput, sensitive and quantitative assay for the detection of BCR-ABL kinase domain mutations.
Leukemia 2007; 21: 1318–21.
Polakova Machova K, Lopotova T, Klamova H, Moravcova J. High-resolution melt curve analysis:
Initial screening for mutations in BCR-ABL kinase domain. Leuk Res 2008; 32: 1236–1243.
Sorel N, Chazelas F, Brizard A, Chomel JC. Double-gradient denaturing- gel electrophoresis for
mutation screening of the BCR-ABL tyrosine kinase domain in chronic myeloid leukemia patient.
Clin Chem 2005; 51: 1263–1266.
Praca wpłynęła do Redakcji 20.04.2009 r. i została zakwalifikowana do druku 30.04.2009 r.
Adres do korespondencji:
Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego
Uniwersytet Medyczny w Poznaniu
ul. Szamarzewskiego 84
60-569 Poznań