Plakat - Wydział Chemii UW

ENZYMATYCZNA SYNTEZA ZNAKOWANYCH HYDROKSY- I KETOKWASÓW ALIFATYCZNYCH
MAŁGORZATA MAKOWSKA
PRACOWNIA PEPTYDÓW WYDZIAŁU
CHEMII
UNIWERSYTETU WARSZAWSKIEGO
2005/2006
Promotor pracy: prof. dr hab. MARIANNA
KAŃSKA
Opiekun pracy: mgr KATARZYNA SKOWERA
PRZEPROWADZONE BADANIA
BADANA REAKCJA
Badaniami poprzedzającymi syntezę były badania spektrofotometryczne. Ich celem było ustalenie optymalnych warunków reakcji (dobór odpowiedniego buforu, pH, temperatury,
stęŜenia substratów, NADH (lub w przypadku kwasu mlekowego NAD+) oraz aktywności enzymu) w celu uzyskania największych wydajności przeprowadzanych syntez.
Reakcją badaną przeze mnie jest utlenianie kwasu mlekowego do kwasu pirogronowego w obecności enzymu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) oraz reakcja odwrotna, czyli
redukcja kwasu pirogronowego do kwasu mlekowego przy uŜyciu tego samego enzymu. Są to reakcje wieloetapowe. Mechanizm, według którego przebiegają nie jest do końca
poznany, a przede wszystkim nie jest znana struktura kompleksu aktywnego tworzącego się w etapie określającym szybkość reakcji. Mechanizm ten moŜe być zbadany dzięki
badaniom kinetycznym oraz dzięki wyznaczeniu efektów kinetycznych dla związków znakowanych w pozycji α deuterem oraz trytem. Poznanie mechanizmu tej reakcji oraz
ustalenie struktury kompleksu aktywnego jest waŜne chociaŜby ze względu na istotną rolę obydwu kwasów w naszych organizmach. Reakcją badaną przeze mnie jest reakcja
analogiczna do reakcji zachodzącej podczas ograniczonego dostępu tlenu do intensywnie pracujących mięśni. Reakcja odwrotna zachodzi natomiast w wątrobie.
Enzymatyczna synteza szczególnie kwasu mlekowego pozwala uzyskać selektywnie bądź izomer L bądź D, w zaleŜności tego czy uŜyjemy
L-dehydrogenazy
mleczanowej czy teŜ D-dehydrogenazy mleczanowej. Nie musimy stosować wówczas często skomplikowanych metod rozdziału enancjomerów.
OH
ABSTRAKT
Reakcją badaną przeze mnie jest reakcja utleniania kwasu mlekowego do kwasu pirogronowego w obecności enzymu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) oraz reakcja odwrotna,
czyli reakcja redukcji kwasu pirogronowego do kwasu mlekowego przy uŜyciu tego samego enzymu. Są to reakcje wieloetapowe. Mechanizm, według którego przebiegają nie jest
do końca poznany, a przede wszystkim nie jest znana struktura kompleksu aktywnego tworzącego się w etapie określającym szybkość reakcji. Mechanizm ten moŜe być zbadany
dzięki wyznaczeniu efektów kinetycznych dla związków znakowanych w pozycji α deuterem oraz trytem.
Badaniami wstępnymi były badania spektrofotometryczne. Ich celem było ustalenie optymalnych warunków reakcji (dobór odpowiedniego buforu, pH, temperatury, stęŜenia
substratów, NADH - lub w przypadku kwasu mlekowego NAD+ - oraz aktywności enzymu) w celu uzyskania największych wydajności przeprowadzanych syntez.
Kolejnym etapem badań było opracowanie identyfikacji kwasów metodą chromatografii cienkowarstwowej, a następnie znalezienie odpowiedniego układu wymywającego
do wydzielenia kwasów z mieszaniny poreakcyjnej za pomocą chromatografii kolumnowej. Następnym krokiem będzie przeprowadzenie syntezy kwasów mlekowego i
pirogronowego oraz synteza kwasu mlekowego znakowanego w pozycji α deuterem i trytem metodą wymiany izotopowej.
+
H3C
NAD
+
H3C
COOH
NADH
COOH
kwas pirogronowy
kwas mlekowy
SYNTEZY ZNAKOWANE IZOTOPAMI WODORU
O
NADH
O
NADH
skład:
siarczan
hydrazyny,
glicyna, EDTA
pH
8,0
9,5
temperatura
pokojowa
pokojowa
stęŜenie substratu
0,05 – 0,1 mM
0,01 – 0,06 mM
stęŜenie NADH/NAD+
2mM
0,09mM
aktywność enzymu
271 u/mg
271u/mg
Kolejnym krokiem było znalezienie odpowiedniej metody identyfikacji badanych kwasów.
Kwasy identyfikuję za pomocą chromatografii cienkowarstwowej na płytkach silikaŜelowych. Jako układy rozwijające stosuję dwie mieszaniny rozpuszczalników:
- kwas octowy: woda: butanol 1:1:4 (v/v/v) – do identyfikacji kwasów w
roztworze wodnym
- mrówczan butylu: chloroform: kwas mrówkowy 70: 15: 15 (v/v/v) – do
identyfikacji kwasów w rozpuszczalnikach organicznych
Płytki silikaŜelowe wywołuję za pomocą etanolowego roztworu zieleni bromokrezolowej.
METODA WYDZIELANIA KWASÓW PO REAKCJI
+
+
T2O
COOH
fosforanowy
T OH
H3C
kwas pirogronowy
bufor
METODA IDENTYFIKACJI KWASÓW
NAD
COOH
LDH
+
H3C
KWAS
MLEKOWY
+
+
[α −2H]-kwas
mlekowy
kwas pirogronowy
KWAS
PIROGRONOWY
OH
H3C
D2O
COOH
CELE PRACY MAGISTERSKIEJ
1. Synteza kwasu pirogronowego:
Opracowanie metody identyfikacji kwasu pirogronowego
Opracowanie metody wydzielania kwasu pirogronowego
Optymalizacja warunków reakcji utleniania kwasu mlekowego
2. Synteza kwasu mlekowego:
Opracowanie metody identyfikacji kwasu mlekowego
Opracowanie metody wydzielania kwasu mlekowego
Optymalizacja warunków reakcji redukcji kwasu pirogronowego
3. Synteza [R- 2H]- kwasu mlekowego i synteza [R-3H]-kwasu
mlekowego metodą wymiany izotopowej.
D
LDH
+
H3C
WARUNKI
O
LDH
+
WARUNKI SYNTEZY
NAD
COOH
Po przeprowadzeniu syntezy, otrzymany odpowiednio kwas wydzielam z mieszaniny poreakcyjnej za pomocąchromatografi kolumnowej. Jako wypełnienie kolumny stosuję
silikaŜel. Układem wymywającym jest mieszanina rozpuszczalników: mrówczan n-butylu: chloroform: kwas mrówkowy w stosunku objętościowym 70: 15: 15.
[α -3H]-kwas mlekowy
WPŁYW STĘśENIA SUBSTRATU NA SZYBKOŚĆ REAKCJI
BADANIA KINETYCZNE
+
+
kandyzowanie owoców
warzywny
(kwaszenie
ogórków
i
produkcja droŜdŜy
przemysł piekarski (wchodzą w skład zakwasów
chlebowych, uŜywanych przy produkcji pieczywa
Ŝytniego)
przemysł piekarski
blokowanie wirusa HIV
substancja aktywna w peelingach chemicznych
stosowanych w leczeniu fazy zapalnej trądziku,
blizn trądzikowych średniego stopnia, tłustej skóry,
rogowacenia słonecznego oraz brodawek
środki konserwujące, głównie przeciw droŜdŜom i
grzybom E270
łączy się z substancjami toksycznymi tworząc
łatwo rozpuszczalne w wodzie związki, które mogą
zostać wydalone z moczem
przemysł garbarski i tekstylny
Suplement diety – zwiększa wydajność w sportach,
zmniejsza nadwagę
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,05
0,06
c [mol/ml]
0,07
0,08
0,09
0,1
0,11
60
70
c [mol/ml]
WPŁYW ILOŚCI ENZYMU NA SZYBKOŚĆ REAKCJI
0,6
1
0,5
0,4
Wpływ ilości enzymu na szybkość reakcji
katalizowanej przez enzym LDH
0,2
5
10
t [min]
15
10mikroL
30mikroL
50mikroL
70mikroL
90mikroL
110mikroL
Wpływ ilości enzymu na szybkość reakcji
katalizowanej przez enzym LDH
0
20
0
20
40
60
80
t [min]
0,01mM
0,02mM
0,03mM
0,04mM
0,05mM
KWAS MLEKOWY
0,02
100
0,02
0,015
0,01
0,005
0
Zmiana absorbancji NADH w czasie w zaleŜności od
stęŜenia kwasu pirogronowego
Zmiana absorbancji NADH w czasie w zaleŜności od
stęŜenia enzymu
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
5
10mikroL
20mikroL
10
t [min]
30mikroL
40mikroL
15
20
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
KWAS PIROGRONOWY
60mikroL
0,01
0,005
20
40
60
80
100
120
KWAS MLEKOWY
0
10
20
30
40
50
V [mikroL]
KWAS PIROGRONOWY
PODSUMOWANIE
0
5
10
15
t [min]
50mikroL
0,015
0
0
V [mikroL]
A
0,01
0,005
0,04
0,07
0,8
0
dermatologia - kwasy AHA
środki dezynfekcyjne – mydła, środki antywirusowe
0
1
2
1,5
0
przemysł mięsny (produkcja wędlin surowych, np.
metka, salami)
0,015
0,01
dA/dt [1/min]
przemysł
kapusty)
0,015
A
procesy biologiczne (np.: glikoliza, cykl Krebsa,
cykl Corich, glukoneogeneza)
piwowarstwie, winiarstwie, gorzelnictwie
A
procesy biologiczne (np.: glukoneogeneza, cykl
Corich)
przemysł
mleczarski
(produkcja
napojów
mlecznych fermentowanych, ukwaszanie mleka,
śmietanki, dojrzewanie serów)
0,02
0,005
dA/dt [1/min]
KWAS PIROGRONOWY
A
KWAS MLEKOWY
Zmiana absorbancji NAD w czasie w zaleŜności od stęŜenia
kwasu mlekowego
Zmiana absorbancji NAD w czasie w zaleŜności od
ilości LDH
Wpływ stęŜenia kwasu pirogronowego na
szybkość reakcji
0,02
dA/dt
WPŁYW STĘśENIA SUBSTRATU NA PRZEBIEG REAKCJI
ZASTOSOWANIE KWASÓW MLEKOWEGO I PIROGRONOWEGO
dA/dt [1/min]
WPŁYW ILOŚCI ENZYMU NA PRZEBIEG REAKCJI
Wpływ stęŜenia kwasu mlekowego na szybkość
reakcji
0,05 mM
0,06 mM
0,07 mM
0,08 mM
0,09 mM
Przeprowadziłam szereg pomiarów spektrofotometrycznych w celu dobrania odpowiednich warunków reakcji. Następnie na związkach wzorcowych opracowałam metodę
identyfikacji kwasów pirogronowego i mlekowego –
-chromatografia cienkowarstwowa (TLC), z dwoma rodzajami układów rozwijających. Kolejnym krokiem było opracowanie metody wydzielania kwasu mlekowego za pomocą
chromatografi kolumnowej równieŜna związkach wzorcowych. Czystośćwyizolowanych związków była sprawdzana za pomocąchromatografi cienkowarstwowej oraz
spektrofotometrycznie.
20
W następnych etapach mojej syntezy opracuję metodęwydzielenia kwasu pirogronowego z mieszaniny poreakcyjnej za pomocąchromatografi kolumnowej, a następnie
przeprowadzęsyntezy na związkach nieaktywnych. Po tym etapie przystąpię do syntezy kwasu mlekowego znakowanego w pozycji αdeuterem a następnie trytem metodąwymiany
0,1 mM
izotopowej.
BIBLIOGRAFIA:
1. L. Stryer Biochemia
2. Solomon, Berg, Martin, Villee Biologia
3. J. Opieńska – Blauth, H. Kraczkowski, H. Brzuszkiewicz, Zarys chromatografii cienkowarstwowej
4. J Appl microbiol, 2001 Feb, 90 (2) 172-179, Sookkhee, Chulasiri, Prachyabrued,
5. J of AIDS, 2003 Sep 1; 34 (1) 32-36, Polo, Martinez, Madrigal, Gonzalez-Muñoz
6. Lab Invest, Nov, 81 (11), 527-536, Lewis, Haase, Raidel, Russ, Sutliff, Hoit, Samarel
7. Biochemical preparation, L(+)- and L(-)-lactic acid, Myron Brin
9. Appl Microbiol Biotechnol, An enzymatic route to produce pyruvate from lactate, Ma, Xu, Qiu, Zhang, Wang, Wang, Zhang
9. J of Chromat, 124 (1976) 123-126, Hansen
10. L-(+)-Lactate, Determination with Lactate dehydrogenase and NAD, Gutmann, Wahlefeld