Przynależność systematyczna drożdży

OZNACZANIE PRZYNALEŻNOŚCI SYSTEMATYCZNEJ DROŻDŻY
CELEM ĆWICZENIA JEST ZAPOZNANIE SIĘ Z METODYKĄ OZNACZANIA
PRZYNALEŻNOŚCI
SYSTEMATYCZNEJ
DROŻDŻY
NA
PODSTAWIE
WŁAŚCIWOŚCI MOROFOLOGICZNYCH, HODOWLANYCH I FIZJOLOGICZNYCH
ORAZ PRZEPROWADZENIE IDENTYFIKACJI BADANEGO SZCZEPU DO RODZAJU.
ZAKRES ĆWICZENIA
- określenie właściwości morfologicznych badanego szczepu drożdży,
- scharakteryzowanie sposobu rozmnażania wegetatywnego,
- określenie cech hodowlanych przy wzroście na podłożu płynnym i stałym,
- oznaczenie właściwości fizjologicznych badanego szczepu drożdży w zakresie
niezbędnym do określenia rodzaju,
- wpisanie uzyskanych wyników badań do tabeli diagnostycznej i określenie
przynależności badanego szczepu do rodzaju.
INSTRUKCJA
BADANIA MIKROSKOPOWE
I.
Określenie właściwości morfologicznych
1. Przeprowadzić obserwacje mikroskopowe komórek drożdży stosując
preparaty proste z otrzymanej hodowli. Zaobserwować kształt i sposób
ułożenia komórek.
2. Scharakteryzować sposób rozmnażania wegetatywnego (pączkowanie,
podział poprzeczny komórek). Obserwacje prowadzić w hodowlach
kropkowych. W tym celu na dno jałowej płytki Petriego nanieść kilka kropel
jałowej brzeczki. Zawiesinę drożdży przenieść ezą do pierwszej kropli, po
wymieszaniu do następnej, i w ten sposób sporządzić „rozcieńczenia” komórek
w brzeczce. Z dwóch ostatnich „rozcieńczeń” pobrać próbkę do
mikroskopowania. Jeżeli w polu widzenia widoczne są pojedyncze, nieliczne
komórki drożdży to należy następnie wykonać obserwacje w komorze
Lindnera. W tym celu pobrać materiał z wybranego uprzednio „rozcieńczenia”
na szkiełko nakrywkowe i przykleić je przy pomocy pierścienia wazelinowego
do komory Lindnera. Obserwacje mikroskopowe wykonywać co 15 min.
Zaobserwować sposób rozmnażana badanych drożdży.
3. Scharakteryzować sposób tworzenia zarodników. W tym celu drożdże
zaszczepić na powierzchnię słupka podłoża sporulacyjnego wg Gorodkowej.
Inkubację prowadzić w temp. pokojowej przez 7 – 10 dni. Po okresie inkubacji
wykonać obserwacje mikroskopowe materiału pobranego z hodowli.
Zaobserwować ilość, kształt i ułożenie zarodników wytworzonych w
workach (askospory).
II.
Określenie właściwości hodowlanych
1. Wzrost na podłożu płynnym. Wykonać posiew badanego szczepu na
brzeczkę słodową (80Blg) w kolbie stożkowej o poj. 100 cm3 (przy obj.
podłoża 25 cm3). Hodowlę prowadzić w temp. 26 – 280C w ciągu 7 – 14 dni.
Zaobserwować występowanie osadu na dnie podłoża, ocenić obecność
gazu, tworzenie się kożucha, błonki lub pierścienia na powierzchni
podłoża.
2. Wzrost na podłożu stałym. Wykonać posiew badanego szczepu drożdży na
podłoże agarowe z brzeczką umieszczając małą kroplę zawiesiny na środku
powierzchni podłoża. Hodowlę prowadzić przez 24 godz. W temp. 280C a
następnie w temp. pokojowej. W celu zabezpieczenia hodowli przed
wysychaniem podłoża zalepić boki płytki parafilmem. Po inkubacji wykonać
obserwacje makroskopowe kolonii z uwzględnieniem kształtu,
zabarwienia, charakterystyki powierzchni, struktury oraz brzegu kolonii.
III.
-
Określenie właściwości fizjologicznych
1. Określenie zdolności fermentacji cukrów – pozwala na odróżnienie od siebie
poszczególnych gatunków drożdży. Podłożem jest woda drożdżowa z 2%
dodatkiem badanego cukru (np.: glukoza, galaktoza, sacharoza, maltoza,
laktoza) i rurkami Durhama. Jałowe podłoże zaszczepić 0,1 cm3 zawiesiny
drożdży, inkubację prowadzić w 280C przez 48h. Po okresie inkubacji
wykonać obserwacje zmian zaszłych w podłożu. Stwierdzenie zmętnienia
oraz obecności gazu w rurce Durhama świadczy o zdolności badanego
szczepu do fermentacji danego cukru.
2. Określenie zdolności do asymilacji cukrów. Wykonać posiew 1 cm3
zawiesiny komórek badanego szczepu drożdży na dno sterylnej płytki
Petriego. Następnie zalać oziębioną do ok. 400C pożywką agarową. Delikatnie
(ale dokładnie) wymieszać, pozostawić do zastygnięcia. Następnie na
powierzchnię podłoża nanieść krążki z jałowej bibuły filtracyjnej, nasączyć
każdy innym, 10% jałowym roztworem badanego cukrów. Odwrócone
wieczkiem na dół płytki inkubować w temp. 280C w ciągu 2-3 dni. Po okresie
inkubacji wykonać obserwacje wzrostu. Za wynik dodatni doświadczenia
przyjąć obecność wzrostu drożdży wokół krążka bibuły nasyconej
roztworem badanego cukru.
3. Określenie zdolności asymilacji związków azotowych. Zawiesinę drożdży (1
cm3) w jałowej płytce Petriego zalać pożywką agarową o składzie:
woda destylowana,
glukoza - 2%,
KH2PO4 – 0,1%,
MgSO4 – 0,1%.
Po delikatnym wymieszaniu i zestaleniu się pożywki nanieść krążki z bibuły
filtracyjnej, nasączyć każdy roztworem peptonu, NaNO3, (NH4)2SO4,
asparaginy i mocznika. Po hodowli, w miejscach asymilacji danego związku
widoczne są strefy wzrostu drożdży.
4. Określenie zdolności do wytwarzania ureazy. Wykonać posiew 0,1 cm3
zawiesiny komórek badanego szczepu drożdży na podłoże płynne z
mocznikiem i czerwienią fenolową. Hodowle inkubować w temp. 280C w
ciągu 48h. Po okresie inkubacji wykonać obserwacje makroskopowe hodowli.
Za wynik dodatni oznaczenia (wytwarzanie ureazy) uznaje się zmianę
zabarwienia podłoża na kolor karminowoczerwony, spowodowany zmianą
odczynu pH na skutek wytwarzania amoniaku.
5. Określenie zdolności do wytwarzania barwnika. Zdolność do wytwarzania
barwnika określić podczas hodowli badanego szczepu na podłożach stałych,
głównie na podłożu agarowym, na brzeczce. Zaobserwować i opisać
zabarwienie kolonii. Określić rodzaj wytwarzanych barwników.
Drożdże wykazują na ogół zabarwienie kolonii białe lub kremowe. Przy wytwarzaniu
barwników karotenoidowych zabarwienie kolonii może być jasnoczerwone,
karminowoczerwone lub ciemnoczerwone, niekiedy żółte, pomarańczowe lub różowe.
Barwniki te wytwarzane są w procesie biosyntezy adeniny. Wytwarzanie barwników żółtych
związane jest ze zdolnością syntetyzowania ryboflawiny. Czarne zabarwienie kolonii
związane jest z wytwarzaniem barwników melaninowych powstających z udziałem oksydaz
polifenolowych.
OBSERWACJE I WYIKI WYKONNYCH OZNCZEŃ UMIEŚCIC W TABELI 1.
Na podstawie uzyskanych danych określić przynależność systematyczną badanych
drożdży.
Tabela 1.
Właściwości morfologiczne, hodowlane i fizjologiczne wybranych gatunków drożdży.
Rozmnażanie wegetatywne
Pączkowanie Podział
G – glukoza
Ga – galaktoza
L – laktoza
M – maltoza
S – sacharoza
R - rafinoza
Kształt
komórek
Kształt
i Kożuszek
liczba
lub osad
zarodników
Fermentacja cukrów
G Ga L M S R
Asymilacja cukrów Asymilacja
G Ga L M S azotanów
Gatunek
drożdży
Klasa