Ćwiczenia praktyczne: - Biologia grupa 5 @ Lamarr.pl

1. Barwienie przeglądowe
– ogólna struktura mózgu i płatów
wzrokowych Drosophila
Drosophila melanogaster
- barwienie
Richardsona
(1% błękit metylenowy
w 1% boraksie)
Techniki używane w histologii:
►
mikroskopia świetlna i elektronowa
►
technika histologiczna: utrwalanie materiału,
przygotowanie skrawków, przygotowanie komórek in
toto, barwienie, interpretacja skrawków tkankowych.
►
immunohistochemia, hybrydyzacja in situ.
►
nowoczesna histologia: badanie sekwencji białek,
genetyka molekularna i klonowanie komórek w
hodowlach.
Laser Capture Microdissection (LCM)
-izolacja określonego typu komórek lub fragmentów tkanki z preparatów
histologicznych lub cytologicznych.
Izolacja DNA, RNA
Mikromacierze (microarray analysis)
RT-PCR,
Spektrofotometria masowa (MALDI,
itp.)
2D SDS-PAGE (2D elektroforeza)
Immunohistochemia
immunocytochemia
► Zbiór
metod pozwalających na wykrywanie w
tkankach i komórkach (zazwyczaj w preparacie
mikroskopowym) białek za pomocą swoistych dla
nich immunoglobulin, czyli przeciwciał.
► Zlokalizowanie
miejsca przyłączenia do tkanki
przeciwciała wymaga dołączenia do cząsteczki
tego przeciwciała związku chemicznego
widocznego w obrazie mikroskopowym
(fluorochromu: fluoresceina, rodamina; metalu: złoto koloidalne,
ferrytyna zawierająca żelazo; enzymu: peroksydaza, fosfataza
zasadowa)
Przeciwciała
Przeciwciała poliklonalne i monoklonalne
Zlokalizowanie miejsca
przyłączenia do tkanki
przeciwciała wymaga dołączenia do
cząsteczki tego przeciwciała
związku chemicznego widocznego
w obrazie mikroskopowym:
fluorochromu: fluoresceina,
rodamina; metalu: złoto koloidalne,
ferrytyna zawierająca żelazo;
enzymu: peroksydaza, fosfataza
zasadowa
► Metoda
bezpośrednia => znakowane 1º ab
► Metoda
pośrednia => znakowane 2º ab
► Metoda
z kompleksem enzymatycznym
Immunofluorescencja
Metoda badania reakcji antygen-przeciwciało,
z wykorzystaniem fluorochromu.
Wynik reakcji odczytuje się w mikroskopie
fluorescencyjnym (lub używając cytometru przepływowego).
Jest jedną z najczulszych metod
serologicznych.
Ekspresja białek synaptycznych w kartuszu lamina
-pojedyncze barwienie
Podwójne barwienie
GFP
(ang. Green Fluorescent Protein)
- białko zielonej fluorescencji
238 aminokwasy, 29 kDa
21D-Gal4 x UAS-S65T-GFP
GFP zostało odkryte w 1962
przez Osamu Shimomure
.
Aequorea victoria
11 nici o strukturze β, tworzy cylinder =
beczułkę, w którym schowany jest
fluorochrom.
GFP revolution
Douglas Prasher was the first person to realize the potential of GFP as
a tracer molecule. In 1987 he got the idea that sparked the GFP
revolution. He thought that GFP from a jellyfish could be used to
report when a protein was being made in a cell. Proteins are extremely
small and cannot be seen, even under an electron microscope. However
if one could somehow link GFP to a specific protein, for example
hemoglobin, one would be able to see the green fluorescence of the GFP
that is attached to the hemoglobin. It would be a bit like attaching a
light bulb to the hemoglobin molecule.
GFP jest bardzo użytecznym białkiem
w biologii molekularnej komórki.
Zastosowanie GFP jako białka reporterowego, np..:
a)
do badania np. aktywności promotorów lub
wydajności transfekcji komórek.
a)
do tworzenia fuzji z interesującymi nas
białkami (metodami inżynierii genetycznej) co
pozwala na ich łatwą lokalizację w komórce lub
śledzenie zmian tej lokalizacji pod wpływem
określonych czynników.
Transfekcja komórek
Ko-transfekcja siRNA i GFP
►
Using Cellaxess CX3 for
delivery of siRNA to Schwann
cells in a mixed culture with
DRG neurons. The cells were
co-transfected with siRNA
blocking N-cadherin protein
expression and a GFP plasmid.
The picture shows GFP
transfected cells (green), Ncadherin protein expression
between cells (red) and
neurofilament on DRG axons
(blue). Note the high
correlation between decreased
N-cadherin expression and GFP
transfection in Schwann cells.
Data courtesy of Department
of Neuroscience,
Developmental genetics,
Uppsala University, Sweden.
Tkankowo –specyficzna ekspresja
GFP
(ang. Green Fluorescent Protein),
czyli białka zielonej fluorescencji
21D-Gal4 x UAS-S65T-GFP
muszki transgeniczne
Organizmy modelowe:
System GAL4/UAS
GMR/RH1
21D
Apterous
Eaat1
REPO
R1-R6
S65T-GFP
mCD8-GFP
ACT.GFP
L2
T1
GLiA
Szczepy UAS
►
UAS-S65T-GFP (GFP w cytoplazmie)
►
UAS-mCD8-GFP (GFP w błonie komórkowej)
►
UAS-Act5C.T: GFP (GFP znakuje cytoszkielet aktynowy)
Zadanie
GMR/RH1-Gal4 (fotoreceptory)
21D –Gal4 (L2 iterneuron)
Apterous-Gal4 (L3 interneuron)
Eaat1-Gal4 (T1 neuron)
REPO – Gal4 (Glej)
UAS -S65T-GFP (cytoplazma)
UAS- mCD8-GFP (błona kom.)
UAS- ACT.GFP (aktyna)
Dlg
4F3, Cy3
REPO-Gal4 x UAS-S65T-GFP
GFP w innych organizmach
modelowych
GFP i jego pochodne jako markery fluorescencyjne
Hybrydocytochemia
►
Zbiór metod umożliwiających wykrycie i uwidocznienie w komórkach
(przeważnie w preparacie mikroskopowym) ściśle określonych
sekwencji nukleotydów w kwasach nukleinowych, przy użyciu
syntetycznych odcinków tych kwasów (tzw. sond DNA i RNA) o
sekwencji komplementarnej (dopasowanej do wykrywanego
fragmentu), które ulegają hybrydyzacji z wykrywanym odcinkiem
kwasu nukleinowego.
Uwidocznienie miejsca związania sondy w
komórce wymaga jej znakowania:
fluorochromem => obraz widoczny w
mikroskopie fluorescencyjnym
b) izotopem promieniotwórczym =>
uwidocznienie wymaga autoradiografii
a)
Zastosowanie:
Wykrywanie poszczególnych genów lub ich
fragmentów i ustalania ich lokalizacji w chromosomac
lub jądrze interfazowym.
a)
b)
c)
BADANIA:
Ocena ekspresji danego genu (identyfikacja
mRNA)
Wykrywanie obcego materiału genetycznego
w komórce (diagnostyka zakażeń wirusowych)
Diagnostyka genetyczna oraz leczenie i jego
modyfikacja w przypadku chorób
nowotworowych (ocena ilości kopii danego
genu w komórkach nowotworowych –
cytogenetyka onkologiczna)