Dako Liquid DAB+ Substrate Chromogen System Nr kat

Dako
Liquid DAB+ Substrate
Chromogen System
Nr kat. K3467
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Niniejszy system substrat-chromogen jest wysokiej czułości systemem DAB, odpowiednim do stosowania
w metodach barwienia immunohistochemicznego, bazujących na peroksydazie (IHC) oraz hybrydyzacji in situ
(ISH). Po oksydacji, DAB tworzy w miejscu docelowego antygenu lub kwasu nukleinowego zabarwiony na
brązowo produkt końcowy.1
Zobacz teŜ „Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych” lub Instrukcje do systemu
detekcji dla wykonywania odczynów IHC, które zawierają następujące informacje: 1) Zasada przeprowadzenia
odczynu, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie
preparatu, 5) Wykonanie barwienia, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku
barwienia, 9) Ograniczenia metody.
Dostarczony
odczynnik
Nr kat. K3467
Dostarczane są następujące materiały, wystarczające do przygotowania 15 ml roztworu substratuchromogenu. Objętość ta wystarczy do wybarwienia przynajmniej 50 próbek.
Ilość
1x1mL
Opis
DAB Chromogen
3,3'-diaminobenzydina w roztworze chromogenu.
1x15 mL
Substrate Buffer
Bufor imidazol-HCl o pH 7,5 z dodatkiem nadtlenku wodoru i środka przeciwbakteryjnego.
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. DAB chromogen i bufor substratu są wraŜliwe na zanieczyszczenia róŜnymi czynnikami utleniającymi,
takimi jak metale, bakterie, pył i typowe szkło laboratoryjne. Aby uniknąć zanieczyszczenia i konieczności
przedwczesnego wycofania odczynnika z uŜytku, naleŜy unikać naraŜania tych odczynników na kontakt
z potencjalnymi źródłami zanieczyszczenia.
3. Aby uniknąć zanieczyszczenia nigdy nie pipetować DAB chromogen ani buforu substratu bezpośrednio
z butelki. Wlać potrzebną ilość do czystego pojemnika i stamtąd pipetować. Nie wlewać nadmiaru
roztworów z powrotem do głównych pojemników.
4. Nie naleŜy przechowywać składników DAB ani wykonywać barwienia w mocnym oświetleniu, takim jak
bezpośrednie światło słoneczne.
5. Aby uniknąć kontaktu z oczami i skórą, naleŜy uŜywać odpowiedniego osobistego wyposaŜenia
ochronnego.
6. Niewykorzystany odczynnik naleŜy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi.
7. Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie.
Niebezpieczeństwo
DAB Chromogen: 1-5% Biphenyl-3,3’,4,4’-tetrayltetraammonium tetrachloride
H350
MoŜe powodować raka.
H341
Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne.
P201
Przed uŜyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŜności.
P202
Nie uŜywać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków
bezpieczeństwa.
P280
Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować
odzieŜ ochronną.
P308 + P313
W PRZYPADKU naraŜenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc lekarską.
P405
Przechowywać pod zamknięciem.
P501
Zawartość pojemnika jak i pojemnik utylizować zgodnie z lokalnymi, regionalnymi,
narodowymi oraz międzynarodowymi przepisami.
(126062-001)
P04040PL_01/K3467/2015.04 str. 1/3
Przygotowanie
próbek
Przed wykonaniem odczynu IHC naleŜy utrwalić i przetworzyć tkanki. Utrwalenie zabezpiecza przed autolizą
i rozkładem wycinków, utrzymuje antygenowość, zwiększa współczynnik załamania światła przez struktury
tkankowe i zwiększa odporność składników komórek na przetwarzanie. Przetworzenie tkanki polega na
odwodnieniu, usunięciu środków odwadniających, przepojeniu substancją zatapiającą, zatopieniu i wykonaniu
wycinków. Utrwalacze najczęściej stosowane podczas przygotowania tkanek do diagnostyki IHC
przedstawiono w dokumencie „General Instructions for Immunohistochemical Staining” (Ogólne instrukcje
wykonywania odczynów immunohistochemicznych). Są to jednak wyłącznie wytyczne. Optymalna procedura
powinna zostać ustalona i zweryfikowana przez uŜytkownika.
Przygotowanie
odczynników
Dodać 1 kroplę (lub 20 µL) DAB chromogen na mL buforu substratu. UŜyć znajdującej się w zestawie probówki
z miarką do odmierzenia potrzebnej objętości buforu substratu. Dobrze wymieszać i przenieść roztwór za
pomocą znajdującej się w zestawie pipety transferowej. Po uŜyciu dokładnie wypłukać probówkę testową
z miarką i pipetę destylowaną wodą. Przygotowany roztwór roboczy substratów (CHROM) powinien być
przechowywany w ciemności, w temperaturze 2–8 °C, i zu Ŝyty w ciągu 5 dni.
Procedura
W przypadku barwienia IHC oraz ISH, po inkubacji z odczynnikiem HRP, umieścić próbki w łaźni z buforem.
Odciągnąć nadmiar buforu i ostroŜnie wytrzeć preparat wokół próbki.
1. Zatopić preparat w przygotowanym roztworze DAB. Inkubować przez 5–30 minut. W razie potrzeby,
inkubację z DAB Substrate-Chromogen moŜna przeprowadzić w temperaturze wyŜszej niŜ pokojowa.
2. OstroŜnie przepłukać wodą destylowaną.
3. Barwić kontrastowo (jeśli wskazane).
4. Przykryć wodnym środkiem do zatapiania lub środkiem do trwałego zatapiania.
W przypadku metody ze szczeliną kapilarną, przestrzegać następujących zaleceń:
1. Nie ma potrzeby dodawania do systemu substrat-chromogen detergentów obniŜających napięcie
powierzchniowe.
2. Przygotować DAB Substrate-Chromogen przez 20–30 sekund i następnie nanieść roztwór. Przygotować
przynajmniej dwukrotnie przed inkubacją trwającą 5-30 minut.
Wyniki
W przebiegu oznaczenia IHC i ISH powstaje brązowy produkt końcowy reakcji, zlokalizowany w miejscu
docelowego antygenu lub kwasu nukleinowego.
Dla prawidłowej interpretacji, równolegle z odczynami na badanych próbkach, naleŜy wykonywać dodatnie
i ujemne próby kontrolne. Kontrole dodatnie stosuje się jako wskaźniki prawidłowej obróbki i techniki pracy
z preparatami. Kontrole stosuje się w celu oceny odczynu nieswoistego. Jeśli występuje odczyn nieswoisty,
zazwyczaj ma on charakter rozlany.
Ograniczenia metody
Endogenna aktywność peroksydazy lub o podobnym charakterze moŜe występować w białkach zawierających
cząsteczki hemu – np. hemoglobinie, mioglobinie, cytochromach i katalizie – oraz w eozynofilach, będąc
powodem wyników fałszywie dodatnich.2.3 W tkankach utrwalanych w formalinie, aktywność tę moŜna
zahamować inkubując tkankę w 3% nadtlenku wodoru przez 5 minut przed naniesieniem pierwotnego
przeciwciała lub sondy. Rozmazy krwi, szpiku kostnego i zamroŜone skrawki tkankowe mogą być traktowane
z Peroxidase Blocking Reagent (nr kat. S2001). NaleŜy jednak pamiętać, Ŝe procedura nie usuwa
czerwonawobrązowego zabarwienia wywołanego obecnością hemoprotein. MoŜna równieŜ uŜyć roztworu
metanolu z nadtlenkiem wodoru, jakkolwiek w metodzie tej niektóre antygeny mogą ulec denaturacji.
Piśmiennictwo
1. Graham RC, Karnovsky MJ. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the
proximal tubules of mouse kidney: ultra-structural cytochemistry by a new technique. J Histochem
Cytochem 1966; 14:291
2. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J
Histochem Cytochem 1987; 35:213
3. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press.
1990; 46
Przechowywanie
Przechowywać system DAB Substrate-Chromogen w temperaturze 2–8 °C w oryginalnym pojemniku.
Nie ma jednoznacznych oznak niestabilności tych produktów. Dlatego, jednocześnie z badaniem próbek
pochodzących od pacjenta, naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się
problem z zestawem, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
(126062-001)
P04040PL_01/K3467/2015.04 str. 2/3
Wydanie 04/15
(126062-001)
P04040PL_01/K3467/2015.04 str. 3/3