Dako Liquid DAB+ Substrate Chromogen System Nr kat
Transkrypt
Dako Liquid DAB+ Substrate Chromogen System Nr kat
Dako Liquid DAB+ Substrate Chromogen System Nr kat. K3468 Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. Niniejszy system substrat-chromogen jest to system DAB o duŜej czułości, który nadaje się do stosowania w immunohistochemicznych metodach barwienia, opartych na peroksydazie (IHC) oraz w metodach barwienia z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ (ISH). Po utlenieniu, DAB tworzy brązowy produkt końcowy w miejscu docelowego antygenu lub kwasu nukleinowego.1 Zobacz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Materiały wymagane, ale niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody. Dostarczany odczynnik Dostarczane są następujące materiały, wystarczające do przygotowania 110 ml roztworu substrat-chromogen. Objętość jest wystarczająca do barwienia co najmniej 500 próbek. Ilość 1x5 ml Opis Chromogen DAB+ Roztwór chromogenu, 3,3'-diaminobenzydyny 110 ml Bufor substratu Bufor imidazol-HCl, pH 7,5, zawierający nadtlenek wodoru oraz czynnik przeciwbakteryjny. 1x110 ml do barwienia ręcznego 10x11 ml przystosowany do stosowania z aparatem Dako Autostainer Środki ostroŜności 1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych uŜytkowników. 2. Chromogen DAB oraz bufor do substratu są wraŜliwe na zanieczyszczenia róŜnymi czynnikami utleniającymi, takimi jak metale, bakterie, pył i typowe szkło laboratoryjne. Aby uniknąć zanieczyszczenia i konieczności przedwczesnego wycofania odczynnika z uŜytku, naleŜy unikać kontaktu odczynników z wszelkimi potencjalnymi źródłami zanieczyszczenia. 3. Aby uniknąć zanieczyszczenia, nie naleŜy nigdy pobierać pipetą chromogenu DAB lub buforu substratu bezpośrednio z butelek. Wlać potrzebną ilość do czystych pojemników i stamtąd pipetować. Nie wlewać nadmiaru roztworu z powrotem do głównych pojemników. 4. Nie naleŜy przechowywać składników DAB ani wykonywać barwienia w silnym oświetleniu, takim jak bezpośrednie światło słoneczne. 5. Jako zasadę naleŜy przyjąć zakaz pracy z produktem przez osoby w wieku poniŜej 18 lat. UŜytkowników naleŜy starannie poinstruować co do właściwych procedur pracy, niebezpiecznych własności produktu i środków ostroŜności. 6. NaleŜy stosować właściwe wyposaŜenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą bądź oczyma. Niewykorzystany odczynnik naleŜy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i ogólnokrajowymi. 7. Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie. Niebezpieczeństwo Chromogen DAB+: czterochlorek bifenylo-3,3’,4,4’-tetrailotetraamonowy w stęŜeniu 1-5% H350 MoŜe powodować raka. H341 Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne. P201 Przed uŜyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŜności. P202 Nie uŜywać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków bezpieczeństwa. P280 Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŜ ochronną. P308 + P313 W PRZYPADKU naraŜenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc lekarską. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P501 Zawartość pojemnika jak i pojemnik utylizować zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, narodowymi oraz międzynarodowymi przepisami. (126078-001) P04041PL_01/K3468/2015.04 p. 1/2 Przechowywanie System substrat-chromogen DAB naleŜy przechowywać w oryginalnym pojemniku w temperaturze 2–8°C. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności odczynników, dlatego równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów, naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W razie uzyskania nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, jeŜeli podejrzewa się problem z zestawem, naleŜy się skontaktować z działem pomocy technicznej firmy Dako. Przygotowanie odczynnika Dodać 1 kroplę (lub 20 µl) chromogenu DAB na ml buforu substratu. Stosować dostarczoną probówkę z podziałką, aby odmierzyć potrzebną ilość buforu substratu. Dobrze wymieszać i nanieść roztwór stosując dostarczoną pipetę transferową. Po uŜyciu dokładnie wypłukać probówkę z podziałką i pipetę wodą destylowaną. Przygotowany roztwór roboczy substratu (CHROM) naleŜy przechowywać w temperaturze 2–8°C i wykorzysta ć w przeciągu 5 dni. Procedura Do barwienia IHC i ISH, po inkubacji z odczynnikiem HRP, umieścić próbki w kąpieli w buforze. Odciągnąć nadmiar buforu i ostroŜnie wytrzeć preparat wokół próbki. 1. 2. 3. 4. Nakryć próbkę roztworem DAB. Inkubować przez 5–30 minut. W razie potrzeby, inkubację z systemem substrat-chromogen DAB moŜna przeprowadzać w temperaturach wyŜszych niŜ temperatura pokojowa. Delikatnie spłukać wodą destylowaną. W razie potrzeby wykonać barwienie kontrastowe. Przykryć wodnym środkiem do zatapiania lub środkiem do trwałego zatapiania. W przypadku stosowania szkiełek typu capillary gap slide naleŜy przestrzegać poniŜszych zaleceń: 1. 2. Nie ma potrzeby dodawania detergentu do systemu substrat-chromogen w celu zmniejszenia napięcia powierzchniowego. Naciągnąć substrat-chromogen DAB na 20–30 sekund i osuszyć roztwór co najmniej dwa razy przed inkubacją, przez 5–30 minut. Wyniki W procedurach IHC i ISH, system substrat-chromogen DAB daje brązowy końcowy produkt reakcji w miejscu docelowego antygenu lub kwasu nukleinowego. W celu prawidłowej interpretacji, w kaŜdym cyklu barwienia naleŜy uwzględnić kontrolę dodatnią i ujemną. Kontrole dodatnie stosuje się jako wskaźniki prawidłowej obróbki i techniki pracy z preparatami. Kontrole ujemne stosuje się w celu oceny odczynu nieswoistego. Jeśli występuje odczyn nieswoisty, zazwyczaj ma on charakter rozproszony. Ograniczenia Endogenna aktywność peroksydazy lub o podobnym charakterze, występująca w białkach zawierających cząsteczki hemu – np. hemoglobinie, mioglobinie, cytochromach i katalazie oraz w eozynofilach moŜe dawać wyniki fałszywie dodatnie.2,3 W tkankach utrwalonych formaliną tego rodzaju aktywność moŜna zahamować, inkubując tkankę w 3% nadtlenku wodoru przez pięć minut, przed zastosowaniem przeciwciał pierwotnych lub sondy. Rozmazy krwi i szpiku kostnego oraz zamroŜone wycinki tkanek moŜna poddać działaniu odczynnika Peroxidase Blocking Reagent (nr kat. S2001). Ta procedura nie usuwa jednak czerwonawo-brązowego zabarwienia wywołanego obecnością hemoprotein. MoŜna równieŜ stosować roztwór metanolu i nadtlenku wodoru, ale procedura ta moŜe spowodować denaturację niektórych antygenów. Piśmiennictwo 1. Graham RC, Karnovsky MJ. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultra-structural cytochemistry by a new technique. J Histochem Cytochem 1966;14(4):291-302 2. Escribano LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL .Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987;35(2):213-20 3. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press. 1990;46 Wydanie 04/15 (126078-001) P04041PL_01/K3468/2015.04 p. 2/2