Derywatyzacja w spektrometrii masowej [tryb zgodności]

10/1/2012
Derywatyzacja chemicza
Derywatyzacja w chromatografii
gazowej i spektrometrii masowej
Prof. dr hab. Erwin Wąsowicz
Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu
Podstawowe aspekty derywatyzacji
• Stosowana technika derywatyzacji zależy od analizowanych
związków, matrycy, a także metod, które będą stosowane w
dalszym etapie
• Derywatyzacja chemiczna może być prowadzona na etapie
oczyszczania próby lub w czasie jej zagęszczania
Proces prowadzący do powstania nowego związku
chemicznego na skutek modyfikacji chemicznej. Nowe
właściwości powstałego związku pozwolą na jego
oznaczanie technikami chromatograficznymi.
W chromatografii gazowej i spektrometrii masowej jest
zabiegiem ułatwiającym identyfikację analitu i jego
oznaczenie ilościowe.
Klasyfikacja reakcji derywatyzacji na podstawie
natury chemicznej reakcji
1. Reakcja z wytworzeniem pochodnych alkilowych lub
arylowych
2. Reakcja silylacji
3. Reakcja z wytworzeniem pochodnych acylowych
• W analizie GC prowadzona w celu poprawy rozdziału
chromatograficznego (niwelowanie „ogonowania” pików, brak
rozpadu związków), uzyskania większej stabilności termicznej
w porcie nastrzykowym, poprawy detekcji
4. Reakcja wysycania wiązań podwójnych i potrójnych
5. Reakcja z wytworzeniem związków cyklicznych
• W analizie GC/MS ułatwia identyfikację widm masowych
1
10/1/2012
Zalety i wady reakcji derywatyzacji w analizie GC
i GC/MS
Zalety
• wzrost lotności, zmniejszenie
polarności analizowanych
związków (eliminacja grup
polarnych z cząsteczki)
• zniwelowanie termicznej
degradacji próby
• polepszenie rozdziału, redukcja
„ogonowania” pików
• polepszenie efektywności
ekstrakcji z matrycy wodnej
Wady
• zanieczyszczenie próby
czynnikiem
derywatyzującym
• niezamierzone zmiany
chemiczne w składnikach
próby
• wydłużenie czasu analizy
Podstawy reakcji
• Wiele reakcji opartych na wymianie aktywnego wodoru w
analizowanym związku Y-H przede wszystkim w grupach
funkcyjnych –OH, -COOH, -SH, -NH, -CONH
• Y-H + R-X
Y-R + HX
X – grupa aktywna
R – grupa o żądanych właściwościach (np. brak polarności w GC,
właściwości absorpcji światła w HPLC)
• W analizie GC R jest grupą: CH3, C2H5 lub krótko łańcuchową
fluorowaną grupą alkilową w reakcjach alkilacji, Si(CH3)3 w
reakcjach silylacji, COCH3 lub krótko łańcuchową fluorowaną
grupą acylową w reakcjach acylacji
Wybór reakcji derywatyzacji dla związków
zawierających aktywny wodór
Wzrost właściwości nukleofilnych
Wybrane rozpuszczalniki stosowane jako medium w
reakcjach derywatyzacji
ROZPUSZCZALNIK
Reakcja
pierwszego
wyboru
Reakcje
drugiego
wyboru
AMINY
Acylacja
AMIDY
Acylacja
ALKOHOLE
Silylacja
FENOLE
Silylacja
KWASY
Alkilacja
56.29
100
Acetonitryl
81.60
100
Benzen
80.1
0.07
46
0.01
Chloroform
61.15
0.056
Cykloheksan
80.72
0.01
Dimetyloformamid
153
100
Sulfotlenek dimetylu
189
100
101.32
100
Dioksan
Alkilacja
Alkilacja
Acylacja
Acylacja
Silylacja
ROZPUSZCZALNOŚĆ
WODY %
Aceton
Disiarczek węgla
ZWIĄZEK
TEMPERATURA
WRZENIA °C
Octan etylu
76.5
2
Eter etylowy
34.55
1.26
Formamid
210
100
Heksan
68.7
0.01
Pirydyna
115.25
100
66.0
100
Tetrahydrofuran
Wymagania:
brak aktywnych
wodorów
2
10/1/2012
Szkło laboratoryjne do derywatyzacji
Otrzymywanie pochodnych alkilowych i arylowych
• Zastąpienie aktywnych wodorów grupą alkilową lub arylową
• Wykorzystywane do związków z grupami –OH, -COOH, -SH, -NH,
-CONH
Transestryfikacja jako technika otrzymywania
pochodnych alkilowych kwasów i acylowych alkoholi
Mechanizm alkilacji
• Katalizator reakcji – kwasy: HCl, BF3, H2SO4; zasady: CH3OK,
CH3ONa, C4H9ONa
przykład zastosowania BF3 + CH3OH jako czynnika metylującego
3
10/1/2012
Silylacja
• Mechanizm reakcji silylacji
Silylacja
• Łatwość silylacji poszczególnych grup funkcyjnych
– Alkohole > fenole > kwasy karboksylowe > aminy > amidy
• Reaktywność alkoholi
– Pierwszorzędowe > drugorzędowe > trzeciorzędowe
• Tworzenie pochodnych TMS
Wybrane odczynniki do trimetylosilylacji
• Reaktywność amin
– Pierwszorzędowe > drugorzędowe
Wybrane mieszaniny reakcyjne do trimetylosilylacji
Reakcja zachodzi w rozpuszczalnikach nie posiadających aktywnych wodorów
Najczęściej stosowanymi rozpuszczalnikami są:
• dimetyloformamid
• pirydyna
• acetonitryl
4
10/1/2012
Rola wody w procesie silylacji
• Woda reaguje z większością odczynników silylujących jak i
związków derywatyzowanych
• Jeśli związek derywatyzowany ma większe powinowactwo do
wody wymagane są warunki bezwodne
Warunki reakcji silylacji
• Temperatura: 20 – 170°C
• Czas: kilka minut – 12 godzin
• Naważka: nie większa niż kilkaset µg
• Warunki silylacji dla alkoholi, fenoli, kwasów i węglowodanów:
Próba + 0.25mL BSTFA (z 1% TMCS) + 0.5mL DMF
30min, 75°C, ochłodzenie, analiza GC lub GC/MS
W zależności od odczynnika derywatyzującego różne związki mogą powstawać
w reakcji z wodą np. trimetylosilanol w czasie derywatyzacji z BSTFA
Neutralne fragmenty powstające w czasie
fragmentacji pochodnych TMS w czasie analizy GC/MS
• Najczęściej stosowane kolumny: niepolarne SE-30, OV-101,
DB-1, BP-1, HP-1
Widmo masowe 5-TMS kwasu glukonowego
5
10/1/2012
Artefakty powstające w czasie silylacji
Reakcja acylacji
Izomery powstające w czasie trimetylosilylacji β-D-glukopiranozy z wykorzystaniem
BSTFA (1% TMCS) w DMF
Derywatyzacja w celu poprawy procesu
chromatograficznego
1.
Wymiana aktywnego wodoru na niepolarną grupę posiadającą niską
masę poprawiając stabilność termiczną związku
2.
Wymiana aktywnego wodoru w celu poprawy zachowania analitu w
kolumnie chromatograficznej (warunek wszystkie aktywne wodory muszą
być wymienione)
3.
Wzrost masy molowej nie powoduje znacznego wzrostu temperatury
wrzenia
4.
Reakcje kondensacji mogą obniżyć temperaturę wrzenia i poprawić
stabilność termalną analitu
5.
Związki derywatyzujące zawierające halogeny lub pochodne nitrowe
poprawiają detekcję związków przy użyciu detektora wychwytu
elektronów ECD i w spektrometrii mas wykorzystującej negatywną
jonizację chemiczną
Aplikacje reakcji derywatyzacji w celu poprawy
procesu chromatograficznego
• Związki chemiczne, których nie można analizować techniką GC
bez ówczesnej derywatyzacji:
– Mono, di-, tri-sacharydy
– Poliole z więcej niż trzema grupami OH
Np. silylacja i analiza GC myo-inozytolu, czynnik derywatyzujący N,Obis(trimetylosilyl)-trifluoroacetamid (BSTFA) w dimetyloformamidzie
(DMF), temperatura reakcji 76°C, 30min
6
10/1/2012
Analiza GC TMS-myo-inozytolu
Analiza mieszanin wieloskładnikowych
• Analiza materiału roślinnego zawierającego zarówno małe
cząsteczki jak i polimery
• Małe cząsteczki organiczne – kwasy, węglowodany,
aminokwasy
• Zastosowanie derywatyzacji i jednoczesnej ekstrakcji do prób
tytoniu
• Czynnik derywatyzujący BSTFA+TMCS+DMF, temperatura
reakcji 76°C, 20min
Analiza GC – kolumna SPB-5
Analiza GC/MS prób tytoniu
Warunki rozdziału dla zderywatyzowanych prób
• Pochodne alkilowe i arylowe – kolumny polarne: glikol
polietylenowy, metylopolisiloksan z 35%
trifluoropropylpolisiloksan; kolumny niepolarne lub słabo
polarne: 100% dimetylopolisiloksan, dimetylopolisiloksan z 5%
difenylopolisiloksan
• Pochodne silylowe – kolumny niepolarne: dimetylopolisiloksan i
dimetylopolisiloksan w połączeniu z difenylopolisiloksanem
Analiza GC/MS – kolumna DB-5 (60m x 0.25mm x 0.25µm), 50-300°C, gradient 2°C
7
10/1/2012
Reakcja derywatyzacji w GC/MS
Wykorzystywanie reakcji derywatyzacji w celu:
• Kierowanie fragmentacją cząsteczki ułatwiając określenie struktury badanego
związku np. położenie wiązania podwójnego
• Określenia struktury poprzez wprowadzenie stabilnych izotopów np. deuteru
• Podwyższenia intensywności jonu molekularnego i ułatwienia określenia masy
molowej
• Poprawy czułości analizy poprzez powstawanie jonów o dużej intensywności i
wysokiej masie
• Poprawy czułości analizy poprzez wprowadzenie grup silnie wychwytujących
elektrony (negatywna chemiczna jonizacja)
• Poprawy selektywności analizy poprzez wprowadzenie jonów, których
intensywność może być monitorowana
• Poprawy detekcji poprzez wprowadzenie atomów halogenów obniżając poziom
szumów chemicznych
Derywatyzacja w celu poprawy identyfikacji
Derywatyzacja w celu poprawy detekcji w
analizie GC i GC/MS
• Najczęściej stosowana przy detekcji z ECD i MSD (zastosowanie
negatywnej jonizacji chemicznej NCI)
• ECD i NCI-MS – detektory bardzo czułe i selektywne w stosunku
do stabilnych jonów negatywnych
• Czułość ECD 10-13 g/s próby, maksymalna czułość FID 10-11 g/s
próby
• Zastosowanie negatywnej jonizacji chemicznej pozwala
zwiększyć czułość od 100-1000 w porównaniu do jonizacji
elektronami EI+
Identyfikacja dekanolu i jego pochodnej
• Widma masowe wielu związków są podobne
• Niejednoznaczna identyfikacja dotyczy głównie związków
zawierających grupy –OH, -COOH, -NH2, a także łańcuch
alifatyczny dłuższy niż 4-5 atomów węgla – brak wyraźnego jonu
molekularnego, jony fragmentacyjne pasujące do homologów
• Widmo masowe dekanolu – 8 możliwych związków,
prawdopodobieństwo dopasowania (PBM) ≥82% - 1-undekanol,
nonanol, 1-etyl-2-heptylcyklopropan, 3,7-dimetylo-1-okten, 1dodekanol, 3,7-dimetylo-1-oktanol, cyklodekan i ester decylowy
kwasu mrówkowego
• Derywatyzacja – intensywny jon molekularny = łatwiejsza
identyfikacja
8
10/1/2012
Analiza GC/MS – określanie pozycji wiązania
podwójnego
Określanie pozycji wiązania podwójnego
• Utlenianie kwasów z wykorzystaniem OsO4 do glikolu, dalsza
alkilacja lub silylacja glikolu
Ester metylowy kwasu 9,10 – bis(trimetylosilyloksy)-oktadekanowego
Reakcja derywatyzacji związków karbonylowych
z wykorzystaniem PFBOA
Aldoksymy
heksanalu
500000
Analiza GC/MS
oksymów
heksanalu
A
400000
300000
F
F
200000
CH2 O NH2
F
R2
+
100000
C
O
R1
F
F
F
F
0
32.00
32.50
33.00
33.50
34.00
34.50
F
CH2 O N
C
R2
+
CH2 O N
F
C
F
180000
Jon 239 – jon charakterystyczny
dla nasyconych aldehydów
F
H
140000
R1
F
B
F
R2
F
36.00
181
220000
F
35.50
Czas [min]
R1
F
35.00
Jon 181 – pasmo podstawowe,
jon pochodzący z pierścienia
benzenu podstawionego
pięcioma atomami fluoru
F
CH
2
O
N
C
Jon 295 – jon molekularny
oksymu heksanalu
C 5 H 11
100000
F
F
F
239
60000
m/z 181
41
20000
114
69
93
40
Produktami reakcji są aldoksymy o konfiguracji „syn” i „anti”
60
80
100
120
207
161
136
0
140
160
295
267
180
200
220
240
260
280
m/z
9