Przemiany galaktozoaminoglikanów w przebiegu leczonej

&ARM0RZEGL.AUK†
0RZEMIANYGALAKTOZOAMINOGLIKANÌW
WPRZEBIEGULECZONEJTIAMAZOLEMCHOROBY'RAVESAI"ASEDOWA
4HECHANGESOFGALACTOSAMINOGLYCANS
INTHECOURSEOFTHIAMAZOLTREATED'RAVESlDISEASE
+ATARZYNA7INSZ†3ZCZOTKA+RYSTYNA/LCZYK
+ATEDRAI:AKŒAD#HEMII+LINICZNEJI$IAGNOSTYKI,ABORATORYJNEJ
7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Abstract
Choroba Gravesa i Basedowa jest schorzeniem autoimmunologicznym, obejmującym nadczynność tarczycy
i rozrost tego narządu, nierzadko oftalmopatię i/lub obrzęk
przedgoleniowy. Pozatarczycowe objawy choroby Gravesa
i Basedowa związane są prawdopodobnie z lokalnym pobudzeniem fibroblastów, powodującym wzrost biosyntezy
i gromadzenia galaktozoaminoglikanów. Zmiany metabolizmu galaktozoaminoglikanów na poziomie tkankowym
znajdują odzwierciedlenie w profilu tych makrocząsteczek
w surowicy krwi. W niniejszej pracy oceniano wpływ terapii tiamazolem na metabolizm galaktozoaminoglikanów
u osób z chorobą Gravesa i Basedowa. Galaktozoaminoglikany, obok innych typów glikozoaminoglikanów (GAGs),
wyizolowano z surowicy krwi 17 osób zdrowych oraz 15
osób z chorobą Gravesa i Basedowa zarówno przed leczeniem tiamazolem jak i po uzyskaniu u chorych stanu
eutyreozy. Zastosowano wieloetapową ekstrakcję GAGs
oraz proces oczyszczania z wykorzystaniem papainy, roztworu wodorotlenku sodu i chlorku cetylpirydyniowego.
Całkowitą ilość GAGs szacowano poprzez ocenę stężenia kwasów heksuronowych. Wyizolowane GAGs poddano elektroforezie, zarówno przed jak i po zastosowaniu
czynników swoiście depolimeryzujących określone typy
tych związków. Oceny stężenia galaktozoaminoglikanów
dokonano na podstawie densytometrycznej analizy elektroforegramów. Ilościowa ocena galaktozoaminoglikanów
wskazała na znamiennie wysokie stężenie ocenianych makrocząsteczek w surowicy krwi pacjentów zarówno przed
jak i zakończeniu ich leczenia. Stwierdzono ponadto, że
uzyskanie eutyreozy prowadzi do znacznego obniżenia
poziomu galaktozoaminoglikanów w stosunku do wartości
odnotowanej w surowicy krwi nieleczonych osób chorych.
Jednakże, surowicze stężenie galaktozoaminoglikanów
u pacjentów z eutyreozą pozostawało nadal znamiennie
wyższe w stosunku do stężenia tych GAGs w surowicy
osób zdrowych. Wydaje się, że leczenie tiamazolem nadczynności tarczycy w przebiegu choroby Gravesa i Basedowa opóźnia wystąpienie klinicznie jawnej oftalmopatii
i/lub obrzęku przedgoleniowego.
Graves’ disease is an autoimmune thyroid disease, characterized by hyperthyroidism, thyroid hyperplasia and
additionally ophthalmopathy and/or pretibial myxedema.
The pathogenesis of the mentioned extrathyroidal manifestations involves – probably local – fibroblasts activation and increased galactosaminoglycans synthesis and
accumulation. The disturbances of galactosaminoglycan
metabolism at the tissue level is reflected by alterations
of serum galactosaminoglycans. In presented study we
examined whether antithyroid therapy influence metabolic changes of galactosaminoglycans in patients with
Graves’ disease. Galactosaminoglycans and another types
of glycosaminoglycans (GAGs) were isolated from blood
samples of 17 healthy subjects and 15 Graves’ patients
before treatment with thiamazole and after attainment of
euthyreosis. The multistage GAGs extraction and purification based upon papaine hydrolysis, alkali elimination,
as well as cetylpyridium chloride binding was used. Total
amount of GAGs was quantified by the hexuronic acids
assay. The isolated serum GAGs were subjected to electrophoresis, before and after using the agents specifically
eliminating particular GAGs types. Serum concentration
of galactosaminoglycans was calculated on the base of
densitometric analysis of electrophoregrams. The quantitative estimations revealed statistically elevated level of
galactosaminoglycans in the Graves’ disease patients’ serum before and after treatment with thiamazole. The restoration of euthyreosis was accompanied by statistically significant decrease in galactosaminoglycan content versus
pretreatment situation. However, Graves’ patients after
attainment of euthyroid state had serum galactosaminoglycans content still markedly increased as compared to
values observed in healthy subjects.
Słowa kluczowe: choroba Gravesa i Basedowa, galaktozoaminoglikany, tiamazol
Key words: Graves’ disease, galactosaminoglycans, thiamazole
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Wstęp
Choroba Gravesa i Basedowa jest schorzeniem autoimmunologicznym, w przebiegu którego krążące we krwi chorego przeciwciała przeciw receptorom dla TSH, pobudzają
tarczycę do nadmiernej biosyntezy tyroksyny i trijodotyroniny [1-3]. Ze względu na nie poznany w pełni czynnik
etiologiczny choroby Gravesa i Basedowa, nie można zastosować przyczynowego leczenia tego schorzenia [3]. Celem
terapii jest doprowadzenie do stanu eutyreozy, utrzymanie
tego stanu i zapobieganie nawrotom choroby, co osiąga się
stosując tyreostatyki, w tym – tiamazol, a ponadto radiojod
(131J) czy wycięcie tarczycy – strumektomię [4-7]. Tyreostatyki stosuje się zarówno u pacjentów w sytuacji pierwszego
epizodu nadczynności tarczycy jak i u chorych przed podaniem radiojodu lub leczeniem operacyjnym, oraz u chorych z nawrotem nadczynności wymienionego narządu [5,
7]. Podstawowy mechanizm działania tyreostatyków polega
na blokowaniu biosyntezy hormonów tarczycy na poziomie
jodowania reszt tyrozylowych i reakcji sprzęgania jodotyrozyn do jodotyronin. Dodatkowo, niektóre tyreostatyki posiadają zdolność hamowania aktywności 5’-dejodynazy typu
I, ograniczając tym samym ogólnoustrojową konwersję T4
do T3. Wszystkie tyreostatyki gromadzone są w sposób aktywny w tarczycy, osiągając w tym gruczole stężenie immunosupresyjne [6, 7]. Nie wiadomo jednakże czy omawiana
forma terapii nadczynności tarczycy opóźnia wystąpienie
klinicznie jawnych, pozatarczycowych objawów choroby
Gravesa i Basedowa, tj. oftalmopatii i obrzęku przedgoleniowego [8, 9]. Rozwój wymienionych powikłań wiąże się
z naciekaniem tkanek pozagałkowych i przygoleniowych
przez pobudzone fibroblasty, prowadzącym do wzrostu
biosyntezy i gromadzenia heteropolisacharydowych składników macierzy pozakomórkowej – glikozoaminoglikanów
(GAGs) [8-13]. Stwierdzenie ewentualnego wpływu tiamazolu, tyreostatyku stosowanego w leczeniu choroby Gravesa
i Basedowa na metabolizm glikozoaminoglikanów stanowiło cel niniejszej pracy. Zważywszy, że przemiany glikozoaminoglikanów tkankowych znajdują odzwierciedlenie
w profilu tych związków we krwi, dla realizacji nadrzędnego celu pracy przyjęto ilościową ocenę galaktozoaminoglikanów – dominującej klasy GAGs, w surowicy krwi osób
ze świeżo rozpoznaną, dotychczas nie leczoną chorobą Gravesa i Basedowa bez powikłań o charakterze oftalmopatii i/
lub obrzęku przedgoleniowego, oraz w surowicy krwi tych
samych osób, po zakończeniu leczenia i uzyskaniu stanu eutyreozy.
Materiały i metody
Materiał biologiczny
Materiał do badań stanowiła surowica krwi 15 kobiet,
w wieku 26 – 58 lat (średnia wieku 42,6 lat), ze świeżo rozpoznaną chorobą Gravesa i Basedowa, leczonych w Poradni
Chorób Tarczycy Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego w Tychach. Rozpoznanie choroby Gravesa-Basedowa
oparto na podstawie objawów klinicznych oraz wynikach
badań scyntygraficznych i ultrasonograficznych tarczycy.
Klinicznie rozpoznaną chorobę Gravesa-Basedowa potwier-
dzono wynikami oznaczeń stężenia wolnych hormonów tarczycy – fT4 i fT3 oraz stężenia TSH, które przedstawiono
w tabeli 1. Do badań zakwalifikowano chorych, u których
nie stwierdzono oftalmopatii i/lub obrzęku przedgoleniowego. Kryterium wyłączenia z badań było palenie tytoniu,
nadmierne spożywanie alkoholu, choroby układowe i metaboliczne oraz stosowanie jakichkolwiek leków.
Oceny stężenia galaktozoaminoglikanów w surowicy
krwi osób z chorobą Gravesa-Basedowa, dokonano przed
rozpoczęciem leczenia tiamazolem (metizol, Polfa). Lek podawano w dawce wyjściowej 60 mg/24 h. Po 2-4 tygodniach
dawkę dobową redukowano, stosując 30-40 mg leku, zaś od
6-8 tygodnia – 5-15 mg wymienionego terapeutyku. Badania, stanowiące cel pracy, zostały powtórzone u chorych, po
przywróceniu u nich stanu eutyreozy, po co najmniej trzymiesięcznym okresie leczenia, średnio po 4,4 miesiąca od
włączenia tyreostatyku.
Materiał referencyjny do badań stanowiła surowica krwi
17 zdrowych kobiet w wieku porównywalnym do wieku
osób badanych, poddających się rutynowym badaniom okresowym. Rutynowo oznaczane: obraz morfologiczny krwi,
stężenie cholesterolu, glukozy i mocznika we krwi oraz
białka i glukozy w moczu, pozwoliły na wyeliminowanie
osób, u których wartość ocenianych parametrów odbiegała
od wartości referencyjnych.
Na przeprowadzenie badań wyraziła zgodę Komisja
Bioetyczna Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach.
Izolowanie galaktozoaminoglikanów z surowicy krwi
Izolowanie galaktozoaminoglikanów, współtworzących
pulę glikozoaminoglikanów (GAGs), z surowicy krwi przeprowadzono metodą Volpi i wsp. [14]. Próbki surowicy
krwi, zawierającej wolne GAGs, jak również GAGs związane z białkami, poddano niespecyficznej hydrolizie enzymatycznej, stosując papainę, oraz – procesowi β-eliminacji,
tj. rozerwaniu wiązań kowalencyjnych pomiędzy łańcuchami GAGs a cząsteczkami białek, z wykorzystaniem 0,1 N
roztworu wodorotlenku sodu. Z uzyskanych hydrolizatów
wytrącono następnie produkty rozpadu białek, za pomocą
100% (w/v) roztworu kwasu trichlorooctowego. Uzyskane
osady odrzucono, a z supernatantów wytrącono GAGs stosując aceton. Osady GAGs rozpuszczono w 0,5 M roztworze
octanu potasu, a następnie, powtórnie je wytrącono z otrzymanych roztworów, stosując 96% etanol. Precypitaty GAGs
rozpuszczono w wodzie destylowanej, po czym – w celu ich
oczyszczenia, zastosowano reakcję specyficznego kompleksowania tych makrocząsteczek z chlorkiem cetylpirydyniowym (CPC). Kompleksy GAGs-CPC otrzymano poprzez
dodanie do wodnych roztworów GAGs 5% roztworu CPC.
Supernatanty odrzucono, a osady utworzone z GAGs-CPC
płukano 96% etanolem, który nasycono chlorkiem sodu,
w celu usunięcia z nich CPC. Oczyszczone osady GAGs rozpuszczono w wodzie destylowanej, a w uzyskanych roztworach oznaczono stężenie kwasów heksuronowych, będących
miarą ilości GAGs, metodą Blumenkrantz i Asboe-Hansen
[15]. W celu oceny stężenia kwasów heksuronowych, z wodnych roztworów GAGs pobrano po 0,1 ml próbki i dodano
do znajdujących się w łaźni lodowej probówek, zawierających odczynnik boranowy [0,025 M roztwór czteroboranu
&ARM0RZEGL.AUK
sodowego w stężonym kwasie siarkowym]. Jednocześnie
sporządzono próbę odczynnikową (odczynnik boranowy
i woda destylowana) oraz próby wzorcowe (odczynnik boranowy i wzorcowe roztwory D-glukuronolaktonu). Zawartość probówek, po dokładnym wymieszaniu, umieszczono
we wrzącej łaźni wodnej. Następnie, próbki ochłodzono i do
każdej z nich dodano 0,15% (w/v) roztworu metahydroksydifenylu w 0,25% (w/v) roztworze wodorotlenku sodu. Po
ponownym wymieszaniu próbek, odczytano ich absorbancję przy długości fali 524 nm, wobec próby odczynnikowej.
Stężenie kwasów heksuronowych odczytano z krzywej, wykreślonej dla wzorcowych roztworów glukuronolaktonu.
gości octanu celulozy) i natężeniu 1 mA (na 1 cm szerokości octanu celulozy). Po zakończonej elektroforezie, octany
celulozy barwiono przez 2 godz., 0,1% (w/v) roztworem
błękitu alcjanowego, w mieszaninie o składzie: 96% etanol,
woda destylowana, lodowaty kwas octowy (10: 14: 1). Następnie, octany celulozy odbarwiono – roztworem o wyżej
podanym składzie, lecz bez dodatku barwnika.
Identyfikacja galaktozoaminoglikanów
Analiza statystyczna
W celu identyfikacji galaktozoaminoglikanów, wyizolowanych obok innych GAGs z surowicy krwi osób zdrowych
i osób z chorobą Gravesa i Basedowa, próbki poddano depolimeryzacji czynnikiem swoiście degradującym galaktozoaminoglikany, tj. chondroitynazą ABC, po czym – dokonano ich rozdziału elektroforetycznego. Podatność GAGs na
działanie wymienionego enzymu wskazywała jednocześnie
na galaktozoaminoglikanowy typ tych makrocząsteczek.
Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej, obejmującej weryfikację normalności rozkładu danej cechy, testem Shapiro – Wilka, eliminację wyników wątpliwych, testem Q-Dixona, wyznaczenie średnich wartości i odchyleń
standardowych dla danej cechy oraz określenie istotności
różnic średnich wartości danej cechy dla grupy kontrolnej
i grup badanych, testem t-Studenta. Za znamienny statystycznie przyjęto poziom istotności różnic p< 0,05. Obliczenia przeprowadzono za pomocą komputerowego programu
STATISTICA, wersja 6.
Depolimeryzacja galaktozoaminoglikanów chondroitynazą
ABC
Oszacowanie ilościowe galaktozoaminoglikanów
Rozdzielone elektroforetycznie glikozoaminoglikanowe
frakcje oszacowano ilościowo metodą densytometryczną.
Wyniki
Chondroitynaza ABC [E.C.4.2.2.4.] jest liazą bakteryjną, rozbijającą wiązanie glikozydowe typu β(1→4), między
resztami N-acetylogalaktozoaminy i kwasu heksuronowego,
w obrębie łańcuchów galaktozoaminoglikanów.
Degradację łańcuchów glikanowych chondroitynazą
ABC prowadzono w 50 mM buforze Tris-HCl o pH 8,0.
W celu całkowitej depolimeryzacji związków podatnych
na trawienie omawianą liazą, użyto enzymu o aktywności
0,01 j.m. Próbki, w ilości 8 μg kwasów heksuronowych, inkubowano z chondroitynazą ABC przez 24 godz., w temp.
37 °C. Reakcję enzymatyczną przerwano przez ogrzanie
reagentów do 100 °C, a zdenaturowane białka enzymatyczne odwirowano (25000×g, 20 min., temp. 4 °C). Glikozoaminoglikany po zakończonej depolimeryzacji chondroitynazą ABC precypitowano, dodając do próbki trzykrotny
nadmiar 96% etanolu i pozostawiając na 24 godz., w temp.
4 °C. Otrzymane, po odwirowaniu (25000×g, 20 min., 4 °C),
osady GAGs, poddano rozdziałowi elektroforetycznemu na
octanach celulozy.
Rozdział elektroforetyczny glikozoaminoglikanów
Wyizolowane i oczyszczone próbki glikozoaminoglikanów surowicy krwi osób zdrowych oraz osób z chorobą
Gravesa i Basedowa zostały poddane rozdziałowi elektroforetycznemu na octanach celulozy, w 0,017 M roztworze
siarczanu glinu, o pH 2,6. Rozdział elektroforetyczny GAGs
wykonano zarówno przed, jak i po zastosowaniu depolimeryzacji galaktozoaminoglikanów, zgodnie z opracowaną
przez nas metodą [16].
Rozdział elektroforetyczny próbek GAGs, w ilości 8
μg kwasów heksuronowych, prowadzono przez 120 min.,
w temp. 20 °C, stosując prąd o napięciu 5 V (na 1 cm dłu-
Wyniki oznaczeń całkowitego stężenia glikozoaminoglikanów oraz stężenia galaktoaoaminoglikanów w surowicy krwi osób wszystkich badanych grup, przedstawiono
w tabeli 1.
Stwierdzono, że w surowicy krwi osób z nie leczoną chorobą Gravesa i Basedowa, oraz tych samych osób po uzyskaniu u nich stanu eutyreozy glikozoaminoglikany występują
w stężeniach znamiennie wyższych w stosunku do wartości
stężeń GAGs surowicy krwi osób zdrowych. Wzrost stężenia ocenianych heteropolisacharydów w surowicy krwi osób
z nie leczoną chorobą Gravesa i Basedowa osiągnął wartość
rzędu 83%, a w grupie osób z chorobą Gravesa i Basedowa
– po uzyskaniu u nich stanu eutyreozy – 19%, w stosunku do wartości stężenia GAGs, stwierdzonego w surowicy
krwi osób zdrowych. Przeprowadzona ilościowa ocena galaktozoaminoglikanów surowicy krwi wykazała, że zmiany
całkowitego poziomu GAGs wynikają ze zmian ilościowych jakim podlegają galaktozoaminoglikany w przebiegu
choroby Gravesa i Basedowa. W surowicy krwi osób z nie
leczoną hipertyreozą stwierdzono bowiem znamienny statystycznie wzrost stężenia tych związków, w stosunku do
stężenia występującego w surowicy krwi osób zdrowych.
Wartość stężenia galaktozoaminoglikanów surowicy krwi
osób chorych z hipertyreozą stanowiła 150% wartości stężenia stwierdzonego u osób zdrowych. Wykazano ponadto,
iż wyrównanie stanu tyreometabolicznego osób z chorobą
Gravesa i Basedowa, będące wynikiem leczenia tiamazolem, przyczynia się do znamiennego obniżenia, jednakże nie
do normalizacji, stężenia tych glikanów w surowicy krwi.
U osób z eutyreozą wartości stężeń galaktozoaminoglikanów były nadal znamiennie wyższe od wartości stwierdzonych w surowicy krwi osób zdrowych.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Tab. I. Laboratoryjne wskaźniki funkcji tarczycy oraz zawartość glikozoaminoglikanów całkowitych i galaktozoaminoglikanów w surowicy krwi osób zdrowych – [1], osób z chorobą Gravesa i Basedowa – przed rozpoczęciem leczenia [2] oraz osób
z chorobą Gravesa i Basedowa po uzyskaniu eutyreozy [3]. NS- nieznamienny statystycznie
GRUPA OSÓB BADANYCH
fT4
[pmol/L]
fT3
[pmol/L]
TSH
[mU/L]
GLIKOZOAMINOGLIKANY
CAŁKOWITE
[mg kwasów
heksuronowych
/L surowicy krwi]
17.588± 3.502
4.076 ± 1.286
2.554 ± 0.710
11.158 ± 2.366
10.428 ± 2.223
GALAKTOZOAMINOGLIKANY
[mg kwasów
heksuronowych
/L surowicy krwi]
1
OSOBY ZDROWE
N = 17
2
OSOBY Z CHOROBĄ GRAVESA
I BASEDOWA
PRZED LECZENIEM
N = 15
55.396 ±19.945 23.676 ± 13.460 0.145 ± 0.071
20.446 ± 5.863
15.346 ± 4.591
3
OSOBY Z CHOROBĄ GRAVESA
I BASEDOWA PO
PRZYWRÓCENIU
EUTYREOZY
N = 15
15.472 ± 5.622
13.339 ± 3.375
12.746 ± 3.357
3.559 ± 1.788
0.841 ± 0.676
ZNAMIENNOŚĆ STATYSTYCZNA RÓŻNIC
1–2
1–3
2–3
p < 0.001
NS
p < 0.001
p < 0.001
NS
p < 0.001
p < 0.001
p < 0.001
p < 0.001
p < 0.001
p < 0.05
p < 0.01
p < 0.001
p < 0.05
p < 0.05
GAGs całkowite [%]
Ocena siły prostoliniowej zależności
pomiędzy
stężeniem galaktozoamino100
glikanów surowicy krwi osób wszyst90
kich badanych grup a stwierdzonymi
we krwi tych osób stężeniami TSH, fT3
80
i fT4, wskazała na słabą współzależność
70
pomiędzy wymienionymi zmiennymi.
60
Związki te, w postaci wykresów rozrzutu, przedstawiono na rycinach 2, 3,
50
4. Należy jednak zaznaczyć, że w przy40
padku osób ze świeżo rozpoznaną chorobą Gravesa i Basedowa, wymienione
30
zależności są wyższe niż w przypadku
20
osób pozostałych grup. I tak, ujemną
10
współzależność, opisaną współczynnikiem korelacji Pearsona r = - 0.352,
0
wykazano pomiędzy stężeniem galak1
2
3
Ryc. 1. Udział galaktozoaminoglikanów (kolor czerwony) w całkowitej puli gli- tozoaminoglikanów a stężeniem TSH,
kozoaminoglikanów (kolor niebieski) surowicy krwi osób zdrowych [1], osób zaś wzajemne zależności pomiędzy
z chorobą Gravesa i Basedowa przed leczeniem [2] oraz osób z chorobą Gravesa stężeniem ocenianych glikanów a stężeniami fT3 i fT4 opisywały współczyni Basedowa po uzyskaniu eutyreozy [3].
niki korelacji wynoszące odpowiednio
r = 0.356 oraz r = 0.327.
W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono ponadto, że galaktozoaminoglikany stanowiły około 93% Dyskusja
całkowitej puli glikozoaminoglikanów surowicy krwi osób
Galaktozoaminoglikany, współtworzące rodzinę nierozzdrowych, podczas gdy procentowy udział ocenianych
związków w surowicy krwi osób z nieleczoną chorobą Gra- gałęzionych heteropolisacharydów – glikozoaminoglikanów,
vesa i Basedowa był znamiennie mniejszy i wynosił 75%. są szeroko rozpowszechnione w tkankach, gdzie występują
Natomiast, w surowicy krwi pacjentów z eutyreozą, przy- w formie proteoglikanów (PGs) [16, 17]. PGs zbudowane
wróconą w wyniku leczenia tiamazolem, galaktozoami- są z zajmującego centralne położenie łańcucha białkowego,
noglikany stanowiły 96% całkowitej puli GAGs. Udział stanowiącego rdzeń cząsteczki, do którego przyłączone są
galaktozoaminoglikanów w całkowitej puli GAGs surowicy oligosacharydy, oraz zmienna liczba (od 1 do 100 i więcej)
krwi osób wszystkich badanych grup zilustrowano graficz- heteropolisacharydowych łańcuchów – glikozoaminoglikanów (GAGs) [17, 18]. Makrocząsteczki te spotyka się przede
nie na rycinie 1.
&ARM0RZEGL.AUK
0,3
4
3,5
0,25
TSH [mU/L]
TSH [mU/L]
3
2,5
2
1,5
1
y = 0,1089x + 1,4176
0,5
0,2
0,15
0,1
y = -0,0054x + 0,2287
0,05
2
2
R = 0,1164
0
0
5
10
R = 0,1239
0
0
15
5
60
6
50
5
fT3 [pmol/L]
fT3 [pmol/L]
7
4
3
2
y = 0,0686x + 3,3612
0
5
10
20
y = 1,0449x + 7,6357
2
R = 0,1269
0
0
15
5
fT4 [pmol/L]
fT4 [pmol/L]
20
15
10
y = 0,2929x + 14,534
2
R = 0,0345
0
5
10
10
15
20
25
Galaktozoaminoglikany
[mg kwasów heksuronowych/ L]
25
0
25
30
Galaktozoaminoglikany
[mg kwasów heksuronowych/ L]
5
20
40
10
2
R = 0,0141
0
15
Galaktozoaminoglikany
[mg kwasów heksuronowych/ L]
Galaktozoaminoglikany
[mg kwasów heksuronowych/ L]
1
10
15
Galaktozoaminoglikany
[mg kwasów heksuronowych/ L]
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
y = 1,4205x + 33,598
2
R = 0,1069
0
5
10
15
20
25
Galaktozoaminoglikany
[mg kwasów heksuronowych/ L]
Ryc. 2. Zależność pomiędzy stężeniem galaktozoaminoglikanów a wartościami stężeń TSH [A], fT3 [B] oraz fT4 [C]
w surowicy krwi osób zdrowych.
Ryc. 3. Zależność pomiędzy stężeniem galaktozoaminoglikanów a wartościami stężeń TSH [A], fT3 [B] oraz fT4
[C] w surowicy krwi nie leczonych osób z chorobą Gravesa
i Basedowa.
wszystkim w macierzy pozakomórkowej, lecz także – we
wnętrzu komórek i na ich powierzchni. I tak, glikoproteiny
współtworzone przez łańcuchy galaktozoaminoglikanowe
szczególnie obficie występują w chrząstkach i krążkach
międzykręgowych, kościach, ścięgnach, skórze, ścianach
naczyń krwionośnych oraz pępowinie [17-19]. Wolne łańcuchy galaktozoaminoglikanów jak i te połączone kowalencyjnie z fragmentami białek rdzeniowych, a powstałe
w wyniku pozakomórkowej degradacji PGs, obecne są także
we krwi [16, 20]. Galaktozoaminoglikany wykazują właściwości antykoagulacyjne, przeciwzapalne, antyaterogenne,
a jako składowe PGs, odpowiadają za organizację struktury
macierzy pozakomórkowej, warunkując jej stopień uwodnienia, spoistość i elastyczność [18, 19]. Stąd też, galaktozoaminoglikany jako podstawowe komponenty macierzy pozakomórkowej, uczestniczą w utrzymywaniu integralności
ustroju, a zmiany ich metabolizmu wpisują się w łańcuch
zmian leżacych u podstaw licznych chorób, w tym choro-
by Gravesa-Basedowa. Dowiedziono, że gromadzenie się
glikozoaminoglikanów w macierzy pozakomórkowej tkanek
pozagałkowych i tkanek okolic przedgoleniowych, prowadzi
do wystąpienia pozatarczycowych objawów choroby GravesaBasedowa, tj. oftalmopatii i obrzęku przedgoleniowego [8-13].
Zawartość glikanów wzrasta w zmienionych chorobowo tkankach pozatarczycowych, proporcjonalnie do stopnia ciężkości
oraz czasu trwania nadczynności gruczołu tarczowego [11, 13].
Wyniki badań, otrzymane w ramach niniejszej pracy dowodzą,
iż do zmian metabolizmu galaktozoaminoglikanów dochodzi
już we wczesnych stadiach choroby, jeszcze przed wystąpieniem klinicznie jawnej oftalmopatii i/lub obrzęku przedgoleniowego. Wykazaliśmy bowiem wzrost stężenia tych makrocząsteczek we krwi pacjentów z chorobą Gravesa i Basedowa,
nie powikłaną zmianami w obrębie tkanek pozagałkowych
i/lub przedgoleniowych. Należy zaznaczyć, że przemiany
tkankowych galaktozoaminoglikanów znajdują odzwierciedlenie w profilu tych związków we krwi [16, 20].
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
35
4
3,5
TSH [mU/L]
3
2,5
2
1,5
1
y = 0,1089x + 1,4176
0,5
2
R = 0,1164
0
0
5
10
15
Galaktozoaminoglikany
[mg kwasów heksuronowych/ L]
8
7
fT3 [pmol/L]
6
5
4
3
2
y = 0,1286x + 1,9206
1
2
R = 0,0582
0
0
5
10
15
20
25
Galaktozoaminoglikany
[mg kwasów heksuronowych/ L]
30
fT4 [pmol/L]
25
20
15
10
5
y = 0,2061x + 12,845
2
R = 0,0151
0
0
5
10
15
20
25
Galaktozoaminoglikany
[mg kwasów heksuronowych/ L]
Ryc. 4. Zależność pomiędzy stężeniem galaktozoaminoglikanów a wartościami stężeń TSH [A], fT3 [B] oraz fT4 [C]
w surowicy krwi osób z chorobą Gravesa i Basedowa po
przywróceniu eutyreozy.
Obserwowany wzrost stężenia galaktozoaminoglikanów
w surowicy krwi osób z chorobą Gravesa i Basedowa, zdaje
się obejmować przynajmniej dwa mechanizmy, z których jeden prawdopodobnie zależy od stanu czynnościowego gruczołu tarczowego, drugi natomiast związany jest z autoimmunologicznym tłem schorzenia. Nie wykluczone bowiem,
że hipertyreoza, u osób z nie leczoną chorobą Gravesa i Basedowa, zaburzająca przemiany metaboliczne organizmu,
upośledzać także może przemiany galaktozoaminoglikanów.
Wpływ hormonów tarczycy na kumulację omawianych makrocząsteczek w surowicy krwi nie leczonych osób z chorobą Gravesa i Basedowa, nie wydaje się być bezpośrednio
związany ze wzrostem syntezy tych związków. Sugestia ta
opiera się na wynikach badań, oceniających działanie hormonów tarczycy – stosowanych w wysokich stężeniach – na
metabolizm hodowanych in vitro komórek [21]. I tak, wzrastające w hodowli fibroblasty ludzkiej skóry, nie odpowiadały wzmożoną biosyntezą PGs, ocenianą jako ilość izotopu
S, wbudowywanego w łańcuchy GAGs, na wprowadzone
do medium hodowlanego hormony tarczycy – w stężeniach
odpowiadających hipertyreozie [21]. Wykazano nawet, że
stosowanie – w wysokich stężeniach – T3 prowadzi w hodowlach osteoblastów do znacznej redukcji ilości macierzy pozakomórkowej, wytwarzanej przez te komórki [22].
Możliwe jednak, iż wpływ hipertyreozy na syntezę PGs,
a co za tym idzie – na kumulację galaktozoaminoglikanów
w osoczu, jest pośredni. Wykazano bowiem, iż jednym
z czynników związanych z hipertyreozą, mogącym kształtować metabolizm wyżej wymienionych makrocząsteczek,
jest stres oksydacyjny [23, 24]. Lu i wsp. [25] wykazali, iż
powstające w nadmiarze, w przebiegu nie leczonej choroby
Gravesa-Basedowa, reaktywne formy tlenu (RFT) stymulują proliferację fibroblastów pozagałkowej tkanki łącznej,
czego wyrazem jest wzrost biosyntezy PGs, prowadzący do
wystąpienia oftalmopatii [25]. Z drugiej jednak strony znany
jest udział RFT w pozakomórkowej degradacji PGs/GAGs
[20, 26, 27]. Te lokalne, związane z nadmierną aktywnością
wolnorodnikową, zmiany zawartości PGs/GAGs, mogące
jednak wpływać na wzrost stężenia galaktozoaminoglikanów we krwi, wydają się być zależne od zastosowanej terapii. Leczenie hipertyreozy tiamazolem obok przywrócenia
stanu eutyreozy prowadzi także do wyrównania zaburzeń
prooksydacyjno-antyoksydacyjnych [24].
Otrzymane w niniejszej pracy wyniki ilościowej oceny galaktozoaminoglikanów surowicy krwi osób z chorobą Gravesa i Basedowa, po uzyskaniu u nich stanu eutyreozy dowodzą
współistnienia, obok mechanizmu zależnego od stanu czynnościowego tarczycy, innej – związanej z nadmierną aktywnością
prozapalnych cytokin – drogi regulującej przemiany heteropolisacharydowych komponentów macierzy. Liczne badania dowodzą, iż TGF- α, TGF- β, IGF-1, PDGF, IFN-γ, IL-4, IL-1(α),
IL-1(β) są czynnikami stymulującymi, biosyntezę galaktozoaminoglikanów przez pozagałkowe i/lub skórne fibroblasty, pochodzące od osób z chorobą Gravesa i Basedowa [28-34].
Opisane wyżej mechanizmy prowadzące do obserwowanych w surowicy krwi osób z chorobą Gravesa i Basedowa
– ilościowych zmian galaktozoaminoglikanów, zachodzą
prawdopodobnie równocześnie i są od siebie zależne. Jak
wynika bowiem z piśmiennictwa, leczenie nadczynności tarczycy w przebiegu choroby Gravesa i Basedowa prowadzi do
obniżenia stężenie IL-6, sIL-6R oraz TNF-α w surowicy krwi
osób poddanych terapii [33, 34]. Opisano także korzystny efekt
steroidoterapii i/lub radioterapii, zastosowanej w leczeniu powikłań choroby Gravesa i Basedowa, prowadzącej do normalizacji stężenia GAGs w osoczu krwi osób chorych [33-35].
Wniosek
Pomimo, iż nie dowiedziono bezpośredniego wpływu
leczenia tyreostatykami na przemiany galaktozoaminoglikanów, których zaburzenia prowadzą do wystąpienia pozatarczycowych objawów choroby Gravesa i Basedowa, tj.
oftalmopatii i/lub obrzęku przedgoleniowego, to nie można
wykluczyć, że terapia tiamazolem opóźnia kliniczne ujawnienie się wymienionych powikłań.
Źródło finansowania:
Projekt badawczy KBN nr 3 P05A 105 23
&ARM0RZEGL.AUK
Piśmiennictwo
1. Tomer Y, Huber A. The etiology of autoimmune thyroid
disease: a story of genes and environment. J Autoimmun
2009; 32: 231-239.
2. Hadj-Kacem H i wsp. Autoimmune thyroid diseases: genetic susceptibility of thyroid-specific genes and thyroid
autoantigens contributions. Int J Immunogenet 2009; 36:
85-96.
3. Tanda M i wsp. Thyroid autoimmunity and environment.
Horm Metab Res 2009; 41: 436-442.
4. Stalberg P i wsp. Surgical treatment of Graves’ disease:
evidence-based approach. World J Surg 2008; 32: 12691277.
5. Prakash A i wsp. A systematic review of drug therapy for
Graves’ hyperthyroidism. Eur J Endocrinol 2005; 153:
489-498.
6. Acharya S i wsp. Radioiodine therapy (RAI) for Graves’ disease (GD) and the effect on ophthalmopathy:
a systematic review. Clin Endocrinol (Oxf) 2008; 69:
943-950.
7. Sun MT, Tsai CH, Shih KC. Antithyroid druginduced agranulocytosis. J Chin Med Assoc 2009;
72: 438-441.
8. Dickinson J, Perros P. Thyroid-associated orbitopathy:
who and how to treat. Endocrinol Metab Clin North Am
2009; 38: 373-388.
9. Fatourechi V. Pretibial myxedema: pathophysiology and
treatment options. Am J Clin Dermatol 2005; 6: 295309.
10. Bahn R, Heufelder A. Orbital connective tissue in endocrine ophthalmopathy. Dev Ophthalmol 1993; 25:
44-57.
11. Hansen C i wsp. Increased sulfatation of glycosaminoglycans in Graves’ ophthalmopathy. J Clin Endocrinol
Metab 1999; 84: 1409-1413.
12. Heufelder AE. Pathogenesis of ophthalmopathy in autoimmune thyroid disease. Rev Endocr Metab Disord
2000; 1: 87-95.
13. Pappa A i wsp. An ultrastructural and systemic analysis
of glycosaminoglycans in thyroid – associated ophthalmopathy. Eye 1998; 12: 237-244.
14. Volpi N, Cusmano N, Venturelli T. Qualitative and quantative studies of heparin and chondroitin sulphates in
normal human plasma. Bioch Biophys Acta 1995; 1243:
49-58.
15. Blummenkrantz N, Asboe-Hansen G. New method for
quantitative determination of uronic acids. Anal Biochem 1973; 54: 484-489.
16. Olczyk K, Głowacki A, Koźma E.M. Non-insulindependent diabetes mellitus - associated changes in
serum glycosaminoglycans. Pathophysiology 1997; 4:
121-129.
17. Seidler D, Peter-Katalinić J, Zamfir A. Galactosaminoglycan function and oligosaccharide structure
determination. Scientific World Journal 2007; 7:
233-241.
18. Seidler D, Dreier R. Decorin and its galactosaminoglycan chain: extracellular regulator of cellular function?
IUBMB Life 2008; 60: 729-733.
19. Roughley P. The structure and function of cartilage proteoglycans. Eur Cell Mater 2006; 12: 92-101.
20. Winsz-Szczotka K i wsp. Glikozoaminoglikany surowicy krwi osób z chorobą Gravesa i Basedowa. Wiad Lek
2006; 1-2: 66-71.
21. Shishiba Y i wsp. Thyroid hormone excess stimulates
the synthesis of proteoglycan in human skin fibroblasts in culture. Acta Endocrinol (Copenh) 1990; 123:
541-549.
22. Luegmayr E i wsp. Effects of triiodothyronine on morphology, growth behavior, and the actin cytoskeleton in
mouse osteoblastic cells (MC3T3-E1). Bone 1996; 18:
591-599.
23. Bartalena L i wsp. Oxidative stress and Graves’ ophthalmopathy: in vitro studies and therapeutic implications.
Biofactors 2003; 19: 155-163.
24. Komosińska-Vassev K i wsp. Free radical activity and
antioxidant defense mechanisms in patients with hyperthyroidism due to Graves’ disease during therapy. Clin
Chim Acta 2000; 300: 107-117.
25. Lu R i wsp. Oxygen free radicals in interleukin-1β - induced glycosaminoglycan production by retro – ocular
fibroblasts from normal subjects and Graves’ ophthalmopathy patients. Thyroid 1999; 9: 297-303.
26. Moseley R, Waddington R, Embery G. Degradation of
glycosaminoglycans by reactive oxygen species derived
from stimulated polymorphonuclear leukocytes. Biochim Biophys Acta 1997; 31: 221-231.
27. Winsz-Szczotka K i wsp. Oksydacyjna modyfikacja białek
rdzeniowych proteoglikanów w przebiegu fizjologicznego
starzenia sie ustroju. Farm Przegl Nauk 2008; 5: 7-10.
28. Gianoukakis AG, Khadavi N, Smith TJ. Cytokines, Graves’ disease, and thyroid-associated ophthalmopathy.
Thyroid 2008; 18: 953-958.
29. Smith TJ. The putative role of fibroblasts in the pathogenesis of Graves’ disease: evidence for the involvement of the insulin-like growth factor-1 receptor in fibroblast activation. Autoimmunity 2003; 36:
409-415.
30. Wang L, Teng W, Shan Z. Effect of INF-gamma, IL-4 on
proliferation and synthesis of hyaluronic acid and collagen in cultured human retroorbital fibroblasts in vitro.
Chin Med J (Engl) 2000; 113: 907-910.
31. Tiedemann K, Malmström A, Westergren-Thorsson G.
Cytokine regulation of proteoglycan production in fibroblasts: separate and synergistic effects. Matrix Biol
1997; 15: 469-478.
32. Tan G, Dutton C, Bahn R. Interleukin-1 (IL-1) receptor antagonist and soluble IL-1 receptor inhibit IL-1
– induced glycosaminoglycan production in cultured
human orbital fibroblasts from patients with Graves’
ophthalmopathy. J Clin Endocrinol Metab 1996; 81:
449-542.
33. Diez J i wsp. Serum concentrations of tumour necrosis
factor-alpha (TNF-α) and soluble TNF- α receptor p55
in patients with hypothyroidism and hyperthyroidism
before and after normalization of thyroid function. Clin
Endocrinol 2002; 57: 515-521.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
34. Salvi M i wsp. Serum concentrations of proinflammatory
cytokines in Graves’ disease: effect of treatment, thyroid
function, ophthalmopathy and cigarette smoking. Eur J
Endocrinol 2000; 143: 197-202.
35. Ohtsuka Y i wsp. Localized myxedema, associated with
increased serum hyaluronic acid, and response steroid
pulse therapy. Intern Med 1995; 34: 424-249.
data otrzymania pracy: 08.03.2010 r.
data akceptacji do druku: 09.04.2010 r.
Adres do korespondencji:
dr n. med. Katarzyna Winsz-Szczotka
Katedra i Zakład Chemii Klinicznej i Diagnostyki Laboratoryjnej
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
ul. Jedności 8, 41-200 Sosnowiec
tel. +48 32 364 11 52
e-mail: [email protected]