Ćwiczenie nr 11

XI. Antybiotyki i chemioterpeutyki – ćwiczenia praktyczne
W przedstawionych ćwiczeniach narysuj i zinterpretuj otrzymane wyniki badań
mechanizmów oporności. Opisz rodzaje krążków użytych do badań oraz sposób wykonania
oznaczenia.
Ćwiczenie 1. Oznaczanie wrażliwości szczepów na metycylinę
Szczególne niebezpieczeństwo stanowią szczepy tzw. gronkowców metycylinoopornych
(oksacylinoopornych) występujące zarówno wśród gatunków koagulazododatnich (MRSA —
ang. methicillin resistant Staphylococcus aureus) jak i koagulazoujemnych (MRCNS – ang.
methicillin resistant coagulase negative staphylococci).
Zasada metody: Mechanizm oporności na metycylinę
Polega na zmianie docelowego miejsca wiązania antybiotyku b-laktamowego - zmianie w
białkach wiążących penicyliny-PBP (transpeptydazy) – co jest powodem całkowitego braku
lub zmniejszenia zdolności łączenia się leku z komórką bakteryjną. Oporność na metycylinę
warunkowana jest obecnością nowego białka wiążącego penicylinę zwanego PBP2a lub
PBP2’, kodowanego przez gen mecA zlokalizowany w chromosomie i stanowiący cześć
regionu noszącego nazwę SCCmec (gronkowcowa kaseta chromosomalna mec, ang.
staphylococcocal cassette chromosome mec). W odróżnieniu od pozostałych białek PBP,
białko PBP2a nie ulega hamowaniu przez antybiotyki β-laktamowe z powodu obniżonego
powinowactwa do tych antybiotyków. Białko PBP2a zachowuje natomiast swoją funkcję
enzymatyczną i uczestniczy w syntezie ściany komórkowej, ale jego ekspresja zachodzi tylko
w obecności β-laktamu.
Wykonanie oznaczenia:
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Podłoże: MHA (Muller-Hinton agar).
Zawiesina bakteryjna o gęstości 0,5 McFarlanda.
Zawiesinę posiać metodą murawkową na podłoże jałową wymazówką.
Umieścić krążek z cefoksytyna 30 mg.
Inkubować przez 24h w temp. 33-35°C, w atmosferze tlenowej.
Odczyt wyników: wykonać pomiar wielkości strefy zahamowania wzrostu (zwrócić
szczególną uwagę na pojedyncze kolonie w strefie). Odczyt przeprowadzić w świetle
odbitym.
Interpretacja wyników:
Szczepy oporne na meticylinę są klinicznie oporne na wszystkie antybiotyki β-laktamowe,
czyli na: penicyliny, penicyliny z inhibitorami, cefalosporyny, cefalosporyny z inhibitorami,
monobaktamy, karbapenemy.
Uwaga: Nie należy oznaczać wrażliwości na inne leki z tej grupy, a wykonanie takiego
oznaczenia może prowadzić do uzyskiwania niewiarygodnych wyników (aktywność in vitro,
przy braku skuteczności klinicznej).
Otrzymany wynik w ćwiczeniu 1.
Strefa zahamowania wzrostu ( w mm)
Otrzymany wynik
Ćwiczenie 2. Oznaczanie mechanizmu oporności MLSB
Zasada metody: Mechanizm oporności na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B
Mechanizm tej oporności związany jest z modyfikacją miejsca docelowego działania leku, co
warunkowane jest obecnością genów erm kodujących metylazy rybosomalne. Metylacja
dużej podjednostki rybosomu powoduje oporność krzyżową w mechanizmie MLSB typu
(kMLSB) konstytutywnego lub indukcyjnego (iMLSB) wobec antybiotyków działających na
to samo miejsce.
Wykonanie oznaczenia:
Zawsze należy wykonać oznaczenie metodą dwóch krążków, bo jedynie metoda dyfuzyjnokrążkowa pozwala wykryć indukcyjny mechanizm oporności na makrolidy, linkosamidy i
streptograminy B.
Ø Podłoże MHA
Ø Zawiesina bakteryjna o gęstości 0,5 McFarlanda
Ø Nanosimy zawiesinę na podłoże jałową wymazówką, nakładamy krążki z
erytromycyną 15 mg i klindamycyną 2 mg w odległości 15-26 mm od krawędzi
krążków.
Ø Inkubacja: 16-18 h w temp. 33-35°C, w atmosferze tlenowej.
Odczyt i interpretacja wyników:
W przypadku oporności na erytromycynę należy zwracać uwagę na spłaszczenie strefy
zahamowania wzrostu dookoła krążka z klindamycyną od strony krążka z erytromycyną
(kształt litery D) świadczące o indukcyjnym mechanizmie oporności MLSB.
Interpretacja wyników:
W przypadku stwierdzenia mechanizmu MLSB
zarówno konstytutywnego, jak i
indukcyjnego, ze względu na ryzyko niepowodzenia terapeutycznego, w leczeniu nie
powinno się stosować: makrolidów, linkosamidów, streptogramin B.
……………………………….…………………….………………………………………………..……………………………..…………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………….………………………………………………..…………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………..………
Ćwiczenie 3. Oznaczanie mechanizmów oporności ESBL
Zasada metody: Mechanizm oporności typu ESBL
Jednym z najistotniejszych klinicznie i epidemiologicznie mechanizmów oporności na leki u
pałeczek Gram-ujemnych (z rodziny Enterobacteriaceae oraz pałeczek niefermentujących)
jest wytwarzanie tzw. β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL). Są to
enzymy zdolne do hydrolizy: penicylin, cefalosporyn (z wyjątkiem cefamycyn, np.
cefoksytyny), monobaktamów (aztreonamu). „Najważniejsza” jest ich aktywność względem
cefalosporyn III i IV generacji.
Uwagi: Pomimo, że ESBL są hamowane przez inhibitory β-laktamaz (kwas klawulanowy,
sulbaktam i tazobaktam), szczepy ESBL+ nierzadko okazują się oporne in vitro na połączenia
β-laktamów z inhibitorami. Co jednak ważniejsze, szczepy ESBL+ mogą wykazywać
wrażliwość in vitro na leki należące do substratów ESBL, zwłaszcza na przynajmniej
niektóre cefalosporyny III/IV generacji i/lub aztreonam.
Wykonanie oznaczenia:
· Podłoże MHA,
· zawiesina bakteryjna o gestosci 0,5 McFarlanda,
· inkubacja 16-18h w temp. 35o C± 2o C, w atmosferze tlenowej
Do wykrywania ESBL może być stosowany tzw. test dwóch krążków (DDST). W wariancie
podstawowym tej metody stosuje się krążki z ceftazydymem 30 µg i cefotaksymem 30 µg
ułożone w odległości 2 cm (pomiędzy środkami) od krążka z amoksycyliną z kwasem
klawulanowym 20/10 µg.
W celu zwiększenia czułości testu można dodawać krążki z cefpodoksymem 10 µg i/lub
aztreonamem 30 µg.
Wynik pozytywny testu polega na wyraźnym powiększeniu strefy zahamowania wzrostu
wokół krążka z ceftazydymem lub cefotaksymem (cefpodoksymem, aztreonamem) od strony
krążka zawierającego kwas klawulanowy. Powiększenie to może przybierać bardzo różne
kształty.
Interpretacja wyników:
Przyjęto zalecenie, by szczepy wytwarzające ESBL traktować jako szczepy oporne na:
wszystkie penicyliny (bez połączeń z inhibitorami), cefalosporyny (z wyjątkiem cefamycyn),
aztreonam.
W przypadku ciężkich zakażeń oraz w przypadku chorych z czynnikami ryzyka, szczepy
ESBL+ bywają traktowane jako z definicji oporne również na połączenia antybiotyków βlaktamowych z inhibitorami β-laktamaz, chociaż zagadnienie to pozostaje przedmiotem
kontrowersji i wymaga więcej danych klinicznych.
Podane zalecenia należy stosować mniej restrykcyjnie w przypadku szczepów ESBL+
izolowanych z miejsc ciała, w których leki ulegają zagęszczeniu.
……………………………….…………………….………………………………………………..……………………………..…………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………….………………………………………………..…………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………..………
Ćwiczenie 4. Oznaczanie mechanizmu typu MBL - β-laktamazy
hydrolizujace karbapenemy (tzw. karbapenemazy)
Obecnie, coraz powszechniej uważa się, że każdy izolowany w szpitalu szczep pałeczki z
rodziny Enterobacteriaceae powinien być poddany wstępnemu badaniu na możliwość
wytwarzania karbapenemazy typu MBL lub KPC. Szczepy te powinno się traktować jako
jedne z potencjalnie najgroźniejszych patogenów człowieka.
Zasada metody:
Metalo-β-laktamazy klasy B (tzw. enzymy MBL) - zwane tak ze względu na
wykorzystywanie jonów Zn2+ jako kofaktorów reakcji hydrolizy β-laktamów.
Szczepy MBL+ są oporne lub wykazują obniżoną wrażliwość na: penicyliny, cefalosporyny,
karbapenemy, połączenia z inhibitorami b-laktamaz (brak wpływu inhibitorów).
Wykonanie oznaczenia:
·
·
·
·
Test wykonuje sie metodą dyfuzyjno-krążkową, a płytki MHA z posianym szczepem
bakterii przygotowuje się jak w rutynowych badaniach wrażliwości na leki wg zaleceń
CLSI (jak wyżej).
Na płytce układa sie zestaw krążków: krążek z EDTA (10 μl 0,5M EDTA, pH 7,3-7,5)
i po jego obu stronach krążki z ceftazydymem 30 μg i imipenemem 10 μg, odległe od
krążka z EDTA o 2 cm (miedzy środkami krążków).
Dodatkowo, można też wykonać oznaczenie z drugim zestawem krążków, w którym
krążek środkowy zawiera kwas 2-merkaptopropionowy zamiast EDTA.
Krążki z EDTA (i 2-MPA) należy przygotować samodzielnie na kilka minut przed
ułożeniem na płytce.
Odczyt wyniku
EDTA (2-MPA) jest inhibitorem MBL, w związku z tym, o wytwarzaniu tych enzymów
świadczy pojawienie się i wyraźne powiększenie strefy wokół krążka z ceftazydymem i/lub
karbapenemem od strony krążka zawierającego inhibitor (obraz bardzo podobny do
dodatniego wyniku oznaczania ESBL metoda dwóch krążków, DDST).
……………………………….…………………….………………………………………………..……………………………..…………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………….………………………………………………..…………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………..………