POLMICRO 2012 - Diagnostyka Laboratoryjna

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2013 • Volume 49 • Number 1 • 17-24
Praca oryginalna • Original Article
Biegłość laboratoriów mikrobiologicznych w oznaczaniu
lekowrażliwości drobnoustrojów – POLMICRO 2012
Proficiency of microbiology laboratories in the determination of
pathogens antimicrobial susceptibility - POLMICRO 2012
Ewa Młodzińska1, Elżbieta Stefaniuk1,2, Karolina Bosacka1, Beata Chmylak1, Monika Fortuna1,
Waleria Hryniewicz1,2
1
Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, Warszawa
2
Narodowy Instytut Leków, Warszawa
Streszczenie
Praca przedstawia wyniki XIX edycji Ogólnopolskiego Sprawdzianu Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO
2012. W roku 2012 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJDM) zorganizował dwa typy
sprawdzianów: jeden – przeznaczony dla laboratoriów świadczących diagnostykę w szerokim zakresie oraz drugi - oddzielny
sprawdzian przeznaczony dla pracowni schorzeń jelitowych stacji sanitarno-epidemiologicznych. Przesyłane w ramach Programu izolaty bakteryjne różniły się wrażliwością na antybiotyki oraz wytwarzaniem różnych mechanizmów oporności. Celem
Programu POLMICRO 2012 była ocena biegłości laboratoriów w identyfikacji drobnoustrojów oraz ocena oznaczania ich
lekowrażliwości wg europejskich rekomendacji (EUCAST).
Summary
The objective of this study was to analyse and discuss the results of 19th edition of Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiological Diagnostics - POLMICRO 2012. In 2012 two different types of proficiency programme were
organised. The first one was aimed at laboratories providing a broad spectrum of microbiological diagnostics. The second,
was prepared for enteric diseases laboratories in sanitary inspection. The distributed isolates present different susceptibility
patterns and different mechanisms of resistance. The task of the laboratory was to identify to the species level every strain and
to determine their susceptibility to antibiotics according to European Guidelines EUCAST.
Słowa kluczowe:zewnątrzlaboratoryjny sprawdzian wiarygodności, identyfikacja, lekowrażliwość, mechanizmy oporności
Key words:external quality assessment scheme, identification, susceptibility to antimicrobial agents, resistance’s mechanisms
Wstęp
W roku 2012 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJwDM) zorganizował XIX edycję Ogólnopolskiego Sprawdzianu Wiarygodności Badań
Mikrobiologicznych „POLMICRO”. Program POLMICRO
łączy w sobie badania biegłości i porównania międzylaboratoryjne. W kolejnych edycjach programu poruszane są
najnowsze problemy z diagnostyki mikrobiologicznej, jak
również, ze względu na zachodzące na przestrzeni lat zmiany kadrowe w laboratoriach, powraca się do „starych”, ale
wciąż aktualnych zagadnień. COBJwDM organizuje co roku
dwa rodzaje sprawdzianów: sprawdzian POLMICRO dla laboratoriów świadczących szeroką diagnostykę mikrobiologiczną (Edycja Ogólna) oraz sprawdzian POLMICRO/SSE
- dla pracowni/laboratoriów schorzeń jelitowych. Celem pro-
gramu jest ocena kompetencji laboratoriów mikrobiologicznych w zakresie identyfikacji, oznaczania lekowrażliwości
i wykrywania mechanizmów oporności na leki drobnoustrojów wywołujących zakażenia.
Łącznie w roku 2012 zorganizowano sześć tur sprawdzianów,
cztery w edycji ogólnej i dwie dotyczące wyłącznie pałeczek
jelitowych. Tematem niniejszego opracowania jest przedstawienie wyników edycji ogólnej programu - POLMICRO 2012.
Materiał i metody
W roku 2012 porównania międzylaboratoryjne w ramach
XIX Edycji Ogólnej Programu POLMICRO zostały przeprowadzone z wykorzystaniem szczepów bakteryjnych przedstawionych w Tabeli I. Każde laboratorium uczestniczące
w Sprawdzianie otrzymało w ciągu roku osiem izolatów
17
Biegłość laboratoriów mikrobiologicznych w oznaczaniu lekowrażliwości drobnoustrojów – POLMICRO 2012
Tabela I. Izolaty bakteryjne wykorzystane w ogólnej edycji sprawdzianu POLMICRO 2012 (XIX edycja).
Gatunek drobnoustroju
nr kolekcji POLMICRO
Fenotyp/mechanizm oporności
POLMICRO 2012– tura I
Pseudomonas aeruginosa
PM-195
MBL ujemny
Pseudomonas aeruginosa
PM-196
MBL ujemny
Pseudomonas aeruginosa
PM-197
MBL dodatni
Pseudomonas aeruginosa
PM-198
MBL ujemny
POLMICRO 2012– tura II
Staphylococcus haemolyticus
Staphylococcus haemolyticus
PM-199
MRCNS, MLSB indukcyjny
PM-200
MRCNS, MLSB indukcyjny
POLMICRO 2012– tura III
Enterococcus faecalis
PM-205
Enterococcus faecium
PM-206
VRE
Pseudomonas aeruginosa
PM-195
MBL ujemny
Pseudomonas aeruginosa
PM-207
MBL dodatni
POLMICRO 2012– tura IV
MBL - karbapenemazy klasy B, tzw. metalo β-laktamazy; MRCNS – gronkowiec koagulazo - ujemny oporny na meticylinę; MLSB - oporność
na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B; VRE – oporność na glikopeptydy
(po dwa w każdej turze sprawdzianu), z dołączoną do nich
szczegółową instrukcją postępowania z próbkami, a także
informacją odnośnie sposobu udzielania odpowiedzi, wnoszenia i rozpatrywania reklamacji.
Zadaniem laboratoriów było zidentyfikowanie izolatów do
poziomu gatunku i określenie ich wrażliwości na leki z wykryciem mechanizmów oporności. Uzyskane wyniki przesyłane
były do Centralnego Ośrodka drogą elektroniczną, poprzez
wypełnienie ankiety dostępnej dla każdego laboratorium na
stronie internetowej Ośrodka www.polmikro.edu.pl.
Wyniki testów wrażliwości podlegały ocenie wyłącznie dla
izolatów poprawnie zidentyfikowanych; ocenę przeprowadzono w oparciu o kategoryzację błędnych wyników interpretacji klinicznej na małe, duże i bardzo duże błędy. Mały błąd
(mE - minor error) przyznawany był w sytuacji, kiedy szczep
wrażliwy lub oporny został zaliczony jako średniowrażliwy;
Rycina 1. Rozkład wartości MIC teikoplaniny dla szczepu S. haemolyticus PM-199
Rycina 2. Rozkład wartości MIC teikoplaniny dla szczepu S. haemolyticus PM-200
Rycina 3. Rozkład wartości MIC wankomycyny dla szczepu S. haemolyticus PM-199
Rycina 4. Rozkład wartości MIC wankomycyny dla szczepu S. haemolyticus PM-200
18
bądź szczep średniowrażliwy jako wrażliwy lub oporny. Duży
błąd (ME- major error) – oznaczał zakwalifikowanie szczepu
wrażliwego jako oporny. Bardzo duży błąd (VME - very major
error), za popełnienie którego przyznawano ocenę negatywną, oznaczał określenie szczepu opornego jako wrażliwy na
dany antybiotyk/chemioterapeutyk. Zastosowana kwalifikacja błędów oparta jest na zaleceniach Centers for Disease
Control and Prevention (CDC).
Wyniki i omówienie
I tura programu POLMICRO 2012
W ramach I tury POLMICRO 2012 przygotowano zestawy
kontrolne zawierające izolaty bakteryjne, należące do gatunku Pseudomonas aeruginosa. Przedmiotem tej tury sprawdzianu była przede wszystkim ocena umiejętności laboratoriów do wykrywania i interpretacji mechanizmów oporności
szczepów pałeczek niefermentujących na karbapenemy,
w szczególności mechanizmu polegającego na wytwarzaniu
karbapenemaz klasy B - metalo-β-laktamaz zależnych od
jonów Zn++, tzw. MBL. Szczepy wysłano do 474 laboratoriów
mikrobiologicznych, odpowiedź otrzymano od 458 uczestników. Pozytywny wynik I tury sprawdzianu POLMICRO 2012
uzyskało trzysta pięćdziesiąt dziewięć, tj. 78,4% laboratoriów biorących udział w niniejszej turze programu.
IDENTYFIKACJA
Ogółem na 916 wyników identyfikacji uzyskano 99,6% zgodności wyników i tylko w czterech przypadkach błędnie określono przynależność gatunkową badanych szczepów. Szczep
PM-198 nieprawidłowo zidentyfikowały dwa laboratoria: jedno
jako Stenotrophomonas maltophilia i jedno jako Burkholderia
cepacia. Jedno laboratorium szczep PM-195 zidentyfikowało
jako Pseudomonas putida, a inne laboratorium zidentyfikowało szczep PM-196 jako Pseudomonas fluorescens. Izolat
PM-197 został prawidłowo zidentyfikowany przez wszystkie
laboratoria, które ten szczep otrzymały do badania.
LEKOWRAŻLIWOŚĆ P. aeruginosa PM-195
Szczep P. aeruginosa PM-195 nie był producentem metaloβ-laktamaz (MBL), wykazywał natomiast obniżoną wrażliwość na meropenem i oporność na imipenem. Oporności
na imipenem nie wykryły tylko cztery laboratoria, dwa z nich
uzyskały wynik średniowrażliwy, a dwa określiły szczep jako
wrażliwy. Prawidłowy wynik oznaczania wrażliwości na drugi
z karbapenemów - meropenem, uzyskało 64,5% laboratoriów (n=147/228).
Ze względu na duże różnice w wynikach wrażliwości szczepu PM-195 na cefepim, postanowiono nie uwzględniać tego
parametru w ocenie końcowej I tury POLMICRO 2012.
Wyniki oznaczeń dla cefepimu zostały omówione łącznie
z wynikami IV tury POLMICRO 2012, w której ponownie do
wszystkich laboratoriów wysłano szczep P. aeruginosa PM195. Rycina 5 przedstawia rozkład uzyskanych w laboratoriach stref zahamowania wzrostu wokół krążka z cefepimem
30µg, natomiast na rycinie 7 przedstawiono rozkład wartości
MIC (mg/L) cefepimu uzyskanych w laboratoriach dla szczepu P. aeruginosa PM-195.
LEKOWRAŻLIWOŚĆ P. aeruginosa PM-196
Izolat P. aeruginosa PM-196 otrzymało także 228 laboratoriów, był to szczep wrażliwy na wszystkie leki zamieszczone
w ankiecie POLMICRO z wyjątkiem gentamicyny. Oporności
na gentamicynę nie wykryły 3 laboratoria popełniając bardzo
duży błąd (VME). W wyniku analizy otrzymanych odpowiedzi
odnotowano 10 dużych błędów (ME) w oznaczeniu wrażliwości na piperacylinę z tazobaktamem, 6 ME i jeden mały (mE)
w oznaczeniu wrażliwości na imipenem oraz 5ME i 6mE we
wrażliwości na meropenem. Wyniki oznaczeń pozostałych
antybiotyków i chemioterapeutyków były w przeważającej
większości zgodne z oczekiwanymi (96,9% - 100%).
LEKOWRAŻLIWOŚĆ P. aeruginosa PM-197
Szczep P. aeruginosa PM-197 - producenta metalo-β–
laktamazy z rodziny VIM otrzymało 230 laboratoriów. Szczep
był wrażliwy tylko na kolistynę, wobec pozostałych leków wykazywał oporność. Zgodnie z zaleceniami EUCAST wrażliwość na kolistynę należy oznaczać wyłącznie na podstawie
wartości MIC, mimo to dziesięć laboratoriów określiło wrażliwość szczepu metodą dyfuzyjno-krążkową, co uznano za
niezgodne z aktualnymi rekomendacjami. Dwadzieścia dziewięć laboratoriów (12,6%) nie oznaczyło wrażliwości szczepu na kolistynę. Ogółem, odsetek prawidłowych wyników
testów wrażliwości mieścił się w zakresie 98,7%- 99,6%.
LEKOWRAŻLIWOŚĆ P. aeruginosa PM-198
Szczep P. aeruginosa PM-198 – nie był producentem MBL
i wykazywał wrażliwość na wszystkie antybiotyki i chemioterapeutyki zamieszczone w ankiecie POLMICRO. Dla
większości antybiotyków wyniki oznaczeń lekowrażliwości
szczepu PM-198 były zgodne z oczekiwanymi, a odsetek
prawidłowych wyników wyniósł ponad 99%.
WYKRYWANIE MECHANIZMÓW OPORNOŚCI
Oznaczanie karbapenemaz klasy B tzw. metalo β-laktamaz
(MBL) w omawianej edycji POLMICRO stanowiło trudność
dla około 20% laboratoriów biorących udział w programie.
Najwięcej problemów wystąpiło w przypadku oznaczania
MBL w szczepie MBL-ujemnym P. aeruginosa PM-195, dla
którego osiemdziesiąt pięć laboratoriów (37,3%) udzieliło
błędnej odpowiedzi. Zgodnie z Rekomendacjami Krajowego
Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD), podczas wykrywania produkcji MBL testem
zbliżeniowym (z zastosowaniem krążków z 10µl 0,5M EDTA
oraz krążków z imipenemem - 10µg i ceftazydymem - 30µg)
wynik odczytujemy jako pozytywny, jeśli strefa zahamowania wzrostu wyraźnie powiększa się, rozszerza się wokół
krążka z ceftazydymem i/lub imipenemem od strony krążka
zawierającego EDTA. Dodatkowym testem proponowanym
do wykrywania MBL u P. aeruginosa jest tzw. wersja „kombinowana”, w której na krążek z imipenemem nakrapla się
5µl 0,5M EDTA. Różnica pomiędzy strefami zahamowania
wzrostu dla IMP/EDTA i IMP większa niż 5mm, oznacza wynik dodatni w kierunku MBL. W przypadku szczepu PM-195
nie obserwowano poszerzenia stref w metodzie zbliżeniowej, ani różnicy powyżej 5mm w wersji kombinowanej.
Dla dwóch pozostałych szczepów MBL-ujemnych: P. aeru19
Biegłość laboratoriów mikrobiologicznych w oznaczaniu lekowrażliwości drobnoustrojów – POLMICRO 2012
ginosa PM-196 i P. aeruginosa PM-198 odpowiednio 1,8%
i 1,3% laboratoriów popełniło błędy określając je jako szczepy jako MBL-dodatnie.
Zdecydowanie najmniej błędnych odpowiedzi dotyczących
obecności/braku mechanizmu MBL w badanym szczepie
bakteryjnym, odnotowano dla szczepu P. aeruginosa PM197 – jedynego w tej turze sprawdzianu, szczepu MBL-dodatniego. Produkcji MBL w tym izolacie nie wykryły tylko
3 laboratoria (1,3%), pozostałe 227 laboratoriów (98,7%)
oznaczyło mechanizm prawidłowo.
II tura programu POLMICRO 2012
Przygotowane zestawy kontrolne zawierały dwa izolaty bakteryjne z gatunku Staphylococcus haemolyticus wymienione
w tabeli I. Szczepy wysłano do 467 laboratoriów mikrobiologicznych, odpowiedź otrzymano od 458 uczestników. Pozytywną ocenę końcową przyznano 437 laboratoriom, co stanowi 95,4% ogółu laboratoriów przystępujących do tej tury
sprawdzianu.
IDENTYFIKACJA
Sześć laboratoriów spośród 458 popełniło błąd w identyfikacji obydwu szczepów, siedem laboratoriów błędnie zidentyfikowało jeden z dwóch otrzymanych szczepów kontrolnych.
Tabela II przedstawia wyniki identyfikacji S. haemolyticus
PM-199 i PM-200.
LEKOWRAŻLIWOŚĆ
Przesłany zestaw zawierał dwa szczepy bakteryjne wyizolowane z krwi, dlatego też w ocenie nadesłanych wyników
wzięto pod uwagę interpretację wrażliwości na te leki, które
mogą stanowić opcję terapeutyczną zakażeń.
S. haemolyticus PM-199 – oprócz wymienionych w tabeli
I mechanizmów oporności, wykazywał także oporność na
ciprofloksacynę, gentamicynę, trimetoprim/sulfametoksazol
oraz teikoplaninę. Odsetek prawidłowych wyników wrażliwości S. haemolyticus PM-199 na większość ocenianych antybiotyków i chemioterapeutyków wynosił od 99,1% do 100%.
Bardzo duży błąd – VME popełniło osiem laboratoriów spośród 441 oznaczając szczep S. haemolyticus PM-199 jako
wrażliwy na trimetoprim/sulfametoksazol, mały błąd - mE popełniło trzydzieści pięć laboratoriów, które oznaczyły szczep
jako średniowrażliwy.
S. haemolyticus PM-200 – oprócz oporności na meticylinę
i makrolidy/linkozamidy/streptograminy, był wrażliwy na po-
zostałe antybiotyki uwzględnione w ocenie końcowej sprawdzianu. Większość uzyskiwanych wyników była prawidłowa,
odsetek poprawnych interpretacji przekroczył 99%. Nieznacznie niższy odsetek prawidłowych wyników interpretacji
klinicznej odnotowano dla gentamicyny - 98,9% (5 ME) oraz
wankomycyny – 98,2% (6 ME; 2 mE).
Najsłabiej wypadło oznaczenie wrażliwości szczepu PM-200
na teikoplaninę. Oznaczenie wrażliwości na teikoplaninę wykonało 369 laboratoriów spośród 458, pozostałe 86 laboratoriów nie badało wrażliwości na teikoplaninę. Odsetek prawidłowych wyników wynosił tylko 68%, odnotowano 2 mE
i 116 ME - laboratoria zinterpretowały szczep jako oporny,
zamiast wrażliwy.
Przyczyny powstałych rozbieżności:
1. Trudności w interpretacji klinicznej uzyskanych wyników
wrażliwości
Wartość MIC teikoplaniny szczepu S. haemolyticus PM200 wynosiła 4mg/L – co zgodnie z zaleceniami EUCAST
należało interpretować jako wrażliwy. Sto dziewięćdziesiąt
jeden laboratoriów podało dokładnie taką samą wartość
MIC=4mg/L, jednakże duże rozbieżności zaobserwowano
w interpretacji klinicznej wartości MIC:
• interpretację „wrażliwy” podały 173 laboratoria,
• „oporny” - 10 laboratoriów,
• „średniowrażliwy” - jedno laboratorium,
• 7 laboratoriów nie podało interpretacji klinicznej.
Z nadesłanych przez laboratoria wyników i komentarzy wynikało, że:
• z powodu naturalnie obniżonej wrażliwości na teikoplaninę gatunku S. haemolyticus część laboratoriów zmieniła
interpretację kliniczną z wrażliwy na oporny,
• część uczestników deklarowała interpretację zgodnie
z rekomendacjami EUCAST - wrażliwy, natomiast
w uwagach podawano informację o możliwym niepowodzeniu terapeutycznym z uwagi na naturalnie obniżoną
wrażliwość gatunku na teikoplaninę,
• część laboratoriów nie podała w ogóle interpretacji klinicznej.
Podsumowując, zgodnie z zaleceniami EUCAST nie należało zmieniać interpretacji klinicznej dla teikoplaniny, tylko
raportować wrażliwość zgodnie z uzyskaną wartością MIC
- czyli w przypadku szczepu S. haemolyticus PM-200 raportować jako „wrażliwy”.
Tabela II. Wyniki identyfikacji szczepów S.haemolyticus PM-199 i S.haemolyticus PM-200 – II tura POLMICRO 2012
Podana identyfikacja
S.haemolyticus
PM-199
S.haemolyticus
S. aureus
S.saprophyticus
S.hominis
S.lugdunensis
S.epidermidis
S. auricularis
Staphylococcus koagulazoujemny
448
2
4
1
1
1
1
S.haemolyticus
PM-200
Liczba laboratoriów
20
449
3
2
1
2
1
2. Stosowanie nieaktualnej metodyki oznaczania lekowrażliwości
Od kilku lat (Rekomendacje KORLD 2009) wrażliwość
gronkowców na wankomycynę i teikoplaninę należy oznaczać wyłącznie poprzez określenie wartości MIC. Metoda
dyfuzyjno–krążkowa jest w tym przypadku niewiarygodna
i nie pozwala na rozróżnienie pomiędzy szczepami dzikimi
a opornymi z mechanizmem innym niż oporność uwarunkowana obecnością genu vanA. Niniejsza tura sprawdzianu
wykazała, że 9 laboratoriow nadal stosowało metodę dyfuzyjno-krażkową do oznaczania wrażliwości Staphylococcus
sp. na glikopeptydy. Dziewięć laboratoriów podało strefy
zahamowania wzrostu izolatów wokół krążków z wankomycyną i teikoplaniną, pięć z nich dodatkowo określiło wartości
MIC, przy czym tylko jedno laboratorium określiło zarówno
MIC wankomycyny, jak i teikoplaniny. Pozostałe cztery laboratoria zinterpretowały wrażliwość na wankomycynę
i teikoplaninę wyłącznie na podstawie uzyskanych stref
zahamowania wzrostu, co uznano za bardzo duży błąd
(postępowanie niezgodne z rekomendacjami !!!).
3. Brak lub niewłaściwa kontrola jakości oznaczania lekowrażliwości
Brak kontroli jakości pasków do oznaczania wartości MIC,
bądź stosowanie nieodpowiednich szczepów wzorcowych
jest najczęstszą przyczyną błędów oznaczania lekowrażliwości. Do kontroli jakości lekowrażliwości izolatów z rodzaju
Staphylococcus EUCAST zaleca szczep S. aureus ATCC
29213 (zarówno do metody dyfuzyjno-krążkowej, jak i metody rozcienczeniowej). Stosowanie szczepu S. aureus ATCC
29213 zadeklarowało 391 laboratoriów spośród 458 (85,4%).
Dziesięć laboratoriów nie wykonało kontroli jakości testów wrażliwości, pozostałe wskazały wymienione poniżej
szczepy wzorcowe, błędnie wykorzystane do wewnętrznej
kontroli jakości testów wrażliwości gronkowców:
–– S. aureus ATCC 25923,
–– E. coli ATCC 25922,
–– S. aureus ATCC 43300,
–– E. faecalis ATCC 29212,
–– E. coli ATCC 35218,
–– K. pneumoniae ATCC 700603,
–– P. aeruginosa ATCC 27853,
–– S. pneumoniae ATCC 49619.
Wyniki oznaczania wartości MIC teikoplaniny i wankomycyny uzyskane przez uczestników sprawdzianu POLMICRO
dla obu szczepów przedstawiono na rycinach od 1 do 4.
WYKRYWANIE MECHANIZMÓW OPORNOŚCI
Szczepy S. haemolyticus PM-199 i S. haemolyticus PM–200
były oporne na meticylinę; 100% (n=458) laboratoriów poprawnie określiło meticylinooporność przesłanych izolatów.
Interpretację wyników oznaczania wrażliwości na meticylinę czterysta trzydzieści sześć laboratoriów (95,2%) podało
na podstawie oznaczenia z krążkiem z cefoksytyną 30µg.
Spośród pozostałych 22 laboratoriów, dziesięć określiło meticylinooporność na podstawie wartości MIC cefoksytyny,
co jest niezgodne z aktualnymi rekomendacjami i świadczy
o nieprawidłowym postępowaniu diagnostycznym. EUCAST
wyraźnie podkreśla, że dla gronkowców koagulazo-ujemnych, innych niż S. lugdunensis, oznaczenie wartości MIC
cefoksytyny jest słabszym wskaźnikiem oporności na meticylinę niż oznaczenie metodą dyfuzyjno-krążkową. Pozostałe laboratoria podały wyłącznie samą interpretację in vitro,
prawdopodobnie opierając się na testach wykonanych przy
pomocy systemów automatycznych.
Obydwa przesłane szczepy charakteryzowały się obecnością indukcyjnego mechanizmu oporności MLSB. Identyfikacja fenotypu oporności na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B sprawiła trudność tylko trzem laboratoriom, przy
czym jedno z nich popełniło błąd w wykrywaniu mechanizmu
w obydwu izolatach. Spośród ogółem 916 oznaczeń, odnotowano 4 nieprawidłowe, tj. 0.44%.
III tura programu POLMICRO 2012
W ramach III tury POLMICRO 2012 sprawdzianu każde laboratorium otrzymało dwa szczepy z rodzaju Enterococcus.
Szczepy wysłano do 466 laboratoriów mikrobiologicznych,
odpowiedź otrzymano od 453 uczestników. Pozytywną ocenę końcową uzyskało 441 laboratoriów, co stanowiło 97,4%
ogółu laboratoriów przystępujących do sprawdzianu. Szczegółowe wyniki przedstawiały się następująco:
IDENTYFIKACJA
Jedno laboratorium zidentyfikowało szczep E. faecalis PM205 jako E. faecium. Dwa laboratoria spośród 453 popełniły
błąd w identyfikacji E. faecium PM-206 – jedno laboratorium
określiło szczep jako E. faecalis, a drugie jako E. gallinarum.
Wyniki testów wrażliwości podlegały ocenie wyłącznie dla
izolatów prawidłowo zidentyfikowanych.
LEKOWRAŻLIWOŚĆ
Znaczna część uczestników lekowrażliwość szczepów kontrolnych oznaczała metodą dyfuzyjno-krążkową (n=417,
92%), z czego 28 uczestników metodę dyfuzyjno-krążkową
zastosowało tylko do oznaczenia wrażliwości na jeden lek
(gentamicynę – 25, ampicylinę, teikoplaninę, chinupristinę/
dalfopristynę – po jednym laboratorium), a wrażliwość na
pozostałe leki oznaczyła na podstawie wartości MIC (mg/L);
ta grupa laboratoriów stanowi 6,2% ogółu uczestników. Tylko 36 laboratoriów spośród 453 biorących udział w sprawdzianie (8%), do oceny przedstawiło wyłącznie oznaczenie
metodą rozcienczeniową.
Przesłany zestaw zawierał dwa szczepy bakteryjne wyizolowane z krwi, dlatego też w ocenie nadesłanych wyników
wzięto pod uwagę interpretację wrażliwości na te leki, które
mogą stanowić opcję terapeutyczną.
E. faecalis PM-205 – posiada gen vanA warunkujący oporność izolatu na wankomycynę (MIC≥256 mg/L) i teikoplaninę (MIC=48 mg/L). Wszystkie laboratoria, które prawidłowo
zidentyfikowały badany izolat (n=452/453) oznaczyły prawidłowo także oporność szczepu na wankomycynę. Wrażliwość badanego szczepu na teikoplaninę oznaczyło tylko
438 laboratoriów, z czego tylko jedno laboratorium podało
wynik nieprawidłowy - określiło szczep jako wrażliwy, popeł21
Biegłość laboratoriów mikrobiologicznych w oznaczaniu lekowrażliwości drobnoustrojów – POLMICRO 2012
niając tym samym VME.
Szczep E. faecalis PM-205 był wrażliwy na pozostałe leki
i uczestnicy sprawdzianu w większości nie mieli trudności
w uzyskaniu poprawnych wyników. Jedynie przy oznaczaniu
wrażliwości izolatu na linezolid, trzy laboratoria (0,7%) popełniły ME oznaczając szczep jako oporny i jedno laboratorium popełniło mE, określając szczep jako średniowrażliwy.
Odsetek prawidłowych wyników dla większości ocenianych
antybiotyków i chemioterapeutyków wynosił od 99% do
100%.
E. faecium PM-206 – oprócz oporności na ampicylinę szczep
wykazywał obniżoną wrażliwość na chinupristinę/dalfopristinę (MIC=3mg/L), natomiast na pozostałe antybiotyki był
wrażliwy. Ocenę lekowrażliwości tego szczepu przeprowadzono dla 451 laboratoriów, które prawidłowo zidentyfikowały badany izolat. Odsetek poprawnych wyników kategorii
wrażliwości w odniesieniu do wszystkich leków wyniósł blisko 100%. Ogółem odnotowano siedem ME (wynik oporny
- O zamiast wrażliwy - W), w tym:
–– cztery dla teikoplaniny,
–– dwa dla wankomycyny
–– jeden dla linezolidu.
WYKRYWANIE MECHANIZMÓW OPORNOŚCI
Obydwa szczepy E. faecalis PM-205 i E. faecium PM–206
nie wykazywały oporności wysokiego stopnia na gentamicynę. Prawidłowe wyniki oznaczania oporności wysokiego
stopnia na gentamicynę (HLGR) izolatu E. faecalis PM-205
udzieliło 99,3% (n=449), trzy laboratoria udzieliły błędnej odpowiedzi. Prawidłowe wyniki dla izolatu E. faecium PM-206
uzyskało 99,8% (n=450) laboratoriów, błąd popełniło jedno
laboratorium wykrywając oporność HLGR. Jeden z uczestników zaznaczył dla obydwu szczepów przy oporności HLGR
odpowiedź „nie badano”, pomimo wykonania oznaczenia
wrażliwości na gentamicynę.
Cztery laboratoria użyły do oznaczania wrażliwości na gentamicynę krążka o niewłaściwej zawartości antybiotyku
(120µg lub 10µg zamiast 30µg), co w tabeli wyników zostało
ocenione jako „BŁĄD”. Laboratoria te powinny zwrócić uwagę na znaczne różnice wielkości stref zahamowania wzrostu, wynoszące nawet 5-8 mm wokół krążka z gentamicyną (120 µg) w porównaniu z metodą odniesienia (30 µg).
W przypadku szczepów badanych w niniejszej edycji nie
spowodowało to wprawdzie różnicy w interpretacji wrażliwości, jednak w rutynowej diagnostyce zastosowanie krążków
o nieprawidłowej zawartości antybiotyku jest bardzo dużym
błędem i może skutkować niewiarygodnym wynikiem oznaczenia wrażliwości/wykrycia mechanizmu oporności.
Do kontroli jakości lekowrażliwości izolatów z rodzaju Enterococcus EUCAST zaleca szczep E. faecalis ATCC 29212,
ten sam dla metody dyfuzyjno-krążkowej, jak i metody rozcieńczeniowej (oznaczanie wartości MIC). Stosowanie takiego szczepu zadeklarowało 412 laboratoriów spośród 453,
czyli tylko 91% uczestników. Siedem laboratoriów zaznaczyło odpowiedź wskazującą na to, ze nie prowadziło kontroli
jakości testów wrażliwości, pozostałe laboratoria wskazały
22
inne szczepy wzorcowe, nieprawidłowo wykorzystane do
wewnętrznej kontroli jakości testów wrażliwości enterokoków:
–– S. aureus ATCC 29213,
–– E. coli ATCC 25922,
–– E. faecalis ATCC 51299,
–– S. aureus ATCC 25923.
IV tura programu POLMICRO 2012
W edycji tej przygotowano zestawy kontrolne zawierające
dwa szczepy gatunku Pseudomonas aeruginosa wymienione w tabeli I. Szczepy wysłano do 460 laboratoriów mikrobiologicznych, odpowiedź otrzymano od 450 uczestników.
Pozytywny wynik IV tury sprawdzianu POLMICRO 2012
uzyskało czterysta jeden, czyli 89,1% laboratoriów biorących
udział w programie.
Szczep P. aeruginosa PM-195 został włączony do sprawdzianu POLMICRO po raz drugi; część laboratoriów pierwszy
raz pracowała z tym izolatem w ramach I tury POLMICRO
2012.
IDENTYFIKACJA
Identyfikacja szczepów Pseudomonas aeruginosa nie sprawiła laboratoriom trudności, na 900 wyników tylko dwa były
nieprawidłowe. Dwa laboratoria błędnie zidentyfikowały
szczep PM-195 jako Pseudomonas fluorescens.
LEKOWRAŻLIWOŚĆ P. aeruginosa PM-195
Dla przypomnienia, szczep P. aeruginosa PM-195 wykazywał obniżoną wrażliwość na meropenem i oporność na
imipenem; nie wytwarzał metalo-β-laktamaz (MBL). Szczep
otrzymały wszystkie laboratoria uczestniczące w IV turze
POLMICRO 2012; dla większości antybiotyków podano prawidłową interpretację kliniczną wrażliwości, błędy pojawiły
się w interpretacji wyników wrażliwości na cefepim i meropenem. Ponad osiemdziesiąt procent uczestników (83,6%,
n=376) uzyskało wynik prawidłowy wrażliwości na meropenem – określiło izolat jako średniowrażliwy, pięćdziesiąt laboratoriów określiło szczep jako oporny, natomiast dwadzieścia jeden jako wrażliwy – w obydwu przypadkach zostało to
uznane jako mały błąd.
Podobnie jak podczas I tury 2012, pojawiły się rozbieżności
w oznaczeniu wrażliwości szczepu P.aeruginosa PM-195
na cefepim. W I turze Polmicro 2012 interpretację oznaczenia wrażliwości na cefepim dla PM-195 wycofano z oceny,
z uwagi na niski odsetek poprawnych odpowiedzi - 16,1%.
W IV turze prawidłowy wynik - wrażliwy na cefepim - uzyskało 53,6% (n=241) uczestników sprawdzianu. Laboratoria, które określiły szczep jako oporny na cefepim 41,1%
(n=185) popełniły duży błąd, nie miał on jednak wpływu na
ocenę końcową przyznaną laboratoriom.
Ryciny 5 i 6 przedstawiają rozkład stref zahamowania wzrostu szczepu P. aeruginosa PM-195 wokół krążka z cefepimem, uzyskanych przez laboratoria w I i IV edycji. Najwyższe piki w I i IV edycji odnotowano dla stref zahamowania
wzrostu, odpowiednio, 17 mm i 18 mm, przy czym wynik
podany przez Centralny Ośrodek (jako wynik referencyjny)
Rycina 5. Rozkład stref zahamowania wzrostu (mm) szczepu P.
aeruginosa PM-195 wokół krążka z cefepimem – I tura POLMICRO
2012.
Rycina 7. Rozkład wartości MIC cefepimu dla szczepu P. aeruginosa PM-195 – I tura POLMICRO 2012.
Rycina 6. Rozkład stref zahamowania wzrostu (mm) szczepu P.
aeruginosa PM-195 wokół krążka z cefepimem – IV tura POLMICRO 2012.
Rycina 8. Rozkład wartości MIC cefepimu dla szczepu P. aeruginosa PM-195 – IV tura POLMICRO 2012.
to 18 mm. Najczęstsze wyniki różniły się od siebie tylko
o 1 mm, niestety, w tym przypadku wartość ta powoduje
zmianę kategorii wrażliwości szczepu z wrażliwy (18 mm)
na oporny (17 mm).
Ryciny 7 i 8 przedstawiają z kolei rozkład wartości MIC
(mg/L) cefepimu dla szczepu PM-195 w I i IV turze sprawdzianu. Siedemdziesiąt spośród osiemdziesięciu ośmiu laboratoriów (79,5%) w I turze uzyskało wartości MIC kwalifikujące szczep jako oporny, natomiast w IV turze tylko 76
(34%) uznało szczep jako oporny, a blisko 2/3 laboratoriów
uzyskało wartości MIC dla szczepu PM 195 określające izolat jako wrażliwy.
Wielkości stref zahamowania wzrostu plasujące się blisko
wartości granicznej zamieszczonej w tabelach interpretacji
wyników, zawsze powinny skłaniać laboratorium do wykonania testów inną metodą (Etest, MICE, czy system automatyczny), tak, aby mieć pewność uzyskania wiarygodnego
wyniku. Wszystkie testy wykonywane w laboratorium powinny podlegać wewnętrznej kontroli jakości z odpowiednimi
szczepami wzorcowymi.
LEKOWRAŻLIWOŚĆ P. aeruginosa PM-207
Szczep był oporny na wszystkie antybiotyki i chemioterapeutyki
zamieszczone w ankiecie za wyjątkiem kolistyny, wobec której
pozostawał wrażliwy; był producentem karbapenemazy IMP-1.
Laboratoria nie miały żadnych trudności z uzyskaniem prawidłowych wyników oznaczeń lekowrażliwości tego izolatu.
WYKRYWANIE MECHANIZMÓW OPORNOŚCI
Oznaczanie karbapenemaz klasy B tzw. metalo β-laktamaz
(MBL) w omawianej turze POLMICRO wypadło zadowalająco. Brak produkcji MBL przez P. aeruginosa PM-195 prawidłowo określiło 91,6% (n=412) laboratoriów, natomiast
obecność MBL w szczepie PM-207 wykryło 96,2% (n=433)
uczestników sprawdzianu.
Dwieście dwadzieścia dwa laboratoria otrzymały szczep
PM-195 zarówno w I, jak i IV turze POLMICRO 2012. Siedemdziesiąt osiem laboratoriów, które w I turze popełnilo
błąd w wykrywaniu mechanizmu oporności w szczepie PM195, przy ponownym oznaczaniu skorzystało z doświadczenia nabytego w I turze sprawdzianu i tym razem poprawnie
zakwalifikowało szczep jako MBL-ujemny. Pięć laboratoriów
ponownie popełniło błąd uznając szczep P. aeruginosa PM195 jako MBL-dodatni.
Rycina 9 przedstawia wyniki otrzymane w turach I i IV przez
wszystkie laboratoria, natomiast rycina 10 przedstawia grupę laboratoriów (n=222), które szczep P. aeruginosa PM-195
badały dwukrotnie.
Odnotowano zdecydowanie niższy odsetek błędnych odpowiedzi w szczepie MBL-ujemnym P. aeruginosa PM-195
– z 37,3% (85 z 228) w I turze, do 8,2% (37 z 450) – w IV
turze POLMICRO 2012.
W IV turze POLMICRO 2012 poproszono laboratoria o skomentowanie wyniku oznaczania mechanizmu MBL w bada23
Biegłość laboratoriów mikrobiologicznych w oznaczaniu lekowrażliwości drobnoustrojów – POLMICRO 2012
Rycina 9. Wyniki oznaczania mechanizmu MBL w szczepie P. aeruginosa PM-195 – I i IV tura POLMICRO 2012.
nemy, uwarunkowanej wytwarzaniem karbapenemaz klasy
B, tzw. metalo-β-laktamaz. Analiza wyników wykazała, że
laboratoria prawidłowo identyfikowały izolaty MBL-dodatnie,
natomiast nadal duża grupa laboratoriów nie posiada biegłości w zakresie interpretacji wyniku testu w kierunku MBL
dla szczepów MBL-ujemnych. Odpowiedni dobór szczepów
kontrolnych przez Centralny Ośrodek w ramach POLMICRO
pozwala na poprawę diagnostyki mikrobiologicznej w laboratoriach uczestniczących w Programie poprzez ujednolicenie
i standaryzację metod badawczych w tych laboratoriach.
Ogółem w roku 2012 przyznano 415 świadectw; wykaz
laboratoriów, które otrzymały świadectwa w roku 2012
zamieszczony został na stronie internetowej Centralnego
Ośrodka (www.polmikro.edu.pl). Przyznawane laboratoriom świadectwa posiadają indywidualny numer i zachowują
ważność w terminie jednego roku od dnia wystawienia.
Piśmiennictwo:
Rycina 10. Wyniki oznaczania mechanizmu MBL w szczepie P.
aeruginosa PM-195 uzyskane przez laboratoria, które otrzymały
szczep w I i IV turze POLMICRO 2012.
nych izolatach. Uzyskano następujące odpowiedzi:
P. aeruginosa PM-195 - 275 laboratoriów (61%) odpowiedziało – „wynik jest jednoznaczny, łatwy do zinterpretowania
MBL-ujemny”, natomiast 142 laboratoria (31,6%) wybrało
odpowiedź –„wynik trudny do interpretacji, wymaga potwierdzenia w KORDL”
P. aeruginosa PM-207 - zdecydowana większość (353 laboratoria – 78,4%) nie miała problemów z oznaczeniem
tego mechanizmu oporności, a szczep zostałby wysłany do
KORLD tylko w celach nadzoru epidemiologicznego. Piętnaście z tych laboratoriów uznało, ze szczepu MBL-dodatniego nie należy przesyłać do KORLD w celach nadzoru
epidemiologicznego. Osiemdziesiąt osiem (19,6%) laboratoriów uznało, ze „oznaczenie mechanizmu MBL w szczepie
P. aeruginosa PM-207 jest trudne w interpretacji i wymaga
potwierdzenia w ośrodku referencyjnym”.
Podsumowanie
Analiza przesyłanych do Centralnego Ośrodka Badań
Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej wyników w postaci zestawień zarówno zbiorczych, jak i indywidualnych,
dostępna była dla laboratoriów uczestniczących w Sprawdzianach na stronie internetowej Centralnego Ośrodka.
Podobnie, jak w poprzednich edycjach Programu POLMICRO, główny nacisk położono na prawidłowe oznaczenie
fenotypów lekowrażliwości badanych izolatów bakteryjnych
z uwzględnieniem wytwarzanych przez nie mechanizmów
oporności. Wiele uwagi poświęcono wykrywaniu oporności
Gram-ujemnych pałeczek niefermentujących na karbape24
1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Twenty – Second
Informational Supplement, CLSI document M100-S22, Wayne
PA, 2012.
2. Europejski Komitet ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST),
Tabele interpretacji wartości granicznych minimalnych stężeń
hamujących (MIC) oraz wielkości stref zahamowania wzrostu;
wersja 2.0, 2012; Polskie tłumaczenie pod red. prof. dr hab. n.
med. Walerii Hryniewicz – www.korld.edu.pl
3. Eucast expert rules version 2.0 - http//www.eucast.org
4. Hryniewicz Waleria, Żabicka D, Bartoszewicz M i wsp. Stanowisko Zespołu Roboczego ds. wprowadzania zaleceń Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST
w sprawie najczęściej zgłaszanych pytań dotyczących stosowania rekomendacji EUCAST, 20 czerwca 2011 - www.korld.edu.pl
5. Rekomendacje European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing EUCAST, Version 2.0, 2012 - http//www.eucast.org
6. Zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów – zalecenia ekspertów EUCAST, wersja 1, kwiecień
2008 - Polskie tłumaczenie pod red. Prof. W. Hryniewicz - www.
korld.edu.pl
7. http//www.eucast.org
Adres do korespondencji:
Mgr Ewa Młodzińska
Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej
00-725 Warszawa, ul. Chełmska 30/34
Tel./fax 22 8415834
e-mail: [email protected], [email protected]
Zaakceptowano do publikacji: 06.03.2013