Rozdzia³ bia³ek metod¹ PAGE _zymogram peroksydaz

ANALIZA PORÓWNAWCZA IZOFORM PEROKSYDAZY W KOLEOPTYLACH OWSA METODĄ ELEKTROFOREZY W śELU
POLIAKRYLOAMIDOWYM. WYBARWIANIE ROZDZIELONYCH
BIAŁEK COOMASSIE BRILLANT BLUE-G250
WSTĘP
Powstawanie nadtlenku wodoru i aktywnych form tlenu w tkankach roślinnych
Głównym źródłem H2O2 w roślinach jest fotooddychanie, reakcja Mehlera i indukowana
przez protony dekompozycja anionów nadtlenkowych O2*- , β-utlenianie kwasów tłuszczowych w
peroksysomach oraz reakcje związane z obroną przed patogenami.
W fotooddychaniu do rybulozo-1,5-bisfosforanu zostaje przyłączony tlen w wyniku czego
powstaje fosfoglikolan i 3-fosfoglicerynian. Specyficzna fosfataza odszczepia resztę fosforanową
od fosfoglikolanu, a powstający glikolan po przedostaniu się do peroksysomów zostaje utleniony
do glioksalanu przez oksydazę glikolanową zgodnie z równaniem:
glikolan + O2 → glioksalan + H2O2
W mitochondriach lub chloroplastach tylko jeden elektron redukuje O2 – powstaje anion nadtlenkowy O2*-. W chloroplastach anion nadtlenkowy powstaje głównie w tzw. reakcji Mehlera, która
polega na redukcji O2 przez centrum Ŝelazowo-siarkowe Fx fotosystemu I. W wyniku uprotonowania anionu nadtlenkowego tworzy się rodnik wodoronadtlenkowy HO2*, który działa destrukcyjnie na lipidy, kwasy nukleinowe i białka. Dwa rodniki wodoronadtlenkowe mogą reagować ze
sobą, w wyniku czego powstaje H2O2:
HO2* + HO2* → H2O2 + O2
Anion nadtlenkowy moŜe być usuwany takŜe przez dysmutazę nadtlenkową, enzym, który katalizuje przekształcenie dwóch anionów nadtlenkowych w H2O2 i O2:
O2*- + O2*- + 2H+ → H2O2 + O2
W peroksysomach, w przeciwieństwie do mitochondriów, reakcja β-utleniania długołańcuchowych kwasów tłuszczowych zachodzi z udziałem oksydazy Acylo-CoA zgodnie z równaniem:
C16 Acylo-CoA + O2 → trans-∆2 enolo-CoA + H2O2
Na ryc. 1 pokazano przybliŜone ilości H2O2 produkowane w chloroplastach, mitochondriach i peroksysomach w warunkach dobrego nasłonecznienia i optymalnej temperatury.
1
Ryc. 1. Produkcja nadtlenku wodoru w komórce roślinnej (wg Foyer CH, Noctor G Physiologia Plantarum 2003; 119: 355-364).
RóŜne formy aktywnego tlenu, ale zwłaszcza anion nadtlenkowy O2*- i H2O2, są potrzebne do lignifikacji, a ponadto funkcjonują one jako cząsteczki sygnałowe w reakcjach obronnych przeciw
patogenom. Jednak większość nadtlenku wodoru i innych form aktywnego tlenu musi zostać usunięta enzymatycznie i nieenzymatycznie (antyoksydanty). W enzymatycznym usuwaniu H2O2
uczestniczy katalaza, która rozkłada nadtlenek wodoru zgodnie z równaniem reakcji:
2H2O2 → 2H2O + O2
Katalaza jest zlokalizowana w cytoplazmie, peroksysomach i glioksysomach. Peroksydaza usuwa
nadtlenek wodoru w reakcji utleniania substratów:
RH2 + H2O2 → R + 2H2O
WaŜny układ usuwający H2O2 tworzą enzymy związane z metabolizmem kwasu askorbinowego i
glutationu, a zwłaszcza para enzymów: peroksydaza askorbinianowa/reduktaza dehydroaskorbinianowa. Utleniona przez peroksydazę forma kwasu askorbinowego jest redukowana w
reakcji, w której dawcą wodorów jest zredukowany glutation (Ryc. 2). Peroksydaza askorbinianowa (APX) jest zlokalizowana w cytoplazmie, w błonach i stromie plastydów, reduktaza dehydroaskorbinianowa (DHAR) występuje w cytoplazmie i stromie plastydów, a reduktaza glutationowa
(GR) w cytoplazmie, mitochondriach i w stromie plastydów.
2
Ryc. 2. Antyoksydacyjny system ochrony, poszczególne enzymy i antyoksydanty
nieenzymatyczne (Buchanan, Gruissem, Jones, Plant Biochemistry).
Elektroforeza Ŝelowa
Elektroforeza jest techniką rozdziału białek opartą na zróŜnicowaniu ich ruchliwości w polu elektrycznym. Cząsteczki białek migrują w polu elektrycznym z szybkością zaleŜną od ich wypadkowego ładunku i masy cząsteczkowej. Od ładunku wypadkowego zaleŜy teŜ kierunek ruchu.
Rozdział elektroforetyczny prowadzi się prawie zawsze na stałym podłoŜu (np. bibuła, folia z octanu celulozy, Ŝel agarozowy lub poliakryloamidowy). Najczęściej jako nośniki uŜywane są
Ŝele, poniewaŜ działają one jak sita molekularne, przez co znacznie zwiększają rozdzielczość (ryc.
3). Cząsteczki o małych rozmiarach, w porównaniu z porami Ŝelu, łatwo w nim wędrują, natomiast
cząsteczki znacznie większe niŜ pory Ŝelu pozostają prawie nieruchome. Cząsteczki o pośrednich
rozmiarach poruszają się w Ŝelu z róŜną prędkością.
3
Ryc. 3. Elektroforeza na Ŝelu poliakryloamidowym. A. Aparat do elektroforezy Ŝelowej. B. Pory Ŝelu poliakryloamidowego działają jak sito i rozdzielają białka w zaleŜności od wielkości ich cząsteczek (J.M.
Berg, J.L. Tymoczko, L.Stryer, Biochemia)
Najczęściej stosowanym Ŝelem jest Ŝel poliakryloamidowy, który posiada szereg zalet decydujących o jego powszechnym uŜyciu jako nośnika. śel poliakryloamidowy jest chemicznie
obojętny, bezbarwny i pozbawiony ładunków elektrostatycznych, odznacza się duŜą wytrzymałością mechaniczną i termiczną oraz jest łatwy i szybki w przygotowaniu. Dodatkowo, dzięki moŜliwości zróŜnicowanego sieciowania, moŜna uzyskać określone rozmiary oczek sita molekularnego (0,6 - 4 nm).Wielkość oczek sieci Ŝelu zaleŜy od proporcji między akryloamidem (H2C=CH–
CO–NH2 ) a N,N’-metyleno-bis-akryloamidem H2C=CH–CO–NH–CH2–NH–CO– CH=CH2 (potocznie nazywanym bis-akryloamidem), które są substratami do polimeryzacji. Od ilości bisakryloamidu w mieszaninie zaleŜy liczba wiązań poprzecznych, decydująca o rozmiarach sita molekularnego. Do przeprowadzenia polimeryzacji konieczny jest dodatek nadsiarczanu amonu oraz
katalizatora – N,N,N’,N’-czterometyloetyleno-dwuaminy (TEMED). W wyniku katalizowanego
przez TEMED rozpadu nadsiarczanu amonu, powstają wolne rodniki tlenowe, pod wpływem których tworzą się rodniki poliakryloamidowe dające polimer.
Dla uzyskania optymalnej rozdzielczości stosuje się Ŝel o odpowiedniej wielkości porów,
która zaleŜy od stęŜenia procentowego Ŝelu. Elektroforezę w Ŝelu poliakryloamidowym moŜna
wykonywać wieloma metodami, spośród których bardzo wygodną jest metoda wg Ogita i Markert
[1]. Elektroforezę wykonuje się w układzie dwóch Ŝeli (rozdzielający i zagęszczający) róŜniących
się stęŜeniem procentowym i pH. Zostanie ona zastosowana w opisywanym ćwiczeniu do analizy
porównawczej izoform peroksydazy z koleoptyli owsa.
4
MATERIAŁY I METODY
Sprzęt:
Aparat do elektroforezy (wersja mini), płytki szklane o wymiarach10 x 10 cm, zasilacz stabilizowany (do 150 V).
Odczynniki:
A) Odczynniki do Ŝelu rozdzielającego
Roztwór IA (Akrylamid) – rozpuścić 39 g akrylamidu i 1 g bis-akrylamidu w wodzie, dodać 20 ml glicerolu, całość uzupełnić wodą do 100 ml.
UWAGA: akrylamid jest neurotoksyną wchłanianą przez skórę, dlatego naleŜy unikać kontaktu z
roztworami tego związku i uŜywać rękawiczek lateksowych
•
•
Roztwór IB (0.75 M Tris-HCl) – rozpuścić 9,15 g Trisu w wodzie, dodać 3 ml HCl, całość
uzupełnić wodą do 100 ml.
•
Roztwór IC (0.2 % (w/v) nadsiarczan amonu) – rozpuścić 0,2 g nadsiarczanu amonu w
100 ml wody.
•
Roztwór ID (0.4 % (v/v) TEMED) – 0,4 ml TEMEDu uzupełnić do 100 ml wodą.
B) Odczynniki do Ŝelu zagęszczającego
•
Roztwór IIA (Akrylamid) – rozpuścić 38 g akrylamidu i 2 g bis-akrylamidu w wodzie,
dodać 20 ml glicerolu i uzupełnić wodą do 100 ml.
•
Roztwór IIB (0.75 M Tris –HCl) – rozpuścić 1,5 g Trisu w wodzie, dodać 1 ml HCl i
uzupełnić wodą do 100 ml.
•
Roztwór IIC (0.4 % (w/v) nadsiarczan amonu) – rozpuścić 0.4 g nadsiarczanu amonu w
100 ml wody.
•
Roztwór IID (2.0 % (v/v) TEMED) – 2 ml TEMEDu uzupełnić wodą do 100 ml.
C) Bufor do elektroforezy (pH 8.3) – rozpuścić 1,5 g Trisu i 7,2 g glicyny w 1 L wody.
D) Roztwór do wybarwiania białek – 0,004% błękit brylantowy – rozpuścić 20 mg Coomassie
Brillant Blue G-250 w 500 ml 3,5 % kwasu nadchlorowego z 20 % metanolem.
E) Roztwór odbarwiający – 10% (v/v) kwas octowy
F) Roztwór AEC (3-amino-9-etylokarbazol) do wykrywania aktywności peroksydazy – syntetycznym substratem utlenianym przez peroksydazy w obecności H2O2 moŜe być 3-amino-9etylokarbazol o wzorze:
5
0,1 g AEC rozpuścić w 25 ml dwumetyloformamidu. 3,35 ml roztworu AEC uzupełnić do 50 ml
0.1 M buforem octanowym pH 5,2. Roztwór przesączyć. TuŜ przed reakcją zmieszać 10 ml roztworu AEC i 10 µl 30% nadtlenku wodoru (H2O2).
G) Bufor do homogenizacji tkanki – 50 mM bufor fosforanowy pH 7,0 zawierający 5 mM βmerkaptoetanol (17,5 µl/50 ml buforu)
WYKONANIE
Polimeryzacja Ŝelu
A) Przygotowanie płytek do polimeryzacji Ŝelu: płytki odtłuścić, dokładnie wymyć i wysuszyć.
ZłoŜyć razem 2 płytki (jedna krótsza), uszczelnić i spiąć ściskaczami do papieru. Ustawić pionowo.
Przygotować dwa komplety płytek – jeden do wykrywania aktywności peroksydazy, drugi do wybarwienia białek.
B) Polimeryzacja Ŝelu rozdzielającego 8% – w małej zlewce (25–50 ml) naleŜy zmieszać: 2 ml
roztworu IA, 2,5 ml roztworu IB, 1,25 ml roztworu IC, 1,25 ml roztworu ID i 3 ml wody.
Wszystkie składniki dobrze wymieszać i wlać ostroŜnie między dwie płytki przy pomocy pipety, do wysokości 2,5 – 3 cm od górnej krawędzi krótszej płytki. Na powierzchnię Ŝelu ostroŜnie nawarstwić około 100 µl wody (dostęp tlenu utrudnia polimeryzację) i całość pozostawić
do spolimeryzowania (30 – 40 minut). Usunąć wodę znad spolimeryzowanego Ŝelu przy pomocy bibuły, uwaŜając by nie uszkodzić powierzchni Ŝelu.
C) Polimeryzacja Ŝelu zagęszczającego 4% − w małej zlewce (25–50 ml) naleŜy zmieszać: 0,5
ml roztworu IIA, 1,25 ml roztworu IIB, 0,625 ml roztworu IIC, 0,625 ml roztworu IID i 2 ml
wody. Dokładnie wymieszać składniki i wlać mieszaninę między dwie płytki. OstroŜnie włoŜyć grzebień tak aby nie pozostały pod nim pęcherzyki powietrza, a roztwór wypełnił wycięcia
miedzy zębami. Pozostawić Ŝel do polimeryzacji.
Próby do elektroforezy
A) Homogenizacja tkanki − odwaŜyć po 1 g koleoptyli owsa (etiolowanych oraz naświetlanych),
zamrozić w ciekłym azocie i homogenizować w buforze do homogenizacji w stosunku 1:2 (1g
tkanki:2 ml buforu). Homogenaty odwirować w mikrowirówce przez 5 min.
B) Przygotowanie prób – do oznaczonych probówek Eppendorfa napipetować po 200 µl odpowiedniego supernatantu po wirowaniu, dodać po 25 µl roztworu błękitu bromofenolowego zawierającego glicerol.
6
Elektroforeza
A) Umieszczenie płytek z Ŝelem w aparacie do elektroforezy – po spolimeryzowaniu Ŝelu zagęszczającego ostroŜnie wyjąć grzebień uwaŜając aby powstałe studzienki nie uległy uszkodzeniu.
Płytki z Ŝelem umocować w aparacie tak aby krótsza płytka była skierowana do wewnątrz aparatu. Oba naczynia elektrodowe wypełnić buforem do elektroforezy. Sprawdzić szczelność
aparatu.
B) Nanoszenie prób – oznaczone próby nanosić do kolejnych studzienek, podwarstwiąjąc je przy
uŜyciu pipety automatycznej z kapilarną końcówką
śel do wykrywania aktywności peroksydazy
Studzienka 1 – 5 µl supernatantu z koleoptyli etiolowanych
Studzienka 2 – 10 µl supernatantu z koleoptyli etiolowanych
Studzienka 3 – 5 µl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę
Studzienka 4 – 10 µl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę
śel do wybarwienia białek
Studzienka 1 – 15µl supernatantu z koleoptyli etiolowanych
Studzienka 2 – 30 µl supernatantu z koleoptyli etiolowanych
Studzienka 3 – 15 µl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę
Studzienka 4 – 30 µl supernatantu z koleoptyli naświetlanych przez dobę
C) Warunki elektroforezy – po naniesieniu prób podłączyć aparat do elektroforezy do zasilacza,
włączyć zasilacz i ustawić takie napięcie aby natęŜenie prądu na jedną płytkę wynosiło około
10 mA. Po wniknięciu prób w Ŝel zwiększyć napięcie utrzymując natęŜenie nie przekraczające
20 mA. Elektroforezę naleŜy zakończyć kiedy błękit bromofenolowy znajdzie się około 0,5 cm
od dolnej krawędzi Ŝelu. WYŁĄCZYĆ ZASILACZ.
Wybarwianie białek w Ŝelu
Płytki delikatnie podwaŜyć łopatką i rozdzielić. śel umieścić w kuwecie z roztworem barwiącym.
Po 10 min barwnik zlać do butelki, nadmiar z Ŝelu wypłukać wodą, a następnie zalać 10% kwasem
octowym w celu odbarwienia tła. Zmienić kilka razy roztwór odbarwiający, na koniec przepłukać
wodą.
Lokalizowanie izoform peroksydazy w Ŝelu
Drugi Ŝel umieścić w kuwecie i zalać 50 ml roztworu AEC z nadtlenkiem wodoru. Obserwować
pojawianie się prąŜków zredukowanego substratu. W odpowiednim czasie przerwać reakcję zlewając roztwór AEC i przemywając Ŝel wodą destylowaną.
7
OPRACOWANIE WYNIKÓW
Porównać liczbę i intensywność prąŜków odpowiadających izoformom peroksydazy w ekstrakcie
z koleoptyli etiolowanych i poddanych naświetleniu (analiza zymogramu). Podobnie zanalizować
Ŝel barwiony na białka (proteinogram).
Literatura
[1] Ogita ZI, Markert CL (1979) A miniaturized system for electrophoresis on polyacrylamide
gels. Analytical Biochemistry 99: 233-241.
8